一種聚3-羥基丙酸共聚物及其生產方法
【專利摘要】本發明公開了一種聚3-羥基丙酸共聚物及其生產方法，屬于基因工程【技術領域】。本發明通過基因整合技術在宿主菌基因組上整合甘油脫水酶基因和甘油脫水酶再激活酶基因，并導入聚羥基脂肪酸合成酶基因、丙醛脫氫酶基因、β-酮脂酰輔酶A硫解酶基因、乙酰乙酰輔酶A還原酶基因和丙酰輔酶A合成酶基因，重組后的基因工程菌具有生物合成聚3-羥基丙酸-co-3-羥基戊酸的能力。本發明首次通過生物合成的方式獲得了聚3-羥基丙酸-co-3-羥基戊酸。與聚3-羥基丙酸相比，所得的聚3-羥基丙酸-co-3-羥基戊酸具有更高的熔點和更低的結晶性，具有較佳的可降解性，可作為包裝材料、醫用植入材料、藥物緩釋材料和電化學材料。
【專利說明】一種聚3-羥基丙酸共聚物及其生產方法

【技術領域】
[0001] 本發明涉及一種聚3-羥基丙酸共聚物及其生產方法，屬于基因工程【技術領域】。

【背景技術】
[0002] 化石能源危機日益嚴重，生物燃料的制造成為研究焦點。生物柴油是生物液體燃 料中最重要的一種。伴隨著生物柴油的大量生產，其副產物甘油的大量積累。據初步估算， 每生產10噸生物柴油會制造1噸的粗甘油。生物柴油的進一步增長，造成甘油價格的不斷 降低。充分利用價格低廉的甘油生產高附加值產品，可以帶來巨大經濟效益和環境效益，受 到越來越多的重視。
[0003] 聚羥基脂肪酸酯是一種通過微生物發酵獲得的生物塑料，可以利用葡萄糖、甘油 等廉價碳源合成（Drumright RE, Gruber PR, Henton DE. Polylactic acid technology. Adv Mater, 2000 ; 12:1841 - 6.)。其物理性能與傳統塑料相似甚至優于傳統塑料，具有生物降解 性，不會造成污染，可用于制造醫療器械、包裝材料、農田地膜等。
[0004] 聚3-羥基丙酸（P3HP)是一種擁有廣闊發展前景的新型可降解塑料，具有 優異的生物材料性質和機械性能，比如具有高機械強度和拉伸強度、高斷裂伸長量、 生物降解性、生物相容性、無毒及熱塑性等（Wang Q, Liu C, Xian M, Zhang YG, Zhao G. Biosynthetic pathway for poly(3-hydroxypropionate)in recombinant Escherichia coli. J Microbiol, 2012, 50(4) :693-697. ；ffang Q, Yang P, Liu C, Xue Y, Xian M, Zhao G.Biosynthesis of poly (3-hydroxypropionate)from glycerol by recombinant Escherichia coli. BioresourceTechnol, 2013, 131:548-51. ；ffang Q, Yang P, Xian M, Yang Y, Liu C, Xue Y, Zhao G. Biosynthesis of poly(3-hydroxypropionate-c〇-3-hydroxybutyra te)with fully controllable structures from glycerol. BioresourTechnol, 2013, 142:74 1-4.)。聚3-羥基丙酸在性質上還存在一定缺陷，如熔點較低、結晶導致不透明等在一定程 度上限制了其應用（Andree β en B, Steinbuchel A. Biosynthesis and biodegradation of3 -hydroxypropionate-containing polyesters. Appl Environ Microbiol, 2010, 76 (15) : 491 9-25.) 〇


【發明內容】

[0005] 為解決上述問題，本發明提供了一種新型聚3-羥基丙酸共聚物，其結構式為：
[0006]

【權利要求】
1. 一種聚3-羥基丙酸共聚物，其特征在于，結構式如下所示：
2. -種產權利要求1所述共聚物的基因工程菌，其特征在于，在宿主菌基因組上整合 甘油脫水酶基因和甘油脫水酶再激活酶基因，并導入聚羥基脂肪酸合成酶基因、丙醛脫氫 酶基因 、β -酮脂酰輔酶A硫解酶基因、乙酰乙酰輔酶A還原酶基因和丙酰輔酶A合成酶基 因，重組后的基因工程菌具有生物合成聚3-羥基丙酸-co-3-羥基戊酸的能力。
3. 權利要求2所述基因工程菌，其特征在于，所述宿主菌為大腸桿菌。
4. 權利要求2所述基因工程菌，其特征在于，所述甘油脫水酶基因來源于Klebsiella pneumoniae的dhaB基因；甘油脫水酶再激活酶基因為來源于Klebsiella pneumoniae的 gdrAB基因；聚輕基脂肪酸合成酶基因來源于Ralstonia eutrophaH16的phaCl基因；丙醒 脫氫酶基因來源于Salmonella typhimurium的pduP基因；β -酮脂酰輔酶A硫解酶基因來 源于Ralstonia eutrophaH16的bktB基因；乙酰乙酰輔酶A還原酶基因來源于Ralstonia eutrophaH16的phaBl基因；丙醜輔酶A合成酶基因來源于Chloroflexiaurantiacus的 pcs'基因。
5. -種產權利要求1所述共聚物基因工程菌的構建方法，其特征在于，步驟如下： 1) 宿主菌基因的整合：將甘油脫水酶基因 dhaB和甘油脫水酶再激活酶基因 gdrAB整 合到宿主菌基因組上，獲得基因整合宿主菌； 2) 重組質粒的構建：分別構建含有丙醛脫氫酶基因 pduP、聚羥基脂肪酸合成酶基因 phaCl重組質粒和含有β -酮脂酰輔酶A硫解酶基因 bktB、乙酰乙酰輔酶A還原酶基因 phaBl、丙酰輔酶A合成酶基因 pcs'的重組質粒； 3) 基因工程菌的構建：將步驟2)所得的兩個重組質粒導入步驟1)所得的基因整合宿 主菌，獲得基因工程菌。
6. 權利要求5所述方法，其特征在于，步驟1)所述宿主菌基因的整合，是通過搭橋 PCR得到目的片段gdrAB-dhaB片段，以自殺質粒pRE112為媒介與大腸桿菌進行同源重 組將gdrAB-dhaB整合到大腸桿菌基因組中得到基因整合宿主菌；步驟2)所述重組質粒 的構建，是通過克隆丙醛脫氫酶基因 pduP和聚羥基脂肪酸合成酶基因 phaCl，通過搭橋 PCR得到目的基因片段phaCl-pduP，再將目的基因片段和質粒pET21a進行雙酶切并酶連 后得到重組質粒pET21a-phaCl-pduP ;通過克隆β -酮脂酰輔酶A硫解酶基因 bktB，同時 克隆乙酰乙酰輔酶A還原酶基因 phaBl和丙酰輔酶A合成酶基因 pcs'，通過搭橋PCR得 到目的基因片段bktB-phaBl-pcs'，將目的基因片段和質粒pBAD18進行雙酶切并酶連后 得到重組質粒pBAD18-bktB-phaBl-pcs' ；步驟3)所述基因工程菌的構建，是將重組質粒 pET21a-phaCl-pduP和重組質粒pBAD18-bktB-phaBl-pcs'導入到基因整合宿主菌中，獲得 重組大腸桿菌。
7. 權利要求5或6所述方法，其特征在于，所述甘油脫水酶基因來源于Klebsiella pneumoniae的dhaB基因；甘油脫水酶再激活酶基因為來源于Klebsiella pneumoniae的 gdrAB基因；聚輕基脂肪酸合成酶基因來源于Ralstonia eutrophaH16的phaCl基因；丙醒 脫氫酶基因來源于Salmonella typhimurium的pduP基因；β -酮脂酰輔酶A硫解酶基因來 源于Ralstonia eutrophaH16的bktB基因；乙酰乙酰輔酶A還原酶基因來源于Ralstonia eutrophaH16的phaBl基因；丙醜輔酶A合成酶基因來源于Chloroflexiaurantiacus的 pcs'基因。
8. -種發酵生產聚3-羥基丙酸-co-3-羥基戊酸的方法，其特征在于，步驟如下： 1) 宿主菌基因的整合：將甘油脫水酶基因 dhaB和甘油脫水酶再激活酶基因 gdrAB整 合到宿主菌基因組上，獲得基因整合宿主菌； 2) 重組質粒的構建：分別構建含有丙醛脫氫酶基因 pduP、聚羥基脂肪酸合成酶基因 phaCl和β -酮脂酰輔酶A硫解酶基因 bktB、乙酰乙酰輔酶A還原酶基因 phaBl、丙酰輔酶 A合成酶基因 pcs'的重組質粒； 3) 基因工程菌的構建：將步驟2)所得的兩個重組質粒導入步驟1)所得的基因整合宿 主菌，獲得基因工程菌； 4) 利用步驟3)得到的基因工程菌發酵生產聚3-羥基丙酸-co-3-羥基戊酸。
9. 權利要求8所述方法，其特征在于，所述宿主菌為大腸桿菌；所述甘油脫水酶基因來 源于Klebsiella pneumoniae的dhaB基因；甘油脫水酶再激活酶基因為來源于Klebsiella pneumoniae的gdrAB基因；聚輕基脂肪酸合成酶基因來源于Ralstonia eutrophaH16的 phaCl基因；丙醒脫氫酶基因來源于Salmonella typhimurium的pduP基因 ；β -酮脂 酰輔酶Α硫解酶基因來源于Ralstonia eutrophaH16的bktB基因；乙酰乙酰輔酶Α還 原酶基因來源于Ralstonia eutrophaH16的phaBl基因；丙酰輔酶A合成酶基因來源于 Chloroflexiaurantiacus 的 pcsJ 基因。
10. 權利要求1所述共聚物，其特征在于，用于包裝材料、醫用植入材料、藥物緩釋材料 和電化學材料中。
【文檔編號】C12P7/62GK104046659SQ201410272402
【公開日】2014年9月17日 申請日期:2014年6月18日 優先權日:2014年6月18日
【發明者】咸漠, 趙廣, 馮新軍 申請人:中國科學院青島生物能源與過程研究所