一株高產l-甲硫氨酸的谷氨酸棒桿菌的構建及應用的制作方法
【專利摘要】一株高產L-甲硫氨酸的谷氨酸棒桿菌的構建及應用，屬于生物工程領域。本發明提供的高產甲硫氨酸的重組菌株（C.glutamicumsubspecieslactofermentum）QW102/pJYW-4-homm-lysCm-brnFE，已保藏于中國典型培養物保藏中心，保藏號為CCTCC?M2014232。該重組菌株存在以下遺傳學特征：表達轉運蛋白BrnFE，表達天冬氨酸激酶片段lysC和高絲氨酸脫氫酶片段hom，同時在基因組上缺失thrB和mcbR基因。本發明通過基因工程的方法，獲得一株高產甲硫氨酸的重組菌株；還提供了用該重組菌株高產L-甲硫氨酸的方法。
【專利說明】一株高產L-甲硫氨酸的谷氨酸棒桿菌的構建及應用

【技術領域】
[0001] 本發明一株高產L-甲硫氨酸的谷氨酸棒桿菌的構建及應用，屬于生物工程領域， 具體涉及一種高產L-甲硫氨酸的方法。

【背景技術】
[0002] L-甲硫氨酸，為含硫α硫氨基酸之一。其合成方法主要為化學合成法和發酵法兩 種。目前工業化生產應用的主要為化學合成混旋甲硫氨酸，而發酵法目前仍沒有工業化應 用實例。L-甲硫氨酸廣泛應用于飼料業，因飼料生產不需要高純度的L-甲硫氨酸，目前仍 以化學合成法為主。但因化學合成法會產生大量有害物質，發酵法生產甲硫氨酸越來越受 到關注。但由于甲硫氨酸合成途徑能耗較高，而且硫同化途徑對細胞自身毒性較大，發酵法 生產甲硫氨酸沒有達到工業規模。
[0003] 目前發酵法合成甲硫氨酸主要利用大腸桿菌或谷氨酸棒桿菌作為生產菌株，但因 為大腸桿菌自身會產生內毒素，不利于食品安全發酵。同時大腸桿菌中甲硫氨酸代謝途徑 相較谷氨酸棒桿菌復雜，不利于菌株的代謝工程改造。而谷氨酸棒桿菌作為一株食品安全 級生產菌株，其具有較高的谷氨酸及天冬氨酸家族氨基酸生產能力，也被用于生產L-甲硫 氨酸，目前已廣泛應用在賴氨酸，組氨酸，異亮氨酸等氨基酸的工業化生產中，但甲硫氨酸 尚沒有工業化應用的實例。


【發明內容】

[0004] 本發明的目的在于通過基因工程的方法，獲得一株高產甲硫氨酸的重組菌株。
[0005] 根據本發明的一個優選實例，本發明提供的高產甲硫氨酸的重組菌株，包含基因 組上高絲氨酸激酶編碼基因 Ari?和TetR型阻遏蛋白編碼基因的敲除。
[0006] 根據本發明的一個優選實例，本發明提供的高產甲硫氨酸的重組菌株，還包含外 源性的表達反饋抗性天冬氨酸激酶片段，反饋抗性高絲氨酸脫氫酶片段和轉運蛋白BrnFE 片段。
[0007] 根據本發明的一個優選實例，外源表達的天冬氨酸激酶片段第311位Thr突變為 lie，外源表達的高絲氨酸脫氫酶片段第377位Gly突變為Glu。
[0008] 根據本發明的一個優選實例，提供的外源性片段存在于載體，所述載體為質粒 pJYW-4。
[0009] 本發明的技術方案：一株高產L-甲硫氨酸的谷氨酸棒桿菌，所述菌株分類命名為 谷氨酸棒桿菌已保藏于中國典型培養物保藏中心，保藏 號為 CCTCC Μ 2014232。
[0010] 所述菌株其同時存在以下遺傳學特征：表達轉 運蛋白份77/?'，表達天冬氨酸激酶片段心^^和高絲氨酸脫氫酶片段同時在基因組上缺 失iAri?和《cAT?基因。
[0011] 用所述菌株CCTCC Μ 2014232生產L-甲硫氨酸的方法：以QW102/ '為生產菌，挑活化過的單菌落于50mL/500mL種子培養基，3(TC、 200 rpm培養18 h;然后按初始OD562為1轉接至1.2L/3L發酵罐；通過流加氨水調節pH至 7. 0,通過關聯攪拌轉速和曝氣率控制溶氧為30%，通過補加50%的葡萄糖控制殘糖在20g/ L以上；每4 h取樣測定菌體濃度、殘糖和氨基酸含量；檢測結果顯示，在發酵48 h時甲硫 氣酸廣量達到最商，最商廣量為3. 1 g/L ; 種子培養基：25 g/L 葡萄糖，20 g/L 玉米漿，1 g/L KH2P04,0. 5 g/L MgS04，1.25 g/L 尿素； 發酵培養基：100 g/L 葡萄糖，20 g/L 玉米漿，20 g/L (NH4)2S04，1 g/L ΚΗ2Ρ04,0·5 g/ L MgS04,0. 01 g/L MnS04,0. 01 g/L FeS04,1 mg/L VB1,6 mg/L VB6,0. 1 mg/L VH,0. 2 g/L VB12。
[0012] 本發明的有益效果：本發明提供的高產甲硫氨酸的重組菌株 '，已保藏于中國典型培養物 保藏中心，保藏號為CCTCC Μ 2014232。該重組菌株存在以下遺傳學特征：表達轉運蛋白 份77/?'，表達天冬氨酸激酶片段心^^和高絲氨酸脫氫酶片段Αο?，同時在基因組上缺失 和基因。本發明通過基因工程的方法，獲得一株高產甲硫氨酸的重組菌株；還提供了 用該重組菌株高產L-甲硫氨酸的方法。 生物材料樣品保藏：一株高產L-甲硫氨酸的谷氨酸棒桿菌，其分類命名為谷 氧後棒 Ψ? 舊哪說l/vymhonf-lysC'-brnFECorynebacteriumglutainicuin哪 Vd2/ 已保藏于中國典型培養物保藏中心，地址：中國武漢,武漢大 學，保藏日期2014年5月28日，保藏號為CCTCC NO :M 2014232。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0013] 圖1、本發明構建重組質粒圖譜。

【具體實施方式】
[0014] 以下通過實施例來進一步闡明本發明，下列實施例用于說明目的而非用于限制本 發明范圍。
[0015] 在本發明的下述實施例中，所用的質粒提取試劑盒、基因組提取試劑盒、膠回收試 劑盒、大腸桿菌DH5a菌株購于天根生物公司，所用的限制性內切酶、T4 DNA連接酶、PCR試 劑等均購于TaKaRa生物公司，所用引物由捷瑞生物公司合成。
[0016] 實施例1、重組谷氨酸棒桿菌的構建 在本實施例中，先分別構建了用于谷氨酸棒桿菌中敲除和表達相關基因的質粒，然后 將已構建好的質粒分別轉化到相應的谷氨酸棒桿菌中，從而實現相關基因的敲除與過量表 達。
[0017] 1. 1高絲氨酸激酶編碼基因iAr沒和阻遏蛋白McbR編碼基因敲除質粒的構 建 1. 1. 1敲除基因上下游同源臂mcbRU，mcbRD，thrBU，thrBD和loxp-kan-loxp片段的 擴增 在本實施例中，先設計了用于擴增的引物，抽提用于擴增模板的基因組和質粒，然后通 過PCR分別擴增了相關基因片段。具體如下： 根據Genebank報道的iAri?，《cAT?基因序列，選擇基因上下游各lkb左右大小的片段 作為敲除基因上下游同源臂，其中thrBU，thrBD用于iAri?基因的敲除，mcbRU，mcbRD用于 基因的敲除。設計以下8條引物，用于克隆mcbRU，mcbRD，thrBU，thrBD序列： mcbRU-F {PstI) ： GCTCTGCAGT GAAGCTCGTG GCGCCGAACT mcbRU-R {BamHI) ： TAGGATCCAT AGACAAACCG GTTCGTATAGT mcbRD-F ijbal) ： GCATCTAGAT CTTGTTCGCG ATTTCTTTG mcbRD-R {Xhol) ： GCCTCGAGGT GTGTTTTTAG ATCTTCGGTT thrBU-F {Xhol) ： ATCTCGAGGG CAAGTCTGTT GTTA thrBU-R {Xbal) ： ACCTCTAGAT TAGTCCCTTT CGAG thrBD-F {BamHI) ： ACGGATCCCA GTCAAGGTTG AAGTT thrBD-R {PstI) ： ATCCTGCAGC TACGTGGTCT ATCGC 其中mcbRU-F和mcbRU-R用于擴增mcbRU片段，mcbRD-F和mcbRD-R用于擴增mcbRD片 段，thrBU-F和thrBU-R用于擴增thrBU片段，thrBD-F和thrBD-R用于擴增thrBD片段。 引物酶切位點用下劃線標示，酶切位點對應的限制性內切酶標示在括號內。
[0018] 根據質粒pDTW-202設計用于擴增loxp-kan-loxp片段的引物，引物序列如下： kan-loxp-F (BamHI): ATGGATCCAA TACGACTCAC TATAGGGCG kan-loxp-R (Xbal): ACCTCTAGAG CGCAATTAAC CCTCACTAAA G 引物酶切位點用下劃線標示，酶切位點對應的限制性內切酶標示在括號內。
[0019] 抽提獲得谷棒ATCC13032基因組和pDTW-202質粒。
[0020] 以谷棒 ATCC13032 基因組為模板，以 mcbRU-F 和 mcbRU-R，mcbRD-F 和 mcbRD-R， thrBU-F 和 thrBU-R，thrBD-F 和 thrBD-R 為引物對進行 PCR 擴增，獲得 mcbRU，mcbRD，thrBU， thrBD片段。以pDTW-202質粒為模板，以kan-loxp-F和kan-loxp-R為引物對進行PCR擴 增，獲得loxp-kan-loxp片段。將PCR產物分別進行凝膠電泳檢測，獲得的產物大小符合預 期大小。
[0021] 使用膠回收試劑盒獲得純化的mcbRU, mcbRD, thrBU, thrBD, loxp-kan-loxp片段。
[0022] 1. 1. 2敲除質粒pWTQl和pWTQ2的構建 將純化過的片段在37°C條件下酶切處理3h。包括AiJ和及麗賢雙酶切片段mcbRU， 油aJ和沿〇/雙酶切片段mcbRD，AiJ和及麗雙酶切片段thrBD，油aJ和沿〇/雙酶切片 段thrBU，及麗賢和油aJ雙酶切片段loxp-kan-loxp。使用DNA產物純化試劑盒對酶切后 的片段進行純化。
[0023] 用AiJ和沿〇/雙酶切質粒pBluscriptll SK (+)，獲得帶有粘性末端的線性化質 粒。使用DNA產物純化試劑盒對酶切后的質粒進行純化。
[0024] 對酶切純化過的質粒使用T4 DNA連接酶進行連接，連接體系如下： pBluscriptll SK(+)質粒 50-100 ng 連接片段 3倍pBluscriptll SK(+)質粒摩爾比 T4DNA連接酶 1 μ L Τ4 Buffer 2 μ L ddH20 補加至20 μ L 連接溫度：16°C，連接時間3-10 h 利用以上連接體系，連接片段mcbRU, mcbRD, loxp-kan-loxp和質粒pBluscriptll SK(+)，以構建·?Μ敲除質粒；連接片段thrBU，thrBD, loxp-kan-loxp和質粒 pBluscriptll SK(+)，以構建 iAri?敲除質粒。
[0025] 將以上連接體系轉化大腸桿菌DH5 α，并涂布含有30mg/L的卡那霉素的LB平板， 培養后獲取轉化子進行鑒定。最終獲得敲除質粒，命名為pWTQl ;獲得敲除質粒 命名為PWTQ2 (附圖1)。
[0026] 1. 2高絲氨酸脫氫酶，天冬氨酸激酶和轉運蛋白BrnFE表達載體的構建 1. 2. 1定點突變改造高絲氨酸脫氫酶和天冬氨酸激酶 在本實施例中，選用以下突變位點解除高絲氨酸脫氫酶和天冬氨酸激酶的反饋阻遏作 用。其中高絲氨酸脫氫酶第377位的Gly被突變為Glu，天冬氨酸激酶第311位Thr被突變 為 lie。
[0027] 根據 genebank 報道的 Ao?(SEQ ID NO. 1) ID NO. 2)序列，設計以下四 條引物用于克隆Αο?，序列： hom-F: GCGAATTCAT GACCTCAGCA TCT hom-R: GATGAGCTCT TAGTCCCTTT CGAG lysC-F: GCTGAGCTCG TGGCCCTGGT CGTAC lysC-R: GCCTCGAGTT AGCGTCCGGT 其中hom-F和hom-R用于擴增Ac?基因編碼區，lysC-F和lysC-R用于擴增又編碼 區。
[0028] 抽提獲得ATCC13032基因組。
[0029] 以ATCC13032基因組為模板，分別以hom-F和hom-R，lysC-F和lysC-R為引物對 進行PCR擴增，獲得Αο?和基因片段。
[0030] 使用膠回收試劑盒回收獲得的Aoffi和基因片段?；厥蘸蟮钠芜B接PMD18-T 載體，分別獲得pMD18-T-Ao?和pMD18-T-質粒。根據基因的突變位點設計定點突變引 物，序列如下： homint-F ： TGGAAGATCG CGTGGGAGTT TTGGCTGAAT TGGC homint-R ： GCCAATTCAG CCAAAACTCC CCACGCGATC TTCCA lysCint-F ： GCACCACCGA CATCATCTTC ACCTGCCCTC lysCint-R ： GAGGGCAGGT GAAGATGATG TCGGTGGTGC 其中 homint-F 和 homint-R 用于擴增質粒 pMD18-T_Ao?，lysCint-F 和 lysCint-R 用于 擴增質粒pMD18-T-/_F5^。序列中下劃線標示的是基因的突變位點。
[0031] 以質粒 pMD18-T_Ao? 和 pMDlS-T-Zj^C 為模板，分別以 homint-F 和 homint-R, lysCint-F和lysCint-R為引物對對整個質粒進行擴增。擴增產物用Z^/?J37°C處理lh，獲 得的產物轉化大腸桿菌DH5 α，并涂布含有30mg/L的氨芐青霉素的LB平板，培養后獲取轉 化子進行鑒定。根據鑒定結果，最終獲得兩個質粒pMD18-T-AoV和pMD18-T-/j^f。
[0032] 質粒pMD18-T-Ao?w和pMDlSUj^f經測序驗證，分別含有預期的突變位點。
[0033] 1. 2. 2反饋抗性高絲氨酸脫氫酶和天冬氨酸激酶及轉運蛋白BrnFE表達載體的 構建 根據genebank報道的Αο?,又75^，'基因序列，設計以下六條引物用于克隆 又基因序列為 SEQ ID N0.3，SEQ ID Ν0.4); hom-SD-F {EcoRI) ： GCGAATTCAG AAGGAGACTA GTAATGACCT CAGCATCT hom-R {SacI) ： GATGAGCTCT TAGTCCCTTT CGAG lysC-SD-F {SacI) ： GCTGAGCTCA GAAGGAGAGA TGTTAGTGGC CCTGGTCGTA C lysC-R {Xhol) ： GCCTCGAGTT AGCGTCCGGT brnFE-SD-F {BamHI) ： TAAGGATCCA GAAGGAGATA TACCGTGCAA AAAACGCAAG brnFE-R {Xbal) ： TACTCTAGAT TAGAAAAGAT TCAC 其中hom-SD-F和hom-R用于擴增基因編碼區；lysC-SD-F和lysC-R用于擴增心 基因編碼區；brnFE-SD-F和brnFE-R用于擴增'基因編碼區。引物酶切位點用下劃線 標示，酶切位點對應的限制性內切酶標示在括號內。
[0034] 以質粒 pMD18-T-Ac?w 和 pMD18_T_又為模板，分別以引物 hom-SD-F 和 hom-R， 以及引物lysC-SD-F和lysC-R為引物對，進行PCR擴增，獲得AoV和心片段。
[0035] 以ATCC13032基因組為模板，以引物brnFE-SD-F和brnFE-R為引物對進行PCR擴 增，獲得基因'編碼區序列。
[0036] 用膠回收試劑盒回收獲得和6/77/?'片段。
[0037] 抽提獲得大腸到谷棒穿梭表達質粒pJYW-4。
[0038] 將純化過的片段和質粒在37°C條件下酶切處理3h，進一步使用膠回收試劑盒 回收獲得帶有粘性末端的片段hsf和'，以及線性化質粒pJYW-4。將獲得的 質粒和片段進行連接，成功獲得表達質粒pJYW-4-AM，pJYW-4-7_f·^，pJYW-4-fo77/^， (附圖 1)。
[0039] 根據genebank報道的Αο?, #5^基因序列，設計以下兩條引物用于克隆 基因片段： hom-lysC-F ： TATGGGCCCA GAAGGAGACT AGTAATGACC TCAGCATCT hom-lysC-R: TAGGGATCCT TAGCGTCCGG TGCCTG 以質粒為模板，引物hom-lysC-F和hom-lysC-R為引物對進行PCR 擴增，獲得片段。
[0040] 用膠回收試劑盒回收獲得片段。
[0041] 將純化過的片段和質粒pJYW-4-foT?/^'在37 °C條件下酶切 處理3h，進一步使用膠回收試劑盒回收獲得帶有粘性末端的-心片段和 線性化質粒pJYW-4-foT?/^'。將獲得的質粒和片段進行連接，成功獲得表達質粒 (附圖 1)。
[0042] 1. 3谷棒中重組菌株的構建 1. 3. 1高絲氨酸激酶和阻遏蛋白McbR缺失菌株的構建 以谷氨酸棒桿菌ATCC13032為出發菌株，電轉敲除質粒pWTQl至ATCC13032以構建高 絲氨酸激酶缺失菌株ATCC13032缺iAr兒具體操作流程如下： (1)從大腸桿菌DH5 α中提取質粒pWTQl，用pH8. 0的水洗脫備用。
[0043] (2)電轉質粒pWTQl至谷棒ATCC13032,菌液涂布含有卡那霉素的LBHIS平板進行 培養，篩選獲得正確轉化子。
[0044] (3)電轉質粒pDTW-109至步驟（2)中獲得的轉化子，涂布含有氯霉素的LBHIS平 板，25°C進行篩選。獲得的正確轉化子命名為WTQ101。
[0045] 采用上述方法，以WTQ101為出發菌株，電轉敲除質粒pWTQ2至WTQ101，獲得高絲氨 酸激酶和McbR共同缺失菌株，命名為WTQ102。
[0046] 1. 3. 2反饋抗性高絲氨酸脫氫酶，天冬氨酸激酶和轉運蛋白BrnFE的外源表達 抽提質粒 pJYW-4-Aofi/Wj^f 和 '，分別電轉菌株 WTQ101 和 WTQ102。涂布含有卡那霉素的LBHIS平板，篩選轉化子抽提質粒進行單酶切驗證，獲得以下 正確轉化子： WTQ101 hym-\-hornm-lysC ； WTQ102/pJYff-4-Ao#-7^r ； m講(TZ/pyr^-A-honF-lysC-brnFE。
[0047] 實施例2、重組谷氨酸棒桿菌搖瓶水平生產甲硫氨酸 本實例中使用的培養基配方如下： 種子培養基：25 g/L 葡萄糖，20 g/L 玉米漿，1 g/L KH2P04,0. 5 g/L MgS04，1.25 g/L 尿素。
[0048] 發酵培養基：100 g/L 葡萄糖，20 g/L 玉米漿，20 g/L (NH4)2S04，1 g/L KH2P04， 0.5 g/L MgS04,0. 01 g/L MnS04,0. 01 g/L FeS04,1 mg/L VB1,6 mg/L VB6,0. 1 mg/L VH, 0·2 g/L VB12。
[0049] 挑活化過的單菌落于30mL/250mL種子培養基，30°C、200 rpm培養18 h。然后按 初始0D562為1轉接至50mL/500mL發酵培養基中，其中發酵培養基添加20 g/L碳酸鈣以平 衡pH。30°C、200 rpm培養72 h。取樣測定相關氨基酸產量。
[0050] 本實施例中發酵液氨基酸含量采用HPLC進行測定，具體方法如下： 取發酵樣品lmL，1,2000 rpm離心5 min,取上清于一干凈EP管中用5%三氯乙酸稀釋 20倍，4°C靜置6-9 h。靜置后的樣品于1,2000 rpm離心10 min，0.22 nm水相針式濾器 過濾至氨基酸樣品瓶中上機檢測。
[0051] 各突變株甲硫氨酸產量對比如下:_

【權利要求】
1. 一株高產L-甲硫氨酸的谷氨酸棒桿菌，其特征在于，所述菌株分類命名為谷氨酸棒 妖麗{C. glutamicum subspecies lactofermentum')^M]S)2/vymhomm-lysCn-brnFE，已像 藏于中國典型培養物保藏中心，保藏號為CCTCC Μ 2014232。
2. 權利要求1所述菌株QW102/pJYW-4-AoV-/j^f-fo7?/E其特征在于其同時存在以 下遺傳學特征：表達轉運蛋白'，表達天冬氨酸激酶片段心和高絲氨酸脫氫酶片段 Αο?，同時在基因組上缺失iAr沒和基因。
3. 權利要求1所述的高產L-甲硫氨酸的谷氨酸棒桿菌的應用，其特征在于用于搖瓶水 平及發酵罐水平生產甲硫氨酸。
4. 用權利要求1所述菌株CCTCC Μ 2014232生產L-甲硫氨酸的方法，其特征在于：以 '為生產菌，挑活化過的單菌落于50mL/500mL種子培養基， 30°C、200 rpm培養18 h ;然后按初始0D562為1轉接至1. 2L/3L發酵罐；通過流加氨水調 節pH至7. 0,通過關聯攪拌轉速和曝氣率控制溶氧為30%，通過補加50%的葡萄糖控制殘糖 在20g/L以上；每4 h取樣測定菌體濃度、殘糖和氨基酸含量；檢測結果顯示，在發酵48 h 時甲硫氣酸廣量達到最商，最商廣量為3. 1 g/L ; 種子培養基：25 g/L 葡萄糖，20 g/L 玉米漿，1 g/L KH2P04,0. 5 g/L MgS04，1.25 g/L 尿素； 發酵培養基：100 g/L 葡萄糖，20 g/L 玉米漿，20 g/L (NH4)2S04，1 g/L ΚΗ2Ρ04,0·5 g/ L MgS04,0. 01 g/L MnS04,0. 01 g/L FeS04,1 mg/L VB1,6 mg/L VB6,0. 1 mg/L VH,0. 2 g/L VB12。
【文檔編號】C12P13/12GK104099267SQ201410254429
【公開日】2014年10月15日 申請日期:2014年6月10日 優先權日:2014年6月10日
【發明者】王小元, 秦天宇, 胡曉清, 李燁, 李顏顏 申請人:江南大學