專利名稱：Bcl-2蛋白表達(dá)劑、細(xì)胞凋亡抑制劑和表皮細(xì)胞的紫外線dna損傷防止劑的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及皮膚等細(xì)胞中BCL-2蛋白表達(dá)劑、細(xì)胞凋亡抑制劑和表皮細(xì)胞的紫外 線DNA損傷防止劑。
背景技術(shù)：
甘草是眾所周知的一種生藥，其被用作藥用或甜味劑原料，也可以作為化妝品等 皮膚外用劑的成分使用。而且，已知用水或醇水溶液等水性溶劑提取的甘草葉的提取物具 有促進(jìn)皮膚的成纖維細(xì)胞的骨膠原產(chǎn)生的作用。
通過這種作用，甘草提取物促進(jìn)真皮中產(chǎn)生纖維狀骨膠原，保持皮膚張力，并通過 骨膠原維持水分保持機(jī)制，從而防止皮膚的老化(專利文獻(xiàn)1)。
此外，還已知，甘草提取物抑制皮膚中由于紫外線損傷而生成的黑色素，促進(jìn)黑色 素的排泄，作為這種甘草提取物，已知有用水提取過濾甘草的根和根莖，將分取的水中不溶 的水提取殘?jiān)鳛樵希栽撘掖继崛∥镒鳛橛行С煞质褂玫钠つw化妝品(專利文獻(xiàn)2)。
此外，作為本申請(qǐng)的發(fā)明者的現(xiàn)有技術(shù)，已知有，通過純化提高甘草中所含美白成 分的純度，尤其是精選甘草甙以外的美白成分，即通過酪氨酸酶抑制活性以外的作用提高 美白效果的美白性皮膚外用劑(專利文獻(xiàn)3)。
可是，皮膚的其它的細(xì)胞死亡的細(xì)胞凋亡，如也被稱為程序性細(xì)胞死亡一樣，與壞 死不同，是各種疾病的成因，是使疾病的癥狀進(jìn)展的生命現(xiàn)象。因此，迫切期望用于調(diào)整伴 隨疾病的細(xì)胞凋亡的技術(shù)，還要開發(fā)藥物。
例如，眾所周知的是，在癌癥疾病的治療等中，在對(duì)皮膚照射放射線時(shí)，或在含紫 外線強(qiáng)的太陽光線日常性照射皮膚時(shí)，在正常細(xì)胞中的也誘導(dǎo)出細(xì)胞凋亡。
由于考慮到如果可以抑制這種正常細(xì)胞和疾病組織的細(xì)胞的細(xì)胞凋亡，不僅對(duì)于 治療效果而且對(duì)于日常的防紫外線對(duì)策都有利，因此人們進(jìn)行了對(duì)細(xì)胞凋亡抑制劑的開 發(fā)。
作為抑制細(xì)胞凋亡的基因，可以列舉BCL-xL、BCL_2、BCL-w、IAP等。
這其中，BCL-2基因位于染色體18q21. 3，由于最初發(fā)現(xiàn)于濾泡性淋巴瘤(Bcell lymphoma/leukemia)，因此命名為“BCL”，該基因編碼的約^kD的蛋白被稱為“BCL-2蛋白”。
BCL-2蛋白被表達(dá)于細(xì)胞質(zhì)(包括核膜周圍)中，在正常細(xì)胞中，存在于線粒體 的外膜表面，起細(xì)胞凋亡抑制因子的作用，尤其是存在腫瘤細(xì)胞等異常時(shí)，甚至在正常細(xì)胞 中，在神經(jīng)系統(tǒng)、腸粘膜、表皮基底層等中都被發(fā)現(xiàn)有該蛋白。
此外，已知的是BCL-2基因是色素干細(xì)胞的維持所必需的基因，其缺損導(dǎo)致毛發(fā) 變白。即，毛囊的色素干細(xì)胞，與生成黑色素的已成熟的色素細(xì)胞一起成長，然而根據(jù)BCL-2 缺損小鼠的實(shí)驗(yàn)結(jié)果，經(jīng)過發(fā)育，局部存在于微環(huán)境中的成黑色素細(xì)胞在作為色素干細(xì)胞 進(jìn)入到休眠狀態(tài)的瞬間，BCL-2基因?qū)τ谏媸潜匦璧摹?br> 而且，還已知，在BCL-2基因缺損小鼠中，還發(fā)現(xiàn)以黑色素細(xì)胞的細(xì)胞凋亡引起的 體毛的白色化為代表，在神經(jīng)系統(tǒng)、淋巴細(xì)胞、小腸等各種組織中的細(xì)胞凋亡的亢進(jìn)，腎功 能衰竭等癥狀，人們了解了 BCL-2的功能對(duì)于這些組織和細(xì)胞的維持十分重要(專利文獻(xiàn) 4)。
此外，BCL-2在身體的許多組織中被正常表達(dá)，因此起著維持長命細(xì)胞生存的 生理學(xué)功能。已知，在生存被BCL-2調(diào)節(jié)的細(xì)胞的類型中，有在免疫化期間形成的“記憶 (memory)”、成為淋巴細(xì)胞、控制腦內(nèi)和肌肉和器官功能的末梢神經(jīng)內(nèi)的多種類型的神經(jīng) 元、骨髓細(xì)胞、存在于皮膚、胃腸管內(nèi)側(cè)的吸收細(xì)胞的干細(xì)胞(專利文獻(xiàn)5)。
專利文獻(xiàn)1 特開2000-191498號(hào)公報(bào)(權(quán)利要求1)
專利文獻(xiàn)2 特開平10-194959號(hào)公報(bào)(段落0005、段落0014)
專利文獻(xiàn)3 特開2006-(^8157號(hào)公報(bào)(段落0016)
專利文獻(xiàn)4 特開2002-080382號(hào)公報(bào)
專利文獻(xiàn)5 特開2003-176236號(hào)公報(bào)發(fā)明內(nèi)容
但是，就上述的BCL-2蛋白的表達(dá)性或細(xì)胞凋亡的抑制性而言，并沒有關(guān)于前述 甘草提取物的相關(guān)認(rèn)識(shí)，專利文獻(xiàn)1 3中所認(rèn)識(shí)到的美白作用和老化防止作用與由于 BCL-2蛋白的表達(dá)(以下，有時(shí)也簡稱BCL-2的表達(dá)、或BCL-2表達(dá))而引起的抗細(xì)胞凋亡 性作用不同，是由于對(duì)活細(xì)胞的骨膠原產(chǎn)生的促進(jìn)和抑制黑色素產(chǎn)生的作用而引起的。
作為這種甘草的水性溶劑提取物的利用技術(shù)，存在以下問題，即還沒有技術(shù)上確 立被紫外線等損傷的表皮細(xì)胞的BCL-2蛋白的表達(dá)性和異常細(xì)胞凋亡的抑制。
因此，本發(fā)明的課題在于，解決上述問題，制成使細(xì)胞的BCL-2蛋白的表達(dá)增強(qiáng)， 并抑制具有被紫外線等直接或間接損傷的DNA的細(xì)胞的細(xì)胞凋亡，還可以提高細(xì)胞的組織 修復(fù)性在各種藥劑中添加，并可以期待有廣泛應(yīng)用的BCL-2蛋白表達(dá)劑，制成細(xì)胞凋亡抑 制劑和表皮細(xì)胞的紫外線DNA損傷防止劑。
本發(fā)明的BCL-2蛋白表達(dá)劑和細(xì)胞凋亡抑制劑是通過如下完成的，S卩，本申請(qǐng)的 發(fā)明人分別發(fā)現(xiàn)了表皮細(xì)胞的增殖性(PCNA)、BCL-2的表達(dá)、表皮細(xì)胞的細(xì)胞凋亡抑制性， 并基于后述實(shí)驗(yàn)方法和結(jié)果發(fā)現(xiàn)如下性質(zhì)其減輕表皮細(xì)胞由于暴露于紫外線而產(chǎn)生的 DNA損傷，而對(duì)正常皮膚細(xì)胞不產(chǎn)生異常或壞的影響。
即，本發(fā)明中，通過制成含有水和乙醇可溶性的甘草提取物作為有效成分的BCL-2 蛋白表達(dá)劑、細(xì)胞凋亡抑制劑或表皮細(xì)胞的紫外線DNA損傷防止劑，解決了前述問題。
本發(fā)明中作為有效成分而被采用的甘草提取物對(duì)正常表皮細(xì)胞既安全又無害， 即，在正常表皮細(xì)胞中，不會(huì)給細(xì)胞增殖能力和細(xì)胞凋亡帶來顯著變化，即使添加在化妝品 等中，對(duì)正常表皮細(xì)胞，不會(huì)達(dá)到抑制細(xì)胞凋亡這樣顯著的作用。
即，在以往的化妝品的使用方法中，沒有積極地作為BCL-2蛋白表達(dá)劑、細(xì)胞凋亡 抑制劑或表皮細(xì)胞的紫外線DNA損傷防止劑來使用，其作用沒有確實(shí)地實(shí)現(xiàn)。
然而，本發(fā)明的BCL-2蛋白表達(dá)劑、細(xì)胞凋亡抑制劑或紫外線DNA損傷防止劑，對(duì) 于由于紫外線照射而引起了對(duì)DNA等的損傷的細(xì)胞，顯著地使其表皮細(xì)胞增殖，并修復(fù)組 織，使作為細(xì)胞凋亡抑制因子的BCL-2表達(dá)，抑制損傷DNA的胸腺嘧啶二聚體的形成。
如后述表3所示，T-T 二聚體陽性細(xì)胞出現(xiàn)比無處理組顯著降低，由此也清楚了表 皮細(xì)胞的DNA損傷的阻止性。
這種BCL-2蛋白表達(dá)劑、細(xì)胞凋亡抑制劑或DNA損傷防止劑對(duì)表皮細(xì)胞有效，防止 表皮細(xì)胞的DNA損傷，使BCL-2蛋白表達(dá)，抑制細(xì)胞凋亡。
我們認(rèn)為通過這種針對(duì)色素干細(xì)胞的皮膚用BCL-2蛋白表達(dá)劑，起到使得BCL-2 基因在色素干細(xì)胞生存必需的時(shí)期進(jìn)行供應(yīng)的作用，結(jié)果發(fā)現(xiàn)由于表皮細(xì)胞中色素干細(xì)胞 得到維持而生成黑色素、可以防止隨年齡增長的生理性的毛發(fā)的變白。
而且，本發(fā)明的BCL-2蛋白表達(dá)劑可以應(yīng)用于由于人、動(dòng)物的各種組織、細(xì)胞中 BCL-2基因引起的蛋白的表達(dá)而得到改善的各種處方中，具有可以應(yīng)用于例如通過器官治 療、包括干細(xì)胞的各種細(xì)胞的長壽化而產(chǎn)生的各種癥狀的改善或健康維持、皮膚或毛發(fā)等 美容的改善等其他各種處方中的通用性。
本發(fā)明由于制成含有水和乙醇可溶性的甘草提取物作為有效成分的BCL-2蛋白 表達(dá)劑或細(xì)胞凋亡抑制劑，因此具有如下優(yōu)點(diǎn)，即形成可以抑制具有被紫外線直接或間接 地?fù)p傷了的DNA的細(xì)胞的細(xì)胞凋亡，并提高細(xì)胞組織修復(fù)性而添加到各種藥物中預(yù)期有廣 泛應(yīng)用的BCL-2蛋白表達(dá)劑、細(xì)胞凋亡抑制劑或表皮細(xì)胞的紫外線DNA損傷防止劑。
此外，本發(fā)明的BCL-2蛋白表達(dá)劑還有以下優(yōu)點(diǎn)，即對(duì)皮膚細(xì)胞以外的體細(xì)胞也 具有使其長壽的效果，根據(jù)這種細(xì)胞的位置，有改善健康的效果。
具體實(shí)施方式
本發(fā)明中使用的甘草是西班牙、西伯利亞、中國等地所產(chǎn)的豆科的藥用植物，一種 通過干燥甘草提高了保存性的生藥，其是學(xué)名被稱為Glycyrrhiza urarelensis Fischer 或Glycyrrhiza glabra 1 var. glandulifera REG. Et HERD 的植物或其近緣種。該植物可 以優(yōu)選以根或根莖(也稱為葡萄莖或匍匐枝)帶皮的狀態(tài)、或除了栓皮層后被粉碎或磨碎 成粉末狀，用水或乙醇或其它水性溶劑提取它們，將其用作有效成分的提取材料。一般的甘 草提取物對(duì)皮膚的安全性是公知的。
本發(fā)明中用于提取有效成分的溶劑，是水(可以是中性、弱酸或弱堿性)或以水作 為主要成分，適當(dāng)添加了其它溶劑(可以是有機(jī)溶劑)的水性的提取溶劑，還可以采用含醇 的水溶液等。作為醇，可以列舉甲醇、乙醇、異丙醇、叔丁醇等公知的醇溶劑。而且，被這些 溶劑提取的有效成分在水和乙醇(=ethyl alcohol)中都是可溶性的。
通過這種水性溶劑進(jìn)行的提取操優(yōu)選在用于提高提取效率的溫水或熱水的狀態(tài) 下進(jìn)行。尤其是，如果在10(TC以上、優(yōu)選在100 130°c下進(jìn)行提取操作，可有效提取對(duì) BCL-2蛋白表達(dá)、細(xì)胞凋亡抑制或表皮細(xì)胞的紫外線DNA損傷防止有效的成分。
在提取工序中，優(yōu)選用活性碳等吸附劑過濾提取液，或利用固體與液體的比重差、 重力或離心力產(chǎn)生的沉降速度差分離固液，除去懸浮物質(zhì)。
作為吸附劑，可以是像活性碳等這樣的提供使大量正吸附發(fā)生的界面的物質(zhì)，在 對(duì)按上述方式獲得的透明性液體濃縮并再用水或乙醇等稀釋后，優(yōu)選通過過濾等方式分離 除去濃縮產(chǎn)生的不溶物，進(jìn)一步純化使其更完善。作為吸附劑的具體例子，可以列舉像活性 碳這種由多孔體構(gòu)成的無機(jī)類吸附劑以及合成吸附劑(有機(jī)類吸附劑)。
作為無機(jī)類吸附劑，可以列舉活性氧化鋁、硅凝膠、氧化鈦等金屬氧化物、還原物、氫氧化物、膨潤土、酸性粘土等粘土礦物、硅藻土、滑石等有解離性的含水硅酸鹽礦物。
活性碳，其材質(zhì)雖沒有特別嚴(yán)格選擇使用，但以木炭、竹子或椰子殼作為原料的活 性碳，其由微小粒子構(gòu)成的懸浮物質(zhì)的吸附效率好，因而優(yōu)選。
合成吸附劑由一直到粒子內(nèi)部都形成微細(xì)的連續(xù)孔的離子交換樹脂制的粒子構(gòu) 成，可以列舉芳香族系的交聯(lián)苯乙烯類多孔聚合物、使溴原子與芳香族聚合物的芳香核化 合的取代芳香族系的物質(zhì)、或以甲基丙烯酸酯聚合物為骨架的作為親水性吸附材的丙烯酸 性的物質(zhì)。
作為這種除去懸浮物質(zhì)的固液分離的其它操作，可以采取使提取液通過裝滿活性 碳顆粒的柱子等容器，或在提取液中加入活性碳粉末(根據(jù)需要加入滑石等過濾輔助劑) 后進(jìn)行攪拌，用濾紙或?yàn)V布等捕捉前述活性碳的粉末粒子的過濾裝置過濾該混合物的方 法，此外還可以采用通過離心分離或沉降速度差進(jìn)行的公知的固液分離手段。
對(duì)水性溶劑提取物的濃縮操作可以采用減壓操作或加熱濃縮等公知的濃縮手段。 濃縮比例為2 100倍左右，尤為優(yōu)選在5 50倍左右，通常優(yōu)選10倍左右的濃縮。
優(yōu)選再用前述水性溶劑提取液或與其相當(dāng)?shù)乃匀軇┰傧♂屗@得的濃縮物。稀 釋率不需要特別限定，例如我們認(rèn)為優(yōu)選恢復(fù)到濃縮前的容積程度的稀釋率，例如2 100 倍左右。然后，以前述濃縮和稀釋的操作作為1個(gè)工序，優(yōu)選重復(fù)進(jìn)行2個(gè)工序以上。
為了進(jìn)一步純化這樣獲得的液體，濃縮后，優(yōu)選使用乙醇濃度99. 5 %以上的無水 乙醇作為提取溶劑。
為了將通過固液分離獲得的乙醇可溶性成分作為皮膚外用劑進(jìn)行調(diào)制，可以制備 成如果與具有適當(dāng)?shù)挠H水性 親油性，皮膚付著性好的皮膚外用劑用基劑混合，或者將提取 液與乳膏、軟膏、乳液等基材混合，就可以在皮膚上涂布的這樣的制劑形態(tài)。
作為本發(fā)明的BCL-2蛋白表達(dá)劑、細(xì)胞凋亡抑制劑和表皮細(xì)胞的紫外線DNA損傷 防止劑的制劑形態(tài)，沒有特別限定，例如，作為外用劑，可以制成公知的形態(tài)，優(yōu)選制成像水 溶性液、乳液、乳膏、軟膏、粉劑等這樣容易涂抹于皮膚的制劑形態(tài)。
此外，作為上述化妝品的其它使用，本發(fā)明的BCL-2蛋白表達(dá)劑還可以制成例如 注射劑、吸入劑、口服劑、栓劑、軟膏等藥品、醫(yī)藥外用品的制劑形態(tài)，還可以與各制劑中可 通常使用的公知成分混合后使用。
如后所述，水和乙醇可溶性的甘草提取物的作為BCL-2蛋白表達(dá)劑、細(xì)胞凋亡抑 制劑和表皮細(xì)胞的紫外線DNA損傷防止劑的有效成分，優(yōu)選被配合成以最終濃縮物的干燥 物(干燥固體物質(zhì))的配合重量％計(jì)對(duì)皮膚為0. 1 10重量％這樣的濃度進(jìn)行配方。
實(shí)施例
[甘草提取液(T)實(shí)際生產(chǎn)的制造方法]
1)[在200kg東北甘草絲中加入2000升(以下，用L表示升)水，于95°C提取2. 5 小時(shí)，用振動(dòng)篩(300目、不銹鋼制)過濾提取液。將獲得的提取濾液濃縮(液溫60°C以下、 減壓)，噴霧干燥濃縮液(噴霧干燥原液)，獲得了干燥提取物。將該提取物過篩(60目、不 銹鋼制)，獲得了產(chǎn)量為20kg的甘草干燥提取物(T原)。
2)在1)中獲得的20kg東北甘草干燥提取物(T原)中加入100L藥典乙醇，攪拌 6小時(shí)，用2號(hào)濾紙過濾。
3)在濾液中加入藥典乙醇，使得終體積達(dá)到100L，加入4. ^g的活性碳(粒狀白鷺KL)，攪拌3小時(shí)，用2號(hào)濾紙過濾。重復(fù)進(jìn)行3次這樣的工序。
4)在幻獲得的濾液中加入藥典乙醇，使得終體積達(dá)到100L，將其濃縮至10L(50°C 以下、減壓)。進(jìn)而加入400g活性碳(粒狀白鷺KL)，攪拌2小時(shí)，用2號(hào)濾紙過濾。重復(fù) 進(jìn)行6次這樣的工序。
5)在4)獲得的濾液中加入藥典乙醇，使得終體積為10L，濃縮至2L。在其中加入 IL藥典乙醇和IOOg活性碳(粒狀白鷺KL)，攪拌3小時(shí)，用2號(hào)濾紙過濾。
6)在5)獲得的濾液中加入藥典乙醇，使得終體積為2L，加入IOOg活性碳(粒狀 白鷺KL)，攪拌3小時(shí)，用2號(hào)濾紙過濾。
7)在6)獲得的濾液中加入藥典乙醇，使得終體積為2L，用5號(hào)濾紙過濾。
8)對(duì)7)獲得的濾液進(jìn)行濃縮(40°C以下、減壓)干燥后，加入300mL水，提取(振 蕩、室溫)，用5號(hào)濾紙過濾。進(jìn)行3次這樣的工序。
9)使8)獲得的濾液達(dá)到1L。
將250mL的9)獲得的濾液通過水浴加熱到95 100°C，在獲得的濃縮物(37. Ig) 中加入IL的99. 5%無水乙醇(Konishi公司)，取出乙醇可溶性級(jí)分，加熱到95 100°C， 獲得濃縮物5g)。在其中加入50mL的純凈水和50g的活性碳(和光純藥社制活性碳 粉末)，進(jìn)行攪拌的同時(shí)，加入75g的滑石(丸石制藥社制)，再進(jìn)行攪拌后，用濾紙過濾。在 將獲得的濾液加熱到95 100°C而獲得的濃縮物(14. 7g)中加入400ml的99. 5%無水乙 醇(Konishi公司)，取出乙醇可溶性級(jí)分，在經(jīng)加熱到95 100°C而獲得的濃縮物(11. 7g) 中加入50mL純凈水和30g活性碳(和光純藥社制活性碳粉末)，在進(jìn)行攪拌的同時(shí)，加入 50g的滑石(丸石制藥社制)，再攪拌。然后，用濾紙過濾，在加熱得到的濾液到95 100°C 而獲得的濃縮物(8. 6g)中加入400ml的99. 5%無水乙醇(Konishi公司)，取出乙醇可溶 性級(jí)分，得到經(jīng)加熱到95 100°C而獲得的濃縮物(5. 2g)。在2. Og的該濃縮物中加入純 凈水，得到60g的產(chǎn)物，將其作為試樣。
甘草提取物的有效成分，如果換算為上述最終濃縮物(5.2g)干燥物的配合重 量％，我們認(rèn)為使其與皮膚在0.1 10重量％這樣的濃度范圍下接觸，對(duì)于為了獲得本發(fā) 明效果而言是有效的。
[評(píng)價(jià)實(shí)驗(yàn)(1)方法]
1)將4周齡的C56BL6雄性小鼠(日本SLC)馴化1周后，剃毛后分組。實(shí)驗(yàn)組為 第1組至第5組這五組，各組為15只小鼠。
第1組(比較例) 第2組(實(shí)施例) 第3組(實(shí)施例) 第4組(實(shí)施例) 第5組(比較例)紫外線照射前后PBS涂布 紫外線照射前試樣涂布 紫外線照射后試樣涂布 紫外線照射前后試樣涂布 只剃毛2)試樣于4°C保存，涂布前恢復(fù)到室溫。
3)在紫外線照射中，照射全波長紫外線(UV-A、-B、-C)，使得對(duì)皮膚產(chǎn)生急性紫外 線損傷，而此時(shí)，在紫外線照射試樣前M小時(shí)或照射后立刻涂布于小鼠皮膚上，研究急性 紫外線損傷的變化。
4)剃毛部位是有肋骨胸椎下緣與脊椎的交點(diǎn)為中心的2cm見方剃毛面積為km2。7剃毛用電動(dòng)理發(fā)推子(National)進(jìn)行，不使用剃刀。
5)紫外線照射用紫外線發(fā)生裝置(XX-15BLB，UVPCo, Tokyo, Japan)，以紫外線強(qiáng) 度llmW/cm2 (照射距離5cm)，照射1. 5分鐘。此時(shí)的紫外線照射量為1. OJ/cm2。
6)照射時(shí)，用戊巴比妥鈉(nembutal) (mg/小鼠皮下注射)對(duì)小鼠實(shí)施麻醉，然后 用帶子固定四肢，保持照射中體位的安靜。
7)用棉棒將200 μ 1的試樣全量于剃毛部邊干燥邊涂抹。
8)在紫外線照射后M小時(shí)后，通過頸椎脫臼屠宰小鼠，從包含其周圍非剃毛部位 的筋膜上剝離剃毛部位皮膚，在橡膠板上展開，用10%福爾馬林固定M小時(shí)。
9)從標(biāo)本中央部位切出寬度為4mm的皮膚切片組織，制成石蠟包埋塊，再制成 3μπι厚的薄切標(biāo)本。
10)用薄切標(biāo)本，進(jìn)行蘇木精核染色(以下，也簡稱為HE染色)和免疫染色。
11)免疫染色采用以下抗體，如表所示，進(jìn)行抗原活化、稀釋。抗體稀釋、清洗時(shí)采 用 Optimax Wash Buffer (Biogenex)。
抗體名克隆處理濃度
PCNA (DAKO) PClO 檸檬酸-MW 1/50
BCL-2 (DAKO)胃蛋白酶1/100
ss-DNA(IBL)胃蛋白酶1/200
T-T 二聚體(供給) 胃蛋白酶 1/200
12)免疫染色的步驟如下。
1 脫石蠟、加水
2 抗原活化
3 0. 3% H202-甲醇處理
4 一次抗體處理
5 洗凈
6: 二次抗體處理
7 洗凈
8 =DAB 顯色
9 蘇木精核染色
10 封入
13)在通過HE染色進(jìn)行的組織病理評(píng)價(jià)中，獲得了毒性病理認(rèn)定醫(yī)生的確認(rèn)。
14)免疫染色的判定
(1)對(duì)于PCNA、ssDNA和D-D 二聚體，在顯微鏡下觀察包括表皮細(xì)胞全層的500個(gè) 細(xì)胞，在核中觀察到陽性的細(xì)胞為陽性。
另外，PCNA(增殖細(xì)胞核抗原)由于在呈現(xiàn)出細(xì)胞增殖能力的整個(gè)細(xì)胞周期都比 較穩(wěn)定，在非增殖細(xì)胞中以非常低的水平而穩(wěn)定，而一旦進(jìn)入細(xì)胞分裂周期就激增，因此其 成為能夠檢測(cè)由非增殖細(xì)胞群向增殖細(xì)胞群移行的標(biāo)記。
(2)就BCL-2而言，與標(biāo)本內(nèi)的非剃毛部位皮膚(=非紫外線照射部)中的BCL-2 表達(dá)相比，免疫反應(yīng)更強(qiáng)的為陽性。染色強(qiáng)度低于非照射部位表皮時(shí)，則為陰性，為相同程 度的2倍以下的為陽性、2倍以上的則為強(qiáng)陽性。
[實(shí)驗(yàn)結(jié)果]
通過上述的實(shí)驗(yàn)方法，所獲得的形態(tài)學(xué)變化的結(jié)果示于表1。即，就形態(tài)變化研究 試樣對(duì)于小鼠皮膚紫外線照射中的表皮細(xì)胞變化的影響。
[表1]
權(quán)利要求
1.一種BCL-2蛋白表達(dá)劑，其特征在于，含有水和乙醇可溶性的甘草提取物作為有效 成分。
2.一種皮膚用BCL-2蛋白表達(dá)劑，其特征在于，在權(quán)利要求1所述的BCL-2蛋白表達(dá)劑 中，BCL-2蛋白的表達(dá)為表皮細(xì)胞中的BCL-2蛋白的表達(dá)。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的皮膚用BCL-2蛋白表達(dá)劑，其中，所述表皮細(xì)胞為色素干細(xì)胞。
4.一種細(xì)胞凋亡抑制劑，其特征在于，含有權(quán)利要求1或2所述的BCL-2蛋白表達(dá)劑作 為有效成分。
5.一種表皮細(xì)胞的紫外線DNA損傷防止劑，其特征在于，含有權(quán)利要求1所述的甘草提 取物作為有效成分。
全文摘要
一種細(xì)胞凋亡抑制劑，其抑制具有被紫外線等直接或間接地?fù)p傷了的DNA的細(xì)胞的細(xì)胞凋亡，且可以加入到提高細(xì)胞的組織修復(fù)性的各種藥劑中，且可期待有廣泛應(yīng)用。其是含有水和乙醇可溶性的甘草提取物作為有效成分的表皮細(xì)胞等的細(xì)胞凋亡抑制劑。細(xì)胞凋亡抑制劑具有由于BCL-2蛋白質(zhì)的表達(dá)而產(chǎn)生的抗細(xì)胞凋亡因子，具有對(duì)紫外線導(dǎo)致的DNA損傷的防止性。其減輕由于表皮細(xì)胞暴露于紫外線而導(dǎo)致的DNA損傷，而且對(duì)正常的皮膚細(xì)胞沒有異常或壞的影響。
文檔編號(hào)A61Q19/06GK102036674SQ200880129399
公開日2011年4月27日 申請(qǐng)日期2008年5月23日 優(yōu)先權(quán)日2008年5月23日
發(fā)明者田北雅夫 申請(qǐng)人:有限會(huì)社西原