一種用于水稻細胞質鑒定的分子標記方法
【專利摘要】本發明涉及水稻利用領域，具體而言，涉及一種用于水稻細胞質鑒定的分子標記方法。該方法包括：分析比對CW、Lead、Nipponbare和9311的線粒體基因組，篩選出不保守的MS序列；根據MS序列設計相應的分子標記PCR引物；提取不同品種的水稻的總DNA；以總DNA作為模板，以分子標記PCR引物作為引物進行PCR擴增，獲得擴增產物；對擴增產物進行電泳檢測，篩選出能夠導致擴增差異的多態性引物，并獲得利用該多態性引物擴增得到的目的條帶；對利用所述多態性引物擴增獲得的目標條帶進行統計，建立聚類圖，以進行親緣關系分析。本發明提供的用于水稻細胞質鑒定的分子標記方法，操作簡便，所需設備也簡單，結果可靠穩定。
【專利說明】一種用于水稻細胞質鑒定的分子標記方法
【技術領域】
[0001]本發明涉及水稻利用領域，具體而言，涉及一種用于水稻細胞質鑒定的分子標記方法。
【背景技術】 [0002]由于線粒體基因組的重組，導致植物線粒體基因組的序列具有很大的差異，比較分析任何兩個植物物種(甚至是同源物種)的線粒體基因組的基因間區發現，大部分基因間區都不是保守的。因此，植物線粒體基因組存在各自特異的序列(Mitochondrial-specific sequences,簡稱 MS)。
[0003]例如，將小麥Ks3和Km3的線粒體基因組進行比較，只有85.2%的序列為保守序列，Ks3包含11.38%的Km3所沒有的特異序列，與NCBI數據庫比較，7.3% Ks3序列為新序列，其中大部分特異序列位于進化速率快的基因間區。再如，比較Sugar beet TK81-MS和TK81-0線粒體基因組，發現，TK81-MS存在68kb TK81-0沒有的MS，類核、類葉綠體、類線粒體-印isome的MSS分別占7.6%U7.9%,0.1%和4.6%，其余為未知來源。
[0004]目前，水稻已測序完成了 4個線粒體基因組，分別是水稻品種Nipponbare、9311、CW和LD。其中，Nipponbare是一個典型的粳稻品種，9311為典型的秈稻品種；CW細胞質來源于中國普通野生稻Wl (Oryza rufipogon) ；LD細胞質來源于秈稻品種緬甸的Lead水稻。水稻線粒體基因組最大的為CW(559，045bp)，而LD只有434，745bp，同線性分析表明，Nipponbare和9311較為保守,而CW和LD與其他兩個已測序的水稻線粒體基因組在序列組成及排列上差異都很大，即水稻線粒體基因組也存在大量的特異序列(MS)。
[0005]由于不同的水稻種的線粒體基因組存在較大的差異，因此，對于其親緣關系以及進化分析可采用相應的細胞質分子鑒定的方法。
[0006]在相關技術中，對水稻而言，一般米用RFLP分子標記研究其進化分析、未緣關系；然而RFLP分子標記需要進行酶切、凝膠電泳、轉膜以及放射性標記的探針雜交等一系列的操作，整個操作繁瑣復雜、費時耗力。

【發明內容】

[0007]本發明的目的在于提供一種用于水稻細胞質鑒定的分子標記方法，以解決上述的問題。
[0008]在本發明的實施例中提供了一種用于水稻細胞質鑒定的分子標記方法，包括以下步驟:
[0009]分析比對CW、Lead、Nipponbare和9311的線粒體基因組,篩選出不保守的MS序列；
[0010]根據所述MS序列設計相應的分子標記PCR引物；
[0011 ]提取不同品種的水稻的總DNA ；
[0012]以所述總DNA作為模板，以所述分子標記PCR引物作為引物進行PCR擴增，獲得擴增產物；
[0013]對所述擴增產物進行電泳檢測，篩選出能夠導致擴增差異的多態性引物，并獲得利用該多態性引物擴增得到的目的條帶；
[0014]對利用所述多態性引物擴增獲得的目標條帶進行統計，建立聚類圖，以進行親緣關系分析。
[0015]本發明的實施例中提供的用于水稻細胞質鑒定的分子標記方法，其通過分析比對4個已知水稻的線粒體基因組序列，篩選出了不保守的MS序列(多個)，然后再根據所述MS序列設計相應的分子標記PCR引物，每個MS序列對應設置一對分子標記PCR引物。然后再以不同品種的水稻的總DNA為模板，以所述分子標記PCR引物作為引物進行PCR擴增，獲得擴增產物；將擴增產物進行電泳檢測，并篩選出能夠導致擴增差異的多態性引物(對于每一種引物，如果一部分水稻種類能擴增出帶，而另外一部分水稻種類不能擴增出帶，則該引物為多態性引物)以及該多態性引物擴增得到的目的條帶；再對利用所述多態性引物擴增獲得的目標條帶進行統計，建立聚類圖，以進行親緣關系分析，進而獲得不同種類水稻的進化關系。
[0016]與現有技術中常見的RFLP分子標記相比，本發明提供的這種用于水稻細胞質鑒定的分子標記方法，其操作簡便，所需設備也簡單，只需要PCR儀、臺式離心機以及凝膠電泳設備以及相應的分析軟件即可完成整個鑒定操作，常規的分子實驗室可完成整個實驗操作，因此，克服了現有技術中RFLP分子標記操作繁瑣復雜、費時耗力的缺陷。
[0017]另外，由于在水稻線粒體的MS位置區序列，其不易再發生線粒體基因組重組，因此，在本發明的實施例 中，在利用所述MS序列設計相應的分子標記PCR引物以及后續一系列操作開發的本的分子標記，其結果可靠穩定。
[0018]可選的，在所述提取不同品種的水稻的總DNA的步驟中:所述不同品種的水稻包括11種梗稻品種和12種軸稻品種。
[0019]可選的，所述11種粳稻品種具體包括:合系41、農墾58、E5、02428、鹽粳48、武育粳7號、日本晴、遼粳944、中花11、湘晴、千辛124 ；
[0020]所述12種秈稻品種具體包括:南京6號、矮腳南特、特青、93-11、67468、78360、76354、78267、76343、珍汕 97B、楚粳 23A、70928。
[0021]可選的，在所述分析比對CW、Lead、Nipponbare和9311的線粒體基因組,篩選出不保守的MS序列的步驟中，具體包括:
[0022]使用BLAST2軟件分析比對CW、Lead、Nipponbare和9311的線粒體基因組，篩選出55個不保守的MS序列。
[0023]可選的，在所述提取不同品種的水稻的總DNA的步驟中，具體包括:
[0024]取不同品種水稻幼苗2-3克，提取其總DNA。
[0025]可選的，在所述以所述總DNA作為模板，以所述分子標記PCR引物作為引物進行PCR擴增；獲得擴增產物的步驟中；
[0026]所述PCR擴增的反應體系包括:50ng/y I總DNA0.8-1.2 μ 1、10XPCRbuffer0.8-1.2 μ l、25mM MgC120.6_0.9 μ 1、25 μ M dNTP0.3-0.6 μ UlU/μ I Taq 酶0.3-0.6 μ 1、IOpM的分子標記PCR引物0.8-1.2 μ I，去離子無菌水5.2-7.2 μ I。
[0027]可選的，在所述以所述總DNA作為模板，以所述分子標記PCR引物作為引物進行PCR擴增；獲得擴增產物的步驟中；
[0028]所述PCR擴增的反應程序包括:94°C預變性5分鐘、94°C變性I分鐘、55°C退火I分鐘、72 °C延伸I分鐘，循環30次。
[0029]可選的，在所述對所述擴增產物進行電泳檢測，篩選出能夠導致擴增差異的多態性引物，并獲得該多態性引物擴增得到的目的條帶的步驟中:
[0030]所述電泳檢測具體為聚丙烯酰胺凝膠電泳。
[0031]可選的，在所述對利用所述多態性引物擴增獲得的目標條帶進行統計，建立聚類圖，以進行親緣關系分析的步驟中，具體包括:
[0032]對利用所述多態性引物擴增獲得的目標條帶進行統計,利用Numerical Taxonomyand Multivariate Analysis System Versionl.60軟件分析獲得不同水稻之間的相似系數，利用平均距離法以及NTSYS程序運算建立聚類圖，以進行不同水稻之間的親緣關系分析。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0033]圖1示出了本發明實施例一提供的用于水稻細胞質鑒定的分子標記方法的流程圖；
[0034]圖2示出了本發明實施例二中多態性引物M12對23種水稻的PCR擴增產物的電泳圖；
[0035]圖3示出了本發明實施例二中多態性引物M12分別對15株si8和sjl的PCR擴增電泳圖；
[0036]圖4示出了本發明實施例二中24對多態性引物23個水稻品種的UPGMA法聚類圖。【具體實施方式】
[0037]下面通過具體的實施例子并結合附圖對本發明做進一步的詳細描述。
[0038]實施例一
[0039]在本發明的實施例中提供了一種用于水稻細胞質鑒定的分子標記方法，包括以下步驟，請參考圖1:
[0040]步驟101:分析比對CW、Lead、Nipponbare和9311的線粒體基因組,篩選出不保守的MS序列；
[0041]CW、Lead、Nipponbare和9311是目前已經完成線粒體基因組測序的4個水稻品種，9311為典型的秈稻品種,CW細胞質來源于中國普通野生稻Wl (Oryza rufipogon) ,LD細胞質來源于秈稻品種緬甸的Lead水稻，線粒體基因組最大的為CW(559，045bp)，而LD只有434，745bp，同線性分析表明，Nipponbare和9311較為保守，而CW和LD與其他兩個已測序的水稻基因組在序列組成及排列上差異都很大，因此，水稻也存在大量的特異序列(MS)，而通過分析比對這四種水稻的線粒體基因組則可以獲得多個不保守的MS序列。
[0042]步驟102:根據所述MS序列設計相應的分子標記PCR引物；
[0043]在步驟102中，通過得到的多個MS序列，設計相應的分子標記PCR引物，每一個MS序列對應設計一對引物。
[0044]步驟103:提取不同品種的水稻的總DNA ；[0045]在該步驟中，提取需要鑒定的不同種類水稻的總DNA，備用。具體的，提取總DNA的方法采用冷泉港實驗室出版社(Cold Spring Harbor Laboratory Press)出版、NinaIrwin和Kaaren A.Janssen編著的《分子克隆》中所記載的植物核酸的提取方法。
[0046]步驟104:以所述總DNA作為模板，以所述分子標記PCR引物作為引物進行PCR擴增，獲得擴增產物；
[0047]得到不同種類水稻的總DNA之后，將其作為模板，分別用設計好的分子標記PCR引物逐個進行擴增，獲得擴增產物。
[0048]步驟105:對所述擴增產物進行電泳檢測，篩選出能夠導致擴增差異的多態性引物，并獲得利用該多態性引物擴增得到的目的條帶；[0049]在該步驟中，較為關鍵的，不同的分子標記PCR引物對多個水稻品種的擴增可能會出現不同的結果，通常情況下，一對引物對所選所有水稻品種而言，可能會初選，全部擴增出條帶或者全部不能擴增出條帶的結果，說明該引物不能在所選水稻品種中擴增出差異，相反，如果對于一種引物而言，部分水稻能夠產生擴增條帶，而部分水稻不能產生擴增條帶，說明該引物能在所選水稻品種中擴增出差異，因此是多態性引物。
[0050]步驟106:對利用所述多態性引物擴增獲得的目標條帶進行統計，建立聚類圖，以進行親緣關系分析。
[0051]得到多態性引物之后，檢測所有多態性引物對所有水稻品種的擴增條帶，通過分析軟件進行聚類分析，建立聚類圖，并進行親緣關系分析。
[0052]綜上，本發明的實施例中提供的用于水稻細胞質鑒定的分子標記方法，其通過分析比對4個已知水稻的線粒體基因組序列，篩選出了不保守的MS序列(多個)，然后再根據所述MS序列設計相應的分子標記PCR引物，每個MS序列對應設置一對分子標記PCR引物。然后再以不同品種的水稻的總DNA為模板，以所述分子標記PCR引物作為引物進行PCR擴增，獲得擴增產物；將擴增產物進行電泳檢測，并篩選出能夠導致擴增差異的多態性引物(對于每一種引物，如果一部分水稻種類能擴增出帶，而另外一部分水稻種類不能擴增出帶，則該引物為多態性引物)以及該多態性引物擴增得到的目的條帶；再對利用所述多態性引物擴增獲得的目標條帶進行統計，建立聚類圖，以進行親緣關系分析，進而獲得不同種類水稻的進化關系。
[0053]與現有技術中常見的RFLP分子標記相比，本發明提供的這種用于水稻細胞質鑒定的分子標記方法，其操作簡便，所需設備也簡單，只需要PCR儀、臺式離心機以及凝膠電泳設備以及相應的分析軟件即可完成整個鑒定操作，常規的分子實驗室可完成整個實驗操作，因此，克服了現有技術中RFLP分子標記操作繁瑣復雜、費時耗力的缺陷。
[0054]另外，由于在水稻線粒體的MS位置區序列，其不易再發生線粒體基因組重組，因此，在本發明的實施例中，在利用所述MS序列設計相應的分子標記PCR引物以及后續一系列操作開發的本的分子標記，其結果可靠穩定。
[0055]接下來，為了使得本發明實施例一的用于水稻細胞質鑒定的分子標記方法得到更好的應用，本發明還在上述實施例一的基礎之上提供了實施例二，實施例二是實施例一的用于水稻細胞質鑒定的分子標記方法的進一步限定和增加，現做詳細的闡述和解釋，請參考圖1-圖4:
[0056]實施例二[0057]本實施例的用于水稻細胞質鑒定的分子標記方法包括以下步驟:
[0058]1、分析比對CW、Lead、Nipponbare和9311的線粒體基因組,篩選出不保守的MS序列；
[0059]在該步驟中，具體的，使用BLAST2軟件分析比對CW、Lead、Nipponbare和9311的線粒體基因組，篩選出55個不保守的MS序列。
[0060]BLAST2軟件對于不同品種水稻的線粒體基因組比對結果準確，并且55個不保守的MS序列可以保證相應引物的數量，進而提高了后續擴增呈現高多態性的幾率。
[0061]2、根據所述MS序列設計相應的分子標記PCR引物；
[0062]上述步驟與實施例一的步驟101-102相同，在此不作贅述。
[0063]3、提取11種粳稻品種和12種秈稻品種的總DNA ；
[0064]更具體的，在該步驟中，所述11種粳稻品種具體包括:合系41、農墾58、E5、02428、鹽粳48、武育粳7號、日本晴、遼粳944、中花11、湘晴、千辛124 ；
[0065]所述12種秈稻品種具體包括:南京6號、矮腳南特、特青、93-11、67468、78360、76354、78267、76343、珍汕 97B、楚粳 23A、70928。
[0066]需要指出的是，93-11、67468、78360、76354、78267、76343和 70928 是指國際水稻
研究所登記的不同水稻種所對應的編號。
[0067]具體的，在本實施例中，供試水稻其編號和品種名或國際水稻研究所(IRRI)編號的關系請參考下表:
[0068]表1供試水稻品種
【權利要求】
1.一種用于水稻細胞質鑒定的分子標記方法，其特征在于，包括以下步驟: 分析比對CW、Lead、Nipponbare和9311的線粒體基因組,篩選出不保守的MS序列； 根據所述MS序列設計相應的分子標記PCR引物； 提取不同品種的水稻的總DNA ； 以所述總DNA作為模板，以所述分子標記PCR引物作為引物進行PCR擴增，獲得擴增產物； 對所述擴增產物進行電泳檢測，篩選出能夠導致擴增差異的多態性引物，并獲得利用該多態性引物擴增得到的目的條帶； 對利用所述多態性引物擴增獲得的目標條帶進行統計，建立聚類圖，以進行親緣關系分析。
2.根據權利要求1所述的用于水稻細胞質鑒定的分子標記方法，其特征在于，在所述提取不同品種的水稻的總DNA的步驟中: 所述不冋品種的水稻包括11種梗稻品種和12種軸稻品種。
3.根據權利要求2所述的用于水稻細胞質鑒定的分子標記方法，其特征在于， 所述11種粳稻品種具體包括:合系41、農墾58、E5、02428、鹽粳48、武育粳7號、日本晴、遼粳944、中花11、湘晴、千辛124 ； 所述12種秈稻品種具體包括:南京6號、矮腳南特、特青、93-11、67468、78360、76354、78267、76343、珍汕 97B、楚粳 23A、70928。
4.根據權利要求1所述的用于水稻細胞質鑒定的分子標記方法，其特征在于，在所述分析比對CW、Lead、Nipponbare和9311的線粒體基因組,篩選出不保守的MS序列的步驟中，具體包括: 使用BLAST2軟件分析比對CW、Lead、Nipponbare和9311的線粒體基因組，篩選出55個不保守的MS序列。
5.根據權利要求1所述的用于水稻細胞質鑒定的分子標記方法，其特征在于，在所述提取不同品種的水稻的總DNA的步驟中，具體包括: 取不同品種水稻幼苗2-3克，提取其總DNA。
6.根據權利要求1-5任一項所述的用于水稻細胞質鑒定的分子標記方法，其特征在于，在所述以所述總DNA作為模板，以所述分子標記PCR引物作為引物進行PCR擴增，獲得擴增產物的步驟中； 所述PCR擴增的反應體系包括:50ng/y I總DNA0.8-1.2μ 1U0XPCRbuffer0.8-1.2 μ l、25mM MgCl20.6-0.9 μ 1,25 μ M dNTP0.3_0.6 μ 1、IU/μ I Taq 酶0.3-0.6 μ 1、IOpM的分子標記PCR引物0.8-1.2 μ I，去離子無菌水5.2-7.2 μ I。
7.根據權利要求6所述的用于水稻細胞質鑒定的分子標記方法，其特征在于，在所述以所述總DNA作為模板，以所述分子標記PCR引物作為引物進行PCR擴增，獲得擴增產物的步驟中； 所述PCR擴增的反應程序包括:94°C預變性5分鐘、94°C變性I分鐘、55°C退火I分鐘、72°C延伸I分鐘，循環30次。
8.根據權利要求7所述的用于水稻細胞質鑒定的分子標記方法，其特征在于，在所述對所述擴增產物進行電泳檢測，篩選出能夠導致擴增差異的多態性引物，并獲得該多態性引物擴增得到的目的條帶的步驟中: 所述電泳檢測具體為瓊脂糖凝膠電泳。
9.根據權利要求8所述的用于水稻細胞質鑒定的分子標記方法，其特征在于，在所述對利用所述多態性引物擴增獲得的目標條帶進行統計，建立聚類圖，以進行親緣關系分析的步驟中，具體包括: 對利用所述多態性引物擴增獲得的目標條帶進行統計，利用Numerical Taxonomy andMultivariate Analysis System Versionl.60軟件分析獲得不同水稻之間的相似系數,利用平均距離法以及NTSYS程序運算建立聚類圖，以進行不同水稻之間的親緣關系分析。
【文檔編號】C12Q1/68GK103924003SQ201410190312
【公開日】2014年7月16日 申請日期:2014年5月7日 優先權日:2014年5月7日
【發明者】謝紅衛, 錢明娟, 蔡耀輝, 顏滿蓮, 毛凌華, 李永輝, 聶元元, 顏龍安 申請人:江西省超級水稻研究發展中心