專利名稱：：一種表達抑制細胞生長多肽的腺病毒的構建及其應用的制作方法
技術領域：
：本發明涉及一種含有編碼由25個氨基酸構成的能抑制細胞生長的多肽(甲硫氨酸-天門冬氨酸-精氨酸-天門冬氨酸-天門冬氨酸-丙氨酸-天門冬氨酸-色氨酸-精氨酸-谷氨酸-纈氨酸-甲硫氨酸-甲硫氨酸-脯氨酸-酪氨酸-絲氨酸-蘇氨酸-谷氨酸-亮氨酸-異亮氨酸-苯丙氨酸-酪氨酸-異亮氨酸-谷氨酸-甲硫氨酸)核酸序列的腺病毒。同時，本發明還涉及這一腺病毒的制備和純化，在制備抗腫瘤藥物中的用途以及在腫瘤及其它增殖性疾病治療中的應用，屬于醫學生物工程藥物領域。二
背景技術：
：腫瘤是-種嚴重危害人類健康的疾病，目前其死亡率在國內已成為僅次于心腦血管疾病的第二位致死病因。臨床中主要應用化療、放療及手術治療，這些方法形成了比較成熟的治療體系，取得了較好的效果。然而，由于這些方法選擇性低，難以避免毒副作用強、正常細胞和腫瘤之間治療窗口小等缺點，因此亟待研發新的有效治療方法。近來腫瘤細胞生物學的快速發展，為滿足這一社會需求提供了現實的可能性，其中，隨著細胞的信號轉導途徑(Signalingtransductionpathways)的闡明，發現了越來越多可川作治療腫瘤的藥靶。有一些已經成功的應用于臨床，取得了非常好的效果。比如在許多乳腺癌細胞中ErbB2(—種能促進蛋白磷酸化的上皮生長因子受體)過度表達，并且其蛋白激酶活性也增強，應用一種特異性針對這-蛋白單克隆抗體能有效的抑制ErbB2蛋白激酶活性，亂斷這一蛋白介導的信號轉導。這--抗體目前已進入臨床使用。細胞生長的信號由細胞內外促進生長的因子經過--系列蛋白參與傳遞到細胞核，引起細胞周期的許多調節蛋白結構和功能變化而導致細胞分裂。在這些調節細胞生長周期的蛋白中，磷脂酰肌醇-3-激酶(PI3K)是—個具有脂磷酸化激酶和蛋白磷酸化激酶活性的酶蛋白，其激酶活性受到許多信號傳遞分子的影響。由于磷脂酰肌醇-3-激酶在細胞生長調節中的極重要的作用，這一蛋白是目前研究開發治療腫瘤新藥的重要靶標之一。至今為止，已發現多個磷脂酰肌醇-3-激酶激酶活性的抑制劑，但由于磷脂酰肌醇-3-激酶的酶活性也是體內--些寬要生理功能所必需的(比如胰島素調節人體內血糖和其它物質和能量代謝過程)，而這些抑制劑在抑制磷脂酰肌醇-3-激酶激酶活性的同時，往往也阻斷了這些生理功能，具有很強的毒性，所以在治療疾病中的應用受到較大限制。2003年，我們發現了細胞生長周期的調節蛋白一視神經母細胞瘤蛋白(Rb)和磷脂酰肌醉-3-激酶的一個調節亞基的相互作用。磷脂酰肌醇-3-激酶由調節亞基和催化亞基組成，催化亞基催化某些脂類及蛋白質上的絲氨酸和蘇氨酸磷酸化的活性是磷脂酰肌醇-3-激酶蛋白的核心效應組成部分，然而，催化亞基的活性受調節亞基的調控，調控通過以下兩個機制實現(1)催化亞基的活性本身受調節亞基影響；(2)調節亞基通過和其他蛋白的相互作用把催化亞基定位于目標蛋白。我們研究發現，視神經母細胞瘤蛋白和磷脂酰肌醇-3-激酶的相互作用是由磷脂酰肌醇-3-激酶中的55千道爾頓的調節亞基(p55PIK)中氨基端1-25號氨基酸(序列為甲硫氨酸-天門冬氨酸-精氨酸-天門冬氨酸-天門冬氨酸-丙氨酸-天門冬氨酸-色氨酸-精氨酸-谷氨酸-纈氨酸-甲硫氨酸-甲硫氨酸-脯氨酸-酪氨酸-絲氨酸-蘇氨酸-谷氨酸-亮氨酸-異亮氨酸-苯丙氨酸-酪氨酸-異亮氨酸-谷氨酸-甲硫氨酸)參與的，該多肽片段被稱為Rb結合功能區(以下稱為N25)，它把PI3K和Rb相互連接在一起，PI3K的蛋白激酶活性導致了Rb的磷酸化，從而引起了細胞分裂。我們進一步的實驗結果證明在細胞中表達P55PIK中N25的多肽，這一多肽能有效地結合于Rb，競爭性抑制細胞內PI3K和Rb的結合，由于這個多肽不具有任何磷酸化蛋白激酶活性，所以多肽結合Rb將抑制Rb的磷酸化過程，保持Rb抑制細胞生長的功能，從而阻止腫瘤細胞分裂。除Rb外，我們新的的實驗結果也證實N25多肽在細胞內還能阻止p55PIK和其他細胞周期調節分子的結合，也能有效地抑制細胞的分裂過程。
發明內容雖然試驗結果證明在細胞中表達的N25多肽能有效抑制細胞生長，但由于N25多肽自身不能穿過細胞膜，導致直接應用N25多肽作為藥物的療效并不理想，另外采用化學合成N25多肽的成本較髙，所以N25多肽藥物的臨床應用受到了一定的限制。大量實驗證實，自然界中存在一些病毒能感染人體細胞。這些病毒進入細胞后能有效地使用宿主細胞合成病毒顆粒自身所需蛋白質，如果在這些病毒基因組插入編碼其它外源蛋白的核酸序列，那么，重組病毒進入細胞后，這些外源蛋白也能得到表達。因此，人們研發了一些能在細胞內表達外源蛋白的重組病毒，利用這些病毒把治療^癥多肽或藥物帶到腫瘤細胞內。復制缺陷型(r印lication-deficient)的腺病毒(adenovirus)是目前最常用的細胞內表達外源蛋白的病毒之一。這種病毒載體的受體廣泛存在于各種不同的人類細胞中，這些細胞都能被腺病毒感染。另外在復制缺陷型的腺病毒中，野生型腺病毒的基因組中某些有關病毒裂解宿主細胞的序列已被去掉，失去了裂解細胞的能力，大大降低了腺病毒的毒性。世界上首個利用這種腺病毒表達抑癌翠白p53用于治療頭頸部腫瘤的藥物已在中國投入臨床使用，證明了這種腺病毒作為投送治療癌癥多肽到腫瘤細胞中在臨床使用的有效和低毒性。為了提髙N25多肽抑制細胞生長的效率，本發明利用分子生物學技術，將編碼N25多肽的核酸序列插入到復制缺陷型腺病毒基因組中，構建了在細胞中有效表達N25的腺病毒。我們在幾種不同的人類腫瘤細胞培養系中加入這種腺病毒，這些細胞的DNA合成及其他幾個證明細胞生長的觀察指標都顯著降低，證明了這一腺病毒具有抑制細胞生長的能力。更重要的是，該腺病毒能有效地抑制多種腫瘤動物體內生長模型中的腫瘤生長。與現有抑制細胞生長的方法相比，本發明有以下特點(1)表達N25多肽的腺病毒感染細胞或注射到腫瘤中，能夠抑制細胞的增殖及腫瘤的生長。證明用腺病毒表達N25是一種有效的投送方式。類似的其它病毒栽比如類腺病毒(Adenovirus-AssociatedVirusAAV)，逆轉錄病毒(Retrovirus)等也預期是有效地投送編碼N25核酸的載體，應用各種病毒載體投送N25多肽在腫瘤藥物的開發領域有極大的前景。(2)N25多肽的序列存在于人類細胞的蛋白質序列中，毒副作用低，抗原性弱，實驗結果也表明其對細胞凋亡或死亡沒有明顯影響，對正常細胞沒有明顯的殺傷作用。表達N25的腺病毒加入培養細胞和應用于動物體內，也沒有觀察到明顯的毒性。(3)應用表達N25多肽的腺病毒能有效抑制多種人類和鼠類腫瘤細胞在體內和體外培養系統中的生長，證明該腺病毒在腫瘤等細胞生長異常疾病的治療方面具有高效、廣譜等優點。(4)腺病毒生產過程比較簡單，生產效率高，而且生產成本低，便于大規模生產，有利直接應用于臨床。具體實施例方式例l:在復制缺陷型腺病毒基因組中引入編碼p55PIKN25組成的融合多肽的cDNA序列。含有復制缺陷型腺病毒DNA(亞型5，Subtype5)pAd-Easyl和pShuttle-CMV質粒由美國劉岳群博士惠贈。pShuttle-CMV質粒用fcoAV酶切，酶切后的質粒在瓊脂糖膠中分離、純化，用于以后的連接反應。從膠中回收DNA片段的試劑盒來自德國Qiagen公司(產品目錄號為28704)。編碼小鼠p55PIK全長蛋白的cDNA來源于小鼠睪丸組織cDNA文庫(美國Stratagene公司，目錄號為937308)，克隆到pcDNA3(購于Invitrogen公司，目錄號為V79020),用于擴增N25cDNA的PCR引物序列為引物1:TTTTTGATACTAGTGMCCGTCAGATCCG引物2:TTTTTGATACTCTACAACAAATGTGGTATGGCTGAPCR條件9化2分鐘94TCl分鐘、551Cl分鐘、72t2分鐘共25個循環；72"延伸5分鐘。PCR試劑盒來自美國Promega公司(目錄號為M1861)，PCR產物經過純化后(純化用的試劑盒來自德國Qiagen公司，產品目錄號為28704)，用五co^V醵切；再用瓊脂糖膠純化，然后和酶切純化后的載體進行連接反應(連接試劑盒來自美國Promega公司，目錄號為M1801)。轉化細菌后(感受態細菌g自美國Promega公司，目錄號為L2001)，克隆用常規菌落PCR進行篩選。選出陽性克隆，其cDNA序列的正確性通過核酸序列測定得到證實后，大規模純化制備質粒(大規模純化試劑盒來自美國Promega公司，目錄號為A7270)，用于以后的實驗。質粒用化el酶切和pAd-EasylI質粒共同轉化BJ5183感受態細菌，克隆用常規菌落PCR進行篩選編碼GFP-N25序列重組到Ad-Easy基因組中的克隆，把這些克隆擴大培養，并進行質粒提取，得到含有編碼GFprN25序列的腺病毒質粒。腺病毒質粒由尸acl酶線性化，再轉染到人腎胚細胞293中。在293細胞中，重組腺病毒核酸和構成病毒的蛋白質形成能裂解細胞的腺病毒顆粒，收集293細胞培養的上清液，即得到表達GFP-N25的腺病毒制備液。腺病毒顆粒經過擴增放大和氯化銫(CsCl)超速離心純化后，用生理鹽水透析去掉氯化銫(具體過程見有關的出版物)。純化后的腺病毒貯存于-701C冰箱。例2:表達N25的腺病毒影響細胞生長及細胞周期的實驗。用HT29細胞(人直腸癌細胞系，購自美國ATCC)檢測表達N25多肽的腺病毒(以下稱為Ad-GFP-N25)對細胞生長的影響。HT29細胞在含l(Mb胎牛血清的DMEM培養液，37X:，5%C02/95%空氣培養條件下培養于IO厘米細胞培養皿，將細胞培養至對數生長期后，加入Ad-GFP-N25腺病毒(50個腺病毒/細胞)，另外，只表達GFP的腺病毒(以下稱為Ad-GFP)用作對照，腺病毒孵育細胞6小時后，去掉腺病毒，加入新培養液到細胞中，培養48小時后收取細胞，利用流式細胞儀分析分析這些細胞的細胞周期分布。實驗結果表明在這一劑量下Ad-GFP-N25腺病毒對細胞凋亡沒有明顯影響，增加G0/G1期細胞數，其作用見下表。表l:TAT-N25對細胞周期的影響<table>tableseeoriginaldocumentpage6</column></row><table>DNA合成是細胞增殖的標志。下一個實驗中，我們檢測Ad-GFP-N25腺病毒對細胞DNA合成的影響。因為BrdU為胸腺嘧啶類似物，在DNA合成的S期可摻入到DNA中，摻入到DNA的BrdU經過免染色后,利用熒光顯微鏡確定有BrdU摻入到了DNA的細胞，以確定表達GFP-N25對DNA合成的影響。結果顯示加入Ad-GFP-N25腺病毒后，腫瘤細胞中有DM合成的S期的細胞數目大量減少(見表2)，這說明N25多肽抑制了DNA的合成，減少了腫瘤細胞的增殖。表2:Ad-GFP-N25抑制細胞DNA合成<table>tableseeoriginaldocumentpage6</column></row><table>例3:Ad-GFP-N25腺病毒抑制HT29.在小鼠內形成腫瘤的實驗在小鼠的皮下注射HT29細胞(5xl06)后，將小鼠隨機分成三組。當小鼠皮下能夠觀察到腫瘤后，向腫瘤中分別注射0.1毫升生理鹽水，Ad-GFP腺病毒(10-病毒)，Ad-GFP-N25腺病毒(10'病毒)，注射后每隔兩天測量小鼠皮下腫瘤的大小。14天后殺死小鼠，取出鼠內腫瘤稱重，進行其他檢測。結果顯示，與注射生理鹽水和Ad-GFP對照組相比，注射Ad-GFP-N25治療的小鼠皮下的腫瘤明顯要小，同時切片分析和其他測試的結果也證明Ad-GFP-N25有效抑制了HT29細胞在小鼠內形成的腫瘤,，表3:Ad"GFP-N25腺病毒抑制HT29在小鼠內生長的腫瘤<table>tableseeoriginaldocumentpage7</column></row><table>氨基酸和核苷酸序列表<110>夏獻民<120〉表達抑制細胞生長多肽的腺病毒的構建及其在腫瘤等與細胞生長異常相關的疾病治療中的用途<160>2<210>1<211>25<212>PRT<213>人(Homosapiens)<220><400>1MetAspArgAspAspAlaAspTrpArgGluValMetMetProTyr151015SerThrGluUuliePheTyrlieGluMet2025<210>2<211>75<212>DNA<213>人(Homosapiens)<220><221>CDS<222>(l)...(75)<400>2ATGGACCGCGATGACGCAGACTGGAGGGAG30MetAspArgAspAspAlaAspTrpArgGlu1510GTGATGATGCCCTATTCGAiCAGAACTGATA60ValMetMetProTyrSerThrGluLeulie1520TTTTATATTGAAATG75PheTyrlieGluMet2權利要求1.一種含有表達抑制細胞生長多肽的核酸序列腺病毒構建體。2.權利要求1所述的多肽，其特征在于抑制細胞生長的多肽是由磷脂酰肌醇-3-激酶的調節亞基p55PIK中氨基端25個氨基酸殘基組成的多肽，其序列為甲硫氨酸-天門冬氨酸-精氨酸-天門冬氨酸-天門冬氨酸-丙氨酸-天門冬氨酸-色氨酸-精氨酸-谷氨酸-纈氨酸-甲硫氨酸-甲硫氨酸-脯氨酸-酪氨酸-絲氨酸-蘇氨酸-谷氨酸-亮氨酸-異亮氨酸-苯丙氨酸-酪氨酸-異亮氨酸-谷氨酸-甲硫氨酸(MDRDDAD冊EVMMPYSTELIFYIEM)，或是從該多肽氨基端連續或間斷地缺失或取代自然數1一12中任意數值個氨基酸殘基得到的多肽之一，或是將所述多肽的序列經過一個或幾個氨基酸殘基的添加得到的具有抑制細胞生長活性的多肽之3.編碼權利要求l中多肽和另外一段核酸序列的多聚核酸。4.含有權利要求3中的核酸載體是一個病毒衍生的載體。5.含有權利要求4的宿主細胞。6.包括權利要求1至4之一項所述核酸、權利要求1至4所述載體或權利要求5所述細胞的藥物組合物。7.權利要求6所述的藥物組合物，其進一步包括藥物學上可接受的載體、賦形體或佐劑。8.權利要求6或7所述的藥物組合物在治療疾病中的用途。其特征是該藥物組合物在結腸癌、食管癌、胃癌和胃腸道其他腫瘤、肝癌、肉瘤，內分泌活化腫瘤，白血病，何杰金淋巴瘤和非何杰金淋巴瘤，頭頸部和耳鼻喉部腫瘤，肺癌、乳腺癌和其他婦科腫瘤、前列腺癌和其他泌尿生殖器官腫瘤等腫瘤及其它與細胞生長異常有關的疾病治療中的應用。全文摘要本發明公開了一種表達磷脂酰肌醇-3-激酶的調節亞基p55PIK中氨基端25個氨基酸(N25)的多肽的腺病毒。本發明還提供了這一腺病毒構建方法、生產工藝和流程、以及該腺病毒治療多種疾病特別是各種腫瘤疾病中的具體作用，屬于醫學生物工程藥物領域。文檔編號A61P35/00GK101100679SQ200710052268公開日2008年1月9日申請日期2007年5月24日優先權日2007年5月24日發明者周劍峰,夏獻民,程愛武,胡俊波申請人:夏獻民