殺滅革蘭氏陽性菌的酶抗生素及其制備、用途
【專利摘要】本發明公開了一種殺滅革蘭氏陽性菌的酶抗生素及其制備、用途；所述酶抗生素為由如SEQ?ID?NO.1所示的氨基酸序列組成的蛋白。本發明從豬鏈球菌基因組中篩選具有特定裂菌作用的基因，通過構建原核表達載體，獲得具有裂菌活性的重組表達產物——酶抗生素，確定其抗菌活性、裂菌譜、裂菌效率，以及影響表達產物活性的最優裂解條件。酶抗生素特異性強，且不易使細菌產生抗性，也不會對宿主產生不良影響，是解決現在日趨嚴重的細菌耐藥性的一種可行性方法。
【專利說明】殺滅革蘭氏陽性菌的酶抗生素及其制備、用途

【技術領域】
[0001]本發明屬于微生物化學領域，涉及一種殺滅革蘭氏陽性菌的酶抗生素及其制備、用途。

【背景技術】
[0002]豬鏈球菌是一種人獸共患病原菌，可引起人腦膜炎、仔豬腦膜炎、敗血癥、關節炎、心內膜炎等疾病，嚴重的可致人死亡。現已發現該菌莢膜抗原血清型有35種以上，大多數致病性血清型在1-9型，其中豬鏈球菌2型為最常見和毒力最強的血清型，流行最廣，對豬的致病力也最強，給養豬業造成巨大的經濟損失，在公共衛生方面，對相關從業人員的生命安全構成嚴重威脅。目前，對于豬鏈球菌病的治療主要是抗生素治療。近幾年由于養殖過程中抗生素的濫用，導致細菌的耐藥性也逐漸加劇，因此抗生素治療已面臨巨大的挑戰。
[0003]同樣，金黃色葡萄球菌也是一種人獸共患病原菌，可致人和動物的多種疾病。多重耐藥性金黃色葡萄球菌呈全球性擴散、傳播，嚴重威脅著人類健康。由于金黃色葡萄球菌不斷進化，對抗生素的耐藥性越來越強，它的高擴散性和高致病性，已經導致世界各國出現越來越多的臨床病例難以治愈，因而對人類健康的威脅也越來越大。因此，在抗生素對耐藥性金黃色葡萄球菌無能為力的情況下，亟需一種全新的抗菌制劑來防控其感染與傳播。
[0004]通過細菌基因組的分析，發現在細菌的全基因中還有很多基因的功能未知，有的大概預測了某個基因的功能，但并沒有被開發利用。這些基因有的是細菌本身具有的，有的是細菌在漫長的進化過程中通過一些特定的基因重組事件獲得的外源基因或構件。其中細菌中原噬菌體基因組構件的存在就是一個典型的基因重組案例，原噬菌體不但能夠介導宿主菌生物學特性的改變，還能夠影響宿主菌的繁殖周期，決定宿主菌的溶原和裂解狀態。在裂解過程中噬菌體在感染細菌后期表達一類細胞壁水解酶，該酶可通過特異性水解氨基糖之間的糖苷鍵，即細胞壁肽聚糖上的酰胺鍵或肽內氨基酸殘基間的連接鍵，達到裂解細菌的目的，因此也稱為酶抗生素。與抗生素相比，這類水解酶特異性強，且不易使細菌產生抗性，也不會對宿主產生不良影響，是解決現在日趨嚴重的細菌耐藥性的一種可行性方法。然而目前所挖掘的具有實用性的水解酶還寥寥無幾，且大多數這類酶活性低或難以大批量生產，特別是同時能特異性裂解多重耐藥的鏈球菌和金黃色葡萄球菌的酶抗生素還未見報道，本發明的突出優勢就是解決了以上這幾個問題。
[0005]本發明通過基因篩選、克隆和表達獲得了一種重組蛋白質，通過生物活性的檢測，確定其對鏈球菌和金黃色葡萄球菌的裂解活性、裂菌譜以及裂菌效率，并優化了保持該重組蛋白最佳活性的緩沖液、PH值、保存溫度等，確定該重組蛋白為特異、高效裂解多種血清型的豬鏈球菌、馬鏈球菌獸疫亞種及金黃色葡萄球菌的新型生物制劑。


【發明內容】

[0006]本發明的目的在于針對現有技術中的缺陷，提供一種殺滅革蘭氏陽性菌的酶抗生素及其制備、用途；具體是一種能夠高效殺滅多種血清型豬鏈球菌、馬鏈球菌獸疫亞種及多重耐藥的金黃色葡萄球菌的革蘭陽性菌的酶抗生素的篩選、制備、生物特性、裂菌方法、裂菌條件優化及用途。本發明從豬鏈球菌基因組中篩選具有特定裂菌作用的基因，通過構建原核表達載體，獲得具有裂菌活性的重組表達產物，確定其抗菌活性、裂菌譜、裂菌效率，以及影響表達產物活性的最優裂解條件，提供一種能夠高效裂解多種血清型的多重耐藥的豬鏈球菌、馬鏈球菌獸疫亞種及金黃色葡萄球菌的新型裂菌制劑、用途。
[0007]本發明的目的是通過以下的技術方案實現的:
[0008]第一方面，本發明涉及一種氨基酸序列如SEQ ID N0.1所示的蛋白質。該蛋白質，能夠高效裂解多種血清型多重耐藥的豬鏈球菌、馬鏈球菌獸疫亞種及金黃色葡萄球菌，因此也稱酶抗生素。
[0009]第二方面，本發明涉及一種編碼如上述蛋白質的核苷酸。
[0010]優選地，所述核苷酸的序列如SEQ ID N0.2所示。
[0011]第三方面，本發明涉及一種上述蛋白質的制備方法，包括如下步驟:
[0012]步驟一:根據最新文獻，在GenBank檢索相應的基因序列，分析可疑編碼裂解酶的基因，設計引物，以豬鏈球菌菌株基因組DNA為模板，采用PCR技術擴增相應的基因片段，片段大小為738bp ；
[0013]步驟二:米用原核表達系統pET_28a(+),將步驟一擴增所得DNA序列構建重組質粒 pET-28a (+)-LySS7 ；
[0014]步驟三:將步驟二的重組質粒轉化到表達載體(大腸桿菌BL21(DE3))中，篩選陽性克隆進行蛋白的誘導表達和鑒定，獲得重組蛋白LySS7，重組蛋白分子量為29.8kDa ；
[0015]步驟四:采用平板裂解實驗，以一株豬鏈球菌2型為裂解菌，確定步驟三獲得的重組蛋白LySS7的裂菌特性；
[0016]步驟五:高效誘導表達并純化具有裂菌活性的重組蛋白，得到具有生物活性的酶抗生素，測得該酶抗生素的濃度為3.27mg/ml，產量為32.7mg/L。
[0017]上述新型酶抗生素的制備方法還包括對該酶抗生素進行性能驗證的步驟，具體包括如下步驟:
[0018]步驟六:以豬鏈球菌2型菌株HA9801為裂解菌采用濁度遞減實驗測定該酶抗生素的裂解效率、活性單位。酶活性單位為2nunit/ml,626unit/mg,每單位所含的LySS7重組蛋白的量為1.60yg;
[0019]步驟七:確定該酶抗生素的裂菌譜，所用裂解菌為不同血清型的多重耐藥的豬鏈球菌菌株、馬鏈球菌獸疫亞種、金黃色葡萄球菌菌株、沙門氏菌、枯草芽孢桿菌和大腸桿菌。該酶抗生素對沙門氏菌，枯草芽孢桿菌和大腸桿菌不具有裂解活性，對多種血清型的多重耐藥的豬鏈球菌、馬鏈球菌獸疫亞種及金黃色葡萄球菌均具有裂解活性；
[0020]步驟八:確定該酶抗生素發揮作用的最佳條件:最適裂解溫度和最適裂解pH。最適裂解溫度為37°C，最適裂解pH為5.5 ;
[0021]步驟九:確定該酶抗生素的穩定性，穩定性包括4°C下放置一個月的穩定性和-80°C與室溫反復凍融10次后的穩定性。4°C放置一個月裂菌制劑的活性單位由2nunit/ml降為28unit/ml，-80°C與室溫反復凍融10次后裂菌制劑的活性單位由2nunit/ml降為29unit/ml，說明該酶在4°C放置一個月和_80°C與室溫反復凍融10次后仍具有很高的裂菌活性。
[0022]優選地，步驟一中，所述引物具體為:上游引物的序列如SEQ ID N0.3所示，下游引物的序列如SEQ ID N0.4所示。
[0023]優選地，步驟四中，所述平板裂解實驗:以豬鏈球菌2型菌株HA9801為裂解菌與獲得的重組蛋白粗提液進行平板裂解實驗，具體操作為將50ml OD600 = 1.0的HA9801菌液，PBS洗滌三次后用ImlPBS重懸獲得細菌重懸液，將細菌重懸液與已融化的40°C左右的
0.7 %的THB上層瓊脂混勻，制備雙層瓊脂平板，室溫放置約20min至完全凝固，用打孔器在瓊脂平板表面打孔，直徑為10mm，共打6個孔，設置兩個組，實驗組和對照組，每組設置三個重復，加樣時，實驗組每孔加入40 μ L的重組蛋白粗提液，對照組每孔加入等量的空載體粗提液。37°C溫箱放置4h左右，觀察有無裂菌圈。實驗結果顯示實驗組能夠形成明顯的裂菌圈，對照組不能夠形成裂菌圈。該重組蛋白能夠裂解豬鏈球菌，具有裂菌活性。
[0024]優選地，所述步驟六中測定該酶抗生素酶解活性具體為:倍比稀釋該酶抗生素，分別取100 μ L不同稀釋梯度的酶抗生素加入96孔板中，OD600 = 1.0的ΗΑ9801菌液，PBS洗滌三次后重懸至OD65tl = 0.6，取10yL處理好的菌液與不同稀釋梯度的酶抗生素混勻，測定混合物在650nm處的吸光值即OD65tl作為初始值。將96孔板放置在37°C溫箱中，孵育30min后，測定混合物在650nm處的吸光值作為終止值。根據兩次讀數計算細菌濁度下降的百分數，從而確定該酶抗生素的活性單位。該酶抗生素的活性單位為2nUnit/ml，626Unit/mg，每單位所含的LySS7重組蛋白的量為1.60 μ g0
[0025]優選地，所述步驟七中確定酶抗生素的裂菌譜具體為:采用濁度遞減實驗，將等量的該酶抗生素與不同的裂解菌在37°C條件下孵育30min，計算細菌濁度下降的百分數，從而確定該酶抗生素對部分菌種的裂解活性。結果表明該酶抗生素不能夠裂解大腸桿菌和李斯特菌，對多重耐藥的豬鏈球菌2型、7型、9型、馬鏈球菌獸疫亞種和金黃色葡萄球菌都具有裂解作用，對豬鏈球菌2型中的大部分菌株裂菌活性較高。
[0026]優選地，所述步驟八中確定該酶抗生素發揮作用的最適裂解溫度具體為:采用濁度遞減實驗，以豬鏈球菌2型菌株HA9801為裂解菌，分別測定在22°C、27°C、32°C、37°C和42°C條件下孵育30min后細菌濁度下降百分數，其中細菌濁度下降百分數最大的對應的孵育溫度即為該酶抗生素的最佳作用溫度。實驗結果表明，37°C孵育時能夠使細菌濁度下降百分數達到最大，該酶抗生素的最佳裂解溫度為37°C。
[0027]優選地，所述步驟八中確定該酶抗生素發揮作用的最適裂解pH具體為:用pH4.5、ρΗ5.5、ρΗ6.0、ρΗ6.5、ρΗ7.0、ρΗ7.5、ρΗ8.0和ρΗ8.5的不同緩沖液處理該酶抗生素，采用濁度遞減實驗，以豬鏈球菌2型菌株ΗΑ9801為裂解菌，37°C條件下反應30min，計算細菌濁度下降百分數，能夠使細菌濁度下降百分數達到最大的為該重組蛋白發揮作用的最適裂解pH。該重組蛋白對pH不敏感，在pH4.5的酸性條件和pH8.5的堿性條件下都具有較強的裂菌活性，pH5.5時細菌濁度下降百分數稍高于其它pH下的濁度下降百分數，所以該酶抗生素的最適裂解pH為5.5。
[0028]優選地，所述步驟九中確定該酶抗生素4°C穩定性具體為:將該酶抗生素在4°C冰箱中放置一個月，期間分別間隔5天、15天、20天、25天和30天的時候，取出部分酶抗生素，以豬鏈球菌2型菌株HA9801為裂解菌，采用濁度遞減實驗，測定該酶抗生素的活性單位，該酶抗生素在4°C冰箱放置一個月活性單位由2nunit/ml降為28unit/ml，表明該酶仍具有很高的裂菌活性。
[0029]優選地，所述步驟九中確定該酶抗生素-80°C與室溫條件下反復凍融的穩定性具體為，將該酶抗生素放置在-80°C冰箱中30min至完全凝固，取出該酶抗生素，放置在室溫條件下至完全融化，采用濁度遞減實驗以HA9801為裂解菌測定酶抗生素的活性單位，如此操作反復凍融10次，確定酶抗生素的穩定性，該酶抗生素經過-80°C和室溫反復10次凍融后活性單位由原來的2nunit/ml降為29unit/ml，表明該酶仍具有很高的裂菌活性。
[0030]第四方面，本發明涉及一種上述的蛋白在制備革蘭氏陽性菌裂解藥物中的用途。
[0031]優選地，所述革蘭氏陽性菌為多重耐藥的豬鏈球菌、馬鏈球菌獸疫亞種、金黃色葡萄球菌中的一種或幾種。更優選為豬鏈球菌、馬鏈球菌獸疫亞種和金黃色葡萄球菌。
[0032]優選地，所述豬鏈球菌菌株有2型菌株:SS2-l、05-465、19-2 (A)、5-2、ZY05719、HA9801、HA9802、HA05729-1、29、SS2-H、11-1、SS2-4、006731 ；7 型菌株 SS7 和 9 型菌株 SS9 ；馬鏈球菌獸疫亞種菌株ATCC35246 ;金黃色葡萄球菌菌株有耐甲氧西林金黃色葡萄球菌菌株:PNB49、DL44-2、SD2-17-1、DL57-3、DZ92、PNB5、PNB25、PNB31、DL56-1 和普通金黃色葡萄球菌菌株:05P361、05Q132、ATCC25913、05L189、K185、B52。
[0033]第五方面，本發明涉及一種使用上述的蛋白進行裂菌的方法，包括如下步驟:采用常規方法進行裂解；
[0034]其中，裂解使用的緩沖液包含PBS緩沖液、CH3COOH-CH3COONa緩沖液、NaH2PO4-Na2HPO4 緩沖液、HCl-Tris 緩沖液；
[0035]緩沖液濃度為10~20mM ；
[0036]裂解酸度為ρΗ4.5~8.5 ;
[0037]裂解溫度為22~42°C。
[0038]本發明的原理在于:根據該酶抗生素的基因序列設計引物，采用PCR技術擴增目的片斷，將目的片斷與pET-28a(+)載體連接，得到重組高效表達質粒，導入表達載體大腸桿菌BL21(DE3)中，陽性克隆檢驗獲得陽性克隆，誘導，表達獲得重組蛋白，通過Ni柱純化獲得純化的酶抗生素，分子量為29.8kDa，命名為LySS7，在體外可高效裂解多種血清型多重耐藥的豬鏈球菌、馬鏈球菌獸疫亞種和金黃色葡萄球菌。
[0039]與現有技術相比，本發明具有如下的有益效果:本發明通過原核表達系統高效表達了具有高效裂解多種病原細菌的酶抗生素，可大量獲得純化的有活性的酶抗生素，測定了最優的裂菌條件，該酶抗生素在體外高效、特異性裂解多種血清型多重耐藥的豬鏈球菌、馬鏈球菌獸疫亞種及金黃色葡萄球菌。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0040]通過閱讀參照以下附圖對非限制性實施例所作的詳細描述，本發明的其它特征、目的和優點將會變得更明顯:
[0041]圖1為采用SDS-PAGE鑒定純化的重組表達蛋白LySS7的示意圖；
[0042]圖2為以豬鏈球菌2型菌株HA9801為裂解菌，通過平板裂解實驗檢驗LySS7重組蛋白粗提液活性的示意圖；
[0043]圖3為以豬鏈球菌2型菌株HA9801為裂解菌，測定該重組蛋白活性單位的示意圖；
[0044]圖4為通過濁度遞減實驗測定該重組蛋白的裂菌譜的示意圖；
[0045]圖5為以豬鏈球菌2型菌株HA9801為裂解菌，測定該重組蛋白的最適反應溫度的示意圖；
[0046]圖6為以豬鏈球菌2型菌株HA9801為裂解菌，測定該重組蛋白最適反應pH的示意圖；
[0047]圖7為以豬鏈球菌2型菌株HA9801為裂解菌，測定該重組蛋白4°C條件下的穩定性示意圖；
[0048]圖8為以豬鏈球菌2型菌株HA9801為裂解菌，測定該重組蛋白_80°C和室溫反復凍融10次后的穩定性的示意圖。

【具體實施方式】
[0049]下面結合具體實施例對本發明進行詳細說明。以下實施例將有助于本領域的技術人員進一步理解本發明，但不以任何形式限制本發明。應當指出的是，對本領域的普通技術人員來說，在不脫離本發明構思的前提下，還可以做出若干變形和改進。這些都屬于本發明的保護范圍。下面實施例中，未注明具體條件的實驗方法，通常按照常規條件，例如Sambrook 等分子克隆:實驗室手冊(New York:Cold Spring Harbor Laboratory Press,1989)中所述的條件，或按照制造廠商所建議的條件。
[0050]實施例1、設計引物，PCR擴增目的基因片段
[0051]參考GenBank中豬鏈球菌菌株的基因序列，設計引物，以豬鏈球菌基因組DNA為模板，采用PCR技術擴增目的基因，目的基因大小為738bp，具體操作如下:
[0052]設計引物，引物序列見表1，擴增目的基因，在上下游引物的5’端分別插入EcoR I和Hind III酶切位點。以豬鏈球菌菌株基因組DNA為模板，按照常規方法進行目的基因片段的擴增。PCR反應結束后，取10μ L產物進行1%瓊脂糖凝膠電泳，檢驗目的條帶大小。利用膠回收試劑盒回收PCR產物。
[0053]表1PCR引物序列
[0054]

【權利要求】
1.一種氨基酸序列如SEQ ID N0.1所示的蛋白質。
2.一種編碼如權利要求1所述蛋白質的核苷酸。
3.如權利要求2所述的核苷酸，其特征在于，所述核苷酸的序列如SEQID N0.2所示。
4.一種制備如權利要求1所述蛋白質的方法，其特征在于，包括如下步驟: 步驟一，設計引物，以豬鏈球菌菌株基因組DNA為模板，采用PCR技術擴增相應的基因片段，片段大小為738bp; 步驟二，采用原核表 達系統，將步驟一所得基因片段構建重組質粒pET-28a(+)-LySS7 ； 步驟三:將步驟二的重組質粒轉化到表達載體中，篩選陽性克隆進行蛋白的誘導表達和鑒定，獲得重組蛋白LySS7 ； 步驟四:采用平板裂解實驗，確定步驟三獲得的重組蛋白的裂菌特性； 步驟五:高效誘導表達并純化具有裂菌活性的重組蛋白，得到具有生物活性的蛋白LySS70
5.如權利要求4所述的方法，其特征在于，步驟一中，所述引物具體為:上游引物的序列如SEQ ID N0.3所示，下游引物的序列如SEQ ID N0.4所示。
6.一種如權利要求1所述的蛋白在制備革蘭氏陽性菌裂解藥物中的用途。
7.根據權利要求6所述的用途，其特征在于，所述革蘭氏陽性菌為多重耐藥菌株豬鏈球菌、馬鏈球菌獸疫亞種、金黃色葡萄球菌中的一種或幾種。
8.一種使用權利要求1所述的蛋白進行裂菌的方法，其特征在于，包括如下步驟:采用常規方法進行裂解； 其中，裂解使用的緩沖液包含PBS緩沖液、CHfOOH-CH3COONa緩沖液、NaH2PO4-Na2HPO4緩沖液、HCl-Tris緩沖液； 緩沖液濃度為10~20mM ； 裂解酸度為PH4.5~8.5 ; 裂解溫度為22~42°C。
【文檔編號】C12N9/88GK104073478SQ201410265205
【公開日】2014年10月1日 申請日期:2014年6月13日 優先權日:2014年6月13日
【發明者】嚴亞賢, 黃慶慶, 孫建和, 吉文匯 申請人:上海交通大學