一種促進重組蛋白胞外分泌的發酵工藝的制作方法
【專利摘要】本發明公開了一種促進重組蛋白胞外分泌的發酵工藝，屬于發酵工程【技術領域】。本發明以含有重組蛋白基因的大腸桿菌為生產菌株，在工業級發酵培養基中連續流加甘油進行分批補料發酵，對數生長期開始流加乳糖進行誘導產酶，在發酵過程中流加甘氨酸促進重組蛋白的胞外分泌。采取本策略進行發酵實現了重組蛋白的高效胞外表達，大幅提高了重組蛋白的生產強度。本工藝采用工業上常用的甘油、蛋白胨、酵母粉、無機鹽等原料進行生產，簡單易行，適于大規模生產。
【專利說明】一種促進重組蛋白胞外分泌的發酵工藝
【技術領域】
[0001] 本發明屬于發酵工程【技術領域】，本發明涉及一種促進重組蛋白高效胞外表達的發酵生產方法。
【背景技術】
[0002]大腸桿菌作為一種的宿主菌，憑借遺傳背景清晰，培養條件簡單，生長周期短，表達效率高等優勢廣泛應用于重組蛋白的高效制備。根據最終定位方式，采用大腸桿菌表達系統表達外源蛋白有三種形式:胞內表達、周質表達以及胞外基質表達。相比胞內和周質有限的空間，胞外空間更廣闊，更有利于重組蛋白的大量積累。此外，將重組蛋白分泌至胞外，無需破碎細胞或周質釋放即可收集產品，而且不會因為細胞破碎引入大量雜蛋白，極大地簡化了下游純化步驟。由于大腸桿菌特殊的雙層細胞膜結構嚴重阻礙重組蛋白的胞外分泌，導致其在工業上的應用受到限制，并且大大增加生產成本。因此，促進重組蛋白的胞外分泌具有很重要的工業意義。
[0003]本發明選取三種重要的工業用酶普魯蘭酶，α-環糊精葡萄糖基轉移酶(簡稱a-CGT酶)和角質酶作為報告蛋白。普魯蘭酶是一種能夠水解普魯蘭多糖、支鏈淀粉、α-極限糊精等分子中的α-1，6葡萄糖苷鍵的淀粉脫支酶。由于普魯蘭酶可以切斷淀粉中的分支點，縮短反應時間，提高淀粉的轉化率，廣泛應用于生產葡萄糖、果糖、麥芽糖、麥芽糊精、低聚糖等產品。a-CGT酶是糖基水解酶α-淀粉酶家族的重要成員，它能夠通過環化反應將淀粉或淀粉類底物轉化為α-環糊精。α-環糊精在食品、分子識別和納米材料等領域的廣泛應用。角質酶是一種多功能酶，能夠催化各類聚酯、不溶性的甘油三酯和小分子可溶性酯類物質的水解反應，多種酸和醇的酯化反應以及酯和醇的酯交換反應，在紡織、洗滌劑、酯合成以及環保等諸多領域具有廣泛的應用前景。

【發明內容】

[0004]本發明提供一種促進重組蛋白胞外分泌的發酵工藝，以解決現有發酵工藝中胞外酶活較低、生產成本高的問題。
[0005]為解決上述問題，本發明的技術方案如下:
[0006]一種促進重組蛋白胞外分泌的發酵工藝，以含有重組蛋白基因的E.coliBL21(DE3)為生產菌種，具體過程如下:
[0007](I)種子制備:將_80°C甘油管保存的菌株接入種子培養基中，使用回轉恒溫調速搖床進行培養，控制轉速200rpm/min，培養溫度37°C，初始pH值7.10，培養時間8_10小時。
[0008](2)發酵工藝:將種子培養液接種入發酵培養基中，通過控制攪拌轉速和通風量使溶氧維持20-30 %，控制溫度為37 ± I °C，流加質量濃度為25 %的氨水控制pH7.0 ±0.5，培養6-7小時，待溶氧快速上升至80-100%，以指數流加的方式補加補料液并調節轉速及通風使溶氧維持在20-30%，發酵培養28-32小時。
[0009](3)甘油補料:發酵培養進行到6-8小時后,通過補加500g/L的甘油補料液,使發酵液中甘油濃度維持在l_5g/L ；
[0010](4)甘氨酸補料:發酵培養10-15小時(OD6tltl為10-20)后，以l_2g/L/h的流速加Λ 200g/L甘氨酸溶液。
[0011](6)乳糖誘導:發酵培養15-20小時，菌體吸光度0D_達到20-50時，降溫至25-30°C，以0.2-2g/L/h的流速加入200g/L乳糖溶液進行誘導產酶。誘導25-30小時左右。
[0012]所述種子培養基的組成為(g/L):工業級蛋白胨10，工業級酵母粉5，NaCllO,pH7.10。接種前添加100mg/L氨節青霉素。
[0013]所述發酵培養基的組成為(g/L):甘油6，工業級蛋白胨12，工業級酵母粉24，KH2P042.31，K2HPO4.3H2016.43，微量元素液10mL/L。接種前添加100mg/L氨芐青霉素。
[0014]所述微量元素液為(g/L)=FeSO4.7H2010，ZnSO4.7Η202.25，CuSO4.5Η201.0，MnSO4.4Η200.5，Na2B4O7.IOH2O0.23，CaCl22.0, (NH4)6Mo7O240.1。
[0015]所述補料液為(g/L):甘油500，MgSO4.7H2020，蛋白胨15，酵母粉30。
[0016]所述甘油補料液質量分數為50% (500g/L);甘油含量的測定方法采用HPLC:Zorbax Extend_C18 (4.6mmX 250mm, 5 μ m),柱溫 35°C，進樣量:10 μ L,不差折光檢測器溫度:35°C,流速:1.0mL/min，流動相:純水；發酵培養4小時后，每隔I小時,對發酵液中甘油濃度進行一次測定 ，根據測定結果加入一定體積的補料液，使發酵液中甘油濃度維持在
l-5g/L。
[0017]本發明采用流加甘氨酸工藝以及誘導控制工藝結合其它發酵控制工藝(如:分段控溫發酵工藝、恒定溶氧控制工 藝、PH控制工藝、補料分批發酵控制工藝)，使得大腸桿菌細胞膜通透性提高，促進目標蛋白的胞外基質分泌。
【具體實施方式】
[0018]實施例1
[0019]以本實驗室構建的重組大腸桿菌pulB/pET20b(+)/BL21 (DE3)為生產菌種(一種通過促進活性蛋白聚集體解聚提高淀粉脫支酶產量的方法.CN201210035298.0)。
[0020]1、種子培養:將_80°C甘油管保存的菌種接入種子培養基(工業級蛋白胨10g/L，工業級酵母粉5g/L，NaC110g/L，氨芐青霉素100mg/L，pH7.10)中，使用恒溫搖床進行培養:轉速200rpm/min，溫度37°C，培養8小時。
[0021]2、發酵產酶:
[0022]分批發酵階段:將種子液以8%接種量接入發酵培養基(甘油6g/L，工業級蛋白胨12g/L，工業級酵母粉 24g/L，KH2P042.31g/L，K2HPO4.3H2016.43g/L，微量元素液 10mL/L，氨芐青霉素100mg/L)，通過控制攪拌轉速和通風量使溶氧維持30%，控制溫度為37°C，流加質量濃度為25%的氨水控制pH7.0，培養6-7小時；
[0023]補料發酵階段:待溶氧上升至80-100%，批式培養結束后，以指數流加的方式補加以甘油為碳源的補料液(甘油500g/L，MgSO4.7Η202(^/1，蛋白胨15g/L，酵母粉30g/L)，使菌體以0.2h-1的比生長速率進行生長，控制溫度37 °C，溶氧維持在30%，通過質量濃度為25%的氨水控制ρΗ7.0 ;
[0024]誘導培養階段:當菌體0D_達到50時，將溫度降為25 °C，溶氧維持在30%，以0.8g/L/h的流速連續補加200g/L乳糖溶液。同時溶氧控制在20-30%，控制pH7.0±0.5，誘導25小時左右，胞外普魯蘭酶活力為66U/mL。
[0025]實施例2
[0026]具體過程如下:本實驗室構建的重組大腸桿菌pulB/pET20b (+) /BL21 (DE3)為生產菌種(一種通過促進活性蛋白聚集體解聚提高淀粉脫支酶產量的方法.CN201210035298.0)。
[0027]1、種子培養:將_80°C甘油管保存的菌種接入種子培養基(工業級蛋白胨10g/L，工業級酵母粉5g/L，NaC110g/L，氨芐青霉素100mg/L，pH7.10)中，使用恒溫搖床進行培養:轉速200rpm/min，溫度37°C，培養8小時。
[0028]2、發酵產酶:
[0029]分批發酵階段:將種子液以8%接種量接入發酵培養基(甘油6g/L，工業級蛋白胨12g/L，工業級酵母粉 24g/L，KH2P042.31g/L，K2HPO4.3H2016.43g/L，微量元素液 10mL/L，氨芐青霉素100mg/L)，通過控制攪拌轉速和通風量使溶氧維持30%，控制溫度為37°C，流加質量濃度為25%的氨水控制pH7.0，培養6-7小時；
[0030]補料發酵階 段:待溶氧上升至80-100%，批式培養結束后，以指數流加的方式補加以甘油為碳源的補料液(甘油500g/L，MgSO4.7Η202(^/1，蛋白胨15g/L，酵母粉30g/L)，使菌體以0.2h-1的比生長速率進行生長，控制溫度37 °C，溶氧維持在30%，通過質量濃度為25%的氨水控制pH7.0，當菌體0D_達到10時，以l_2g/L/h的流速連續補加200g/L甘氨酸溶液；
[0031]誘導培養階段:當菌體0D_達到20時，將溫度降為25°C，溶氧維持在30%，以0.4g/L/h的流速連續補加200g/L乳糖溶液。同時溶氧控制在20-30%，控制pH7.0±0.5，誘導25小時左右，胞外普魯蘭酶活力為1568U/mL。
[0032]實施例3
[0033]以本實驗室構建的重組大腸桿菌a -cgt/pET20b (+)/BL21 (DE3)為生產菌種(一種α -環糊精葡萄糖基轉移酶基因的克隆與表達.CN200810024162.3)。
[0034]1、種子培養:將_80°C甘油管保存的菌種接入種子培養基(工業級蛋白胨10g/L，工業級酵母粉5g/L，NaC110g/L，氨芐青霉素100mg/L，pH7.10)中，使用恒溫搖床進行培養:轉速200rpm/min，溫度37°C，培養8小時。
[0035]2、發酵產酶:
[0036]分批發酵階段:將種子液以8%接種量接入發酵培養基(甘油6g/L，工業級蛋白胨12g/L，工業級酵母粉 24g/L，KH2P042.31g/L，K2HPO4.3H2016.43g/L，微量元素液 10mL/L，氨芐青霉素100mg/L)，通過控制攪拌轉速和通風量使溶氧維持30%，控制溫度為37°C，流加質量濃度為25%的氨水控制pH7.0，培養6-7小時；
[0037]補料發酵階段:待溶氧上升至80-100%，批式培養結束后，以指數流加的方式補加以甘油為碳源的補料液(甘油500g/L，MgSO4.7Η202(^/1，蛋白胨15g/L，酵母粉30g/L)，使菌體以0.2h-1的比生長速率進行生長，控制溫度37 °C，溶氧維持在30%，通過質量濃度為25%的氨水控制ρΗ7.0 ;
[0038]誘導培養階段:當菌體0D_達到50時，將溫度降為25°C，溶氧維持在30%，以0.8g/L/h的流速連續補加200g/L乳糖溶液。同時溶氧控制在20-30%，控制pH7.0±0.5，誘導25小時左右，胞外a -CGT酶活力為23U/mL。[0039]實施例4
[0040]以本實驗室構建的重組大腸桿菌a -cgt/pET20b (+) /BL21 (DE3)為生產菌種(一種α -環糊精葡萄糖基轉移酶基因的克隆與表達.CN200810024162.3)。
[0041]1、種子培養:將_80°C甘油管保存的菌種接入種子培養基(工業級蛋白胨10g/L，工業級酵母粉5g/L，NaC110g/L，氨芐青霉素100mg/L，pH7.10)中，使用恒溫搖床進行培養:轉速200rpm/min，溫度37°C，培養8小時。
[0042]2、發酵產酶:
[0043]分批發酵階段:將種子液以8%接種量接入發酵培養基(甘油6g/L，工業級蛋白胨12g/L，工業級酵母粉 24g/L，KH2P042.31g/L，K2HPO4.3H2016.43g/L，微量元素液 10mL/L，氨芐青霉素100mg/L)，通過控制攪拌轉速和通風量使溶氧維持30%，控制溫度為37°C，流加質量濃度為25%的氨水控制pH7.0，培養6-7小時；
[0044]補料發酵階段:待溶氧上升至80-100%，批式培養結束后，以指數流加的方式補加以甘油為碳源的補料液(甘油500g/L，MgSO4.7Η202(^/1，蛋白胨15g/L，酵母粉30g/L)，使菌體以0.2h-1的比生長速率進行生長，控制溫度37 °C，溶氧維持在30%，通過質量濃度為25%的氨水控制pH7.0，當菌體0D_達到10時，以l_2g/L/h的流速連續補加200g/L甘氨酸溶液；
[0045]誘導培養階段:當菌體0D_達到20時，將溫度降為25°C，溶氧維持在30%，以0.4g/L/h的流速連續 補加200g/L乳糖溶液。同時溶氧控制在20-30%，控制pH7.0±0.5，誘導25小時左右，胞外a -CGT酶活力為128U/mL。
[0046]實施例5
[0047]以本實驗室構建的重組大腸桿菌Tfu_0883/pET20b(+)/BL21(DE3)為生產菌種(The journal of biological chemistry.2008,283(38):25854-25862)。
[0048]1、種子培養:將_80°C甘油管保存的菌種接入種子培養基(工業級蛋白胨10g/L，工業級酵母粉5g/L，NaC110g/L，氨芐青霉素100mg/L，pH7.10)中，使用恒溫搖床進行培養:轉速200rpm/min，溫度37°C，培養8小時。
[0049]2、發酵產酶:
[0050]分批發酵階段:將種子液以8%接種量接入發酵培養基(甘油6g/L，工業級蛋白胨12g/L，工業級酵母粉 24g/L，KH2P042.31g/L，K2HPO4.3H2016.43g/L，微量元素液 10mL/L，氨芐青霉素100mg/L)，通過控制攪拌轉速和通風量使溶氧維持30%，控制溫度為37°C，流加質量濃度為25%的氨水控制pH7.0，培養6-7小時；
[0051]補料發酵階段:待溶氧上升至80-100%，批式培養結束后，以指數流加的方式補加以甘油為碳源的補料液(甘油500g/L，MgSO4.7Η202(^/1，蛋白胨15g/L，酵母粉30g/L)，使菌體以0.2h-1的比生長速率進行生長，控制溫度37 °C，溶氧維持在30%，通過質量濃度為25%的氨水控制ρΗ7.0 ;
[0052]誘導培養階段:當菌體0D_達到50時，將溫度降為25°C，溶氧維持在30%，以
0.8g/L/h的流速連續補加200g/L乳糖溶液。同時溶氧控制在20-30%，控制pH7.0±0.5，誘導25小時左右，胞外角質酶活力為31U/mL。
[0053]實施例6
[0054]以本實驗室構建的重組大腸桿菌Tfu_0883/pET20b(+)/BL21(DE3)為生產菌種(The journal of biological chemistry.2008,283(38):25854-25862)。
[0055]1、種子培養:將_80°C甘油管保存的菌種接入種子培養基(工業級蛋白胨10g/L，工業級酵母粉5g/L，NaC110g/L，氨芐青霉素100mg/L，pH7.10)中，使用恒溫搖床進行培養:轉速200rpm/min，溫度37°C，培養8小時。
[0056]2、發酵產酶:
[0057]分批發酵階段:將種子液以8%接種量接入發酵培養基(甘油6g/L，工業級蛋白胨12g/L，工業級酵母粉 24g/L，KH2P042.31g/L，K2HPO4.3H2016.43g/L，微量元素液 10mL/L，氨芐青霉素100mg/L)，通過控制攪拌轉速和通風量使溶氧維持30%，控制溫度為37°C，流加質量濃度為25%的氨水控制pH7.0，培養6-7小時；
[0058]補料發酵階段:待溶氧上升至80-100%，批式培養結束后，以指數流加的方式補加以甘油為碳源的補料液(甘油500g/L，MgSO4.7Η202(^/1，蛋白胨15g/L，酵母粉30g/L)，使菌體以0.2H-1的比生長速率進行生長，控制溫度37 °C，溶氧維持在30%，通過質量濃度為25%的氨水控制pH7.0，當菌體0D _達到10時，以l_2g/L/h的流速連續補加200g/L甘氨酸溶液；
[0059]誘導培養階段:當菌體0D_達到20時，將溫度降為25°C，溶氧維持在30%，以
0.4g/L/h的流速連續補加200g/L乳糖溶液。同時溶氧控制在20-30%，控制pH7.0±0.5，誘導25小時左右，胞外角質酶活力為185U/mL。
【權利要求】
1.一種提高重組蛋白的胞外生產方法，其特征在于以含有目標蛋白基因的大腸桿菌為生產菌株，發酵工藝如下: 將活化后的種子培養液接入發酵培養基中，通過控制攪拌轉速和通風量使溶氧維持20-30%，控制溫度為25-37°C，流加氨水控制pH7.0±0.5，培養6_7小時； 當溶氧快速上升至80-100%，以指數流加的方式補加補料液使溶氧維持在20-30%，溫度維持在25-37°C，流加氨水控制pH7.0±0.5。當菌體生長到一定OD6tltl時，添加適量的甘氨酸溶液；繼續培養至菌體達到一定OD6tltl時，添加適量的乳糖溶液進行誘導；同時溶氧控制在20-30%，控制ρΗ7.0±0.5，誘導20-30小時。
2.權利要求1所述的方法，其特征在于，所述宿主大腸桿菌為Ε.coli BL21(DE3)、E.coli W3110.E.coli JM109、E.coli JM109 (DE3)、E.coli DH5 α 中任意一種。
3.權利要求2所述的方法，其特征在于，所述宿主大腸桿菌為E.coliBL21(DE3)。
4.根據權利要求1所述的方法，其特征在于所述甘氨酸的添加方式為一次性添加，分批添加或者連續添加。
5.根據權利要求4所述的方法，其特征在于所述甘氨酸的添加方式為連續添加，添加速度為 0.01-10g/L/h。
6.根據權利要求1所 述的方法，其特征在于所述開始添加甘氨酸的時機為0D_達到0-50。
7.根據權利要求1所述的方法，其特征在于所述乳糖的添加方式為一次性添加，分批添加或者連續添加。
8.根據權利要求7所述的方法，其特征在于所述乳糖的添加方式為連續添加，添加速度為 0.01-10g/L/h。
9.根據權利要求1所述的方法，其特征在于所述開始流加乳糖的時機為0D_達到10-50。
10.根據權利要求1所述的方法，其特征在于種子活化用培養基的組成為(g/L):工業級蛋白胨10，工業級酵母粉5，NaCllO, pH7.10。發酵培養基的組成為(g/L):甘油6，工業級蛋白胨12，工業級酵母粉24，KH2P042.31，K2HPO4.3H2016.43，微量元素液10mL/L。
【文檔編號】C12R1/19GK103981163SQ201410208207
【公開日】2014年8月13日 申請日期:2014年5月13日 優先權日:2014年5月13日
【發明者】吳敬, 鄒純, 段緒果 申請人:江南大學