攜帶eb病毒核抗原1的重組腺病毒疫苗及其應用的制作方法
【專利摘要】本發明屬于疫苗制備領域，公開了一種攜帶EB核抗原1基因片段的重組腺病毒疫苗，該重組腺病毒疫苗是由EB核抗原1基因片段插入到腺病毒載體構建而成；該EB核抗原1基因片段編碼EB核抗原1的C端氨基酸序列。本發明的疫苗可用于癌癥的預防和治療。
【專利說明】攜帶EB病毒核抗原1的重組腺病毒疫苗及其應用
[0001]

【技術領域】
[0002]本發明涉及疫苗制備領域。具體而言，本發明涉及攜帶攜帶EB病毒核抗原I疫苗。更具體地說，本發明涉及經所述的攜帶EB病毒核抗原I的重組腺病毒疫苗以及與其他疫苗聯合應用。
[0003]

【背景技術】
[0004]世界衛生組織下屬的國際癌癥研究機構提供的新數據顯示，2012年全球新增約1410萬例惡性腫瘤病例，死亡人數達820萬。鼻咽癌(Nasopharyngeal carcinoma, NPC)在各種惡性腫瘤中具有獨特的流行病學特征，在世界上大多數國家很罕見，發病率在1/100000以下。而在我國南方很常見，嚴重危害人民的生命和健康，尤其是我國的廣東、廣西一些地區；大部分鼻咽癌發生在45?54歲年齡組，嚴重影響勞動力健康。鼻咽癌發病率在腫瘤中位于第一、二位，被稱為“廣東癌”。
[0005]鼻咽癌是一種起源于鼻咽部上皮組織的常見惡性腫瘤。目前，放射治療是鼻咽癌首選的治療方案，按照分層綜合治療原則，多數早期病例采用單純放射治療，少數放射敏感性差的腫瘤和晚期病例可加輔助化療或增敏劑等，以提高療效。但中晚期鼻咽癌治療后常常復發或向遠處轉移，對于該類患者在臨床上尚無有效治療方案。
[0006]EB病毒和鼻咽癌密切相關，而且有一致性。EB病毒抗體，尤其是IgA/VCA抗體，在鼻咽癌患者中明顯高于對照組；腫瘤存在與消退與抗體滴度呈正相關，而與患者所在地理位置和種族差別無關；在未分化和高分化的鼻咽癌中能恒定地發現EB病毒基因組和EB病毒相關抗原；EB病毒含有能使B淋巴細胞、猴腎和人類上皮細胞發生轉化和不斷增殖的基因；咽部正常細胞膜和鼻咽癌細胞均有EB病毒受體的存在。雖然病毒能進入咽部正常上皮細胞內，而且腫瘤中也存在病毒基因組，但病毒在鼻咽癌發生中的作用機制還未被證實。
[0007]病毒在活體內的感染是一個復雜的過程，包括病毒的潛伏、活化、轉化復制等。鼻咽癌患者的腫瘤組織以及外周血淋巴細胞中存在著EB病毒潛伏感染。在已分化和未分化上皮細胞中可發現EB病毒基因組和潛伏基因產物；所有鼻咽癌都表達EB病毒編碼的潛伏蛋白和EBNAl。EB病毒所表達的潛伏抗原中，LMPl被認為在鼻咽癌發生中起關鍵性作用，它可以誘發細胞增生并影響細胞生長調控機制，被認為是EB病毒的一個致癌基因。NPC患者的血清中存在EBV特異性的IgA/VCA抗體，在NPC組織中存在EBV核酸和基因的表達。在NPC患者血清中發現了 EBV DNA的增殖。這些結果引導人們將EB病毒基因作為EBV相關腫瘤的特異性免疫靶抗原。
[0008]EB病毒主要通過唾液傳播，世界上大多數人都感染了 EB病毒，一旦感染終身攜帶。但多數人安然無恙，僅有少數個體發展成為NPC，顯然EBV特異性細胞免疫在控制病毒、防止腫瘤發生中起到了重要的作用。同時有特異性細胞毒性T淋巴細胞(cytotoxic Tlymphocyte, CTL),它控制EB病毒轉化的B淋巴細胞，這種特異性的細胞免疫是受HLA所限制的。并發現具有這種特異活性的T細胞識別表位。近年來，經過研究和詳細分析已證明LMPULMP2均能誘發特異性CTL反應。細胞免疫在對病毒活化的“監視”和清除轉化的B細胞中起著關鍵性作用。
[0009]NPC細胞的EBV抗原表達主要局限在EBNAl和LMP1、LMP2上。LMPl作為EBV重要的致瘤蛋白，在許多EBV相關疾病中扮演重要的角色，是EB病毒細胞免疫反應的刺激劑和靶抗原，尤其是N段的蛋白區域，提供了 EB病毒誘導的特異性細胞毒性殺傷反應的靶抗原，在早前就有證實LMPl蛋白序列中有特異性CTL識別表位，具有激發細胞免疫的能力，但該基因具有潛在的致癌性。LMP2也是在NPC等EBV相關腫瘤中持續表達的病毒蛋白之一。LMP2不引起B淋巴細胞的轉化，無致癌性。并且LMP2蛋白序列中存在多個可被人CTL識別的抗原表位，不同的人HLA分型識別不同的抗原表位，而且LMP2也能刺激轉基因小鼠細胞系的CTL反應。國際上已經用LMP2作為治療性疫苗，用于NPC的臨床試驗。我們科室構建的包含該基因的重組腺病毒疫苗已經完成臨床I期試驗，并申報臨床I1、111期試驗。構建的痘苗病毒疫苗，正處于臨床前的藥效學實驗階段。
[0010]EBNAl蛋白中包含一段甘氨酸-丙氨酸重復區(Gly-Ala repeat reg1n),具有阻止EBNAl全長蛋白的降解，抑制其遞呈給CD8+T細胞的作用，這種潛在的免疫抑制作用限制了其在EBV相關腫瘤免疫治療中的應用，尤其限制了伯爾基特淋巴瘤(Burkitt lymphoma,BL)的CTL治療。
[0011]EBV核抗原I (EB nuclear antigenl, EBNA1)是在NPC組織細胞中有限表達的幾種抗原之一，也是唯一在EBV潛伏感染和活化狀態中均表達的抗原。早期研究顯示=EBNAl表達產物為DNA結合蛋白，是EB病毒在腫瘤細胞中維持潛伏感染狀態及DNA復制的關鍵因子，是重要的致細胞轉化蛋白，同時，可以誘導體液免疫應答，在NPC病人中可以檢測到IgG/ENBAl和IgA/EBNAl抗體。近年研究發現EBNAl蛋白序列中含有的⑶4+ T細胞表位，在特異性的CD4 +T細胞介導的細胞免疫反應中起重要的調節作用。
[0012]EBNAl由EBV BamHIK基因編碼，長1923bp，無內含子，編碼641個氨基酸。依據EBNAl氨基酸序列特點將其分成3部分，N端(1-89):由89個氨基酸組成；G_Ar重復序列(90-327):由多個“甘氨酸和丙氨酸”組成的重復序列;C端(328-641):含有多個⑶4T細胞識別表位。其中1-89位和322-379位氨基酸殘基，互相協調共同介導病毒基因組以附加體的形式連接細胞染色體上并持續存在。
[0013]近年研究發現EBNAl C-末端(380-641位氨基酸)具有明顯特異性⑶4 + T細胞表位，對比而言很少能看到針對于潛伏膜蛋白(LMP1、2)表位的反應(EBNA1、EBNA3C>>LMP1和LMP2)。在我國鼻咽癌高危人群中EBNAl多肽表位明顯集中在EBNAl的C-末端區域，包括DP5-限制性多肽表位，被近一半的檢測志愿者所識別，引起DP5-陽性靶細胞對EBNAl的識別[27]。文獻報道，在EBNAl中可能有28條⑶4 T細胞識別表位，而目前能夠確定的只有10條(DP3, DP5, DQ2, DQ7, DRl, DR7, DR11，DR14，DR15, DR103)。CD4 + T 細胞主要分為兩個亞群輔助性T細胞(Thl和Th2)，是抗病毒抗體和CTL產生過程中所必需的輔助細胞，同時產生細胞因子如IFN-Y和TNF等直接發揮抗病毒作用，參與機體的體液免疫和細胞免疫應答。有研究表明，EBNAl的51個重疊多肽(aa400-641)刺激⑶4+特異性記憶T細胞和IFN- Y的釋放，單獨的EBNAl多肽不能檢測到CTL應答，但對包含有EBNAl (aa73_487)或EBNAl(aa494-508)的多聚抗原表位卻呈現較強的應答反應。在14例EBV陽性淋巴組織增生性疾病患者中有9例患者可成功產生EBNAl特異性⑶8+效應T細胞[28]。健康人體優先識別EBNAlC-末端部分區域(aa452-548)，患者的CD4+T細胞對整個C-末端區域(aa400_641)有較廣泛的識別作用，人類白細胞DR限制性EBNAl (aa481-500)表位形成部分C-末端螺旋區域。EBNAl (aa458 - 641)可被CD4-T細胞表位識別，EBNAl (aa401_641)表位的形成也已被[29]報道。人類白細胞DR限制性EBNAl(aa514-527)表位來自EBV游離體，該表位形成部分β_片層結構。EBNAl (aa561-573)對特異性CD4+T細胞同時具有很高的親和力，因此該多肽可用于T細胞識別強有力的刺激物并可被HLA-DRl1、-DRl2或-DR13分子遞呈。數據顯示，該多肽優先誘導⑶4+調節性T細胞，EBNAl (aa518-530)多肽優先誘導⑶4+效應T細胞；605-641位氨基酸殘基的肽段存在一個酸性激活的結構域，該羧基末端具有較強的免疫原性:EBNA1 (aa607-619)特異性⑶4+T細胞對MHC-1類多肽具有很強的親和力，可被常見的HLA-DQ2分子遞呈。
[0014]EBNAl在特異性細胞免疫應答中起重要的作用。在EB病毒感染導致的伯爾基特淋巴瘤細胞中，EBNAl在以附加體形式存在的細胞中呈現明顯負調控效應。EBNAl特異性⑶4 + T細胞系，包括⑶4+輔助T細胞和調節T細胞，具有雙重效應，既可刺激新生⑶4+和CD8+T細胞的增殖反應，也可誘導T細胞免疫抑制。在器官移植者中，循環中的EBV特異性的⑶8 + T細胞功能和數量依賴于⑶4 + T細胞的數量。絕對低的⑶4 + T細胞數量，大大增加了移植后淋巴細胞增生性疾病風險。一些報道稱EBNAl特異性的⑶4T細胞在體外能抑制EBV感染的B細胞生長，EBV特異性的⑶4+T細胞在T細胞基礎上的治療可能發揮重要的作用。在EBV相關腫瘤中和細胞系中，EBNAl在細胞核中的定位影響CD4+T細胞表位的展示，其轉錄與表達決定EBV陽性腫瘤細胞生長，EBNAl特異性的CD4+T細胞識別EBV轉化B細胞系，翻譯效率影響CD8+T細胞識別表位的抗原提呈。對NPC的研究，由于NPC細胞僅選擇性的穩定表達EBNAl和LMP1、2，因而EBNAl可能在特異性的⑶4 + T介導的細胞免疫反應中起重要的調節作用。
[0015]鑒于EBNAl在特異性的⑶4 + T介導的細胞免疫反應中起重要的作用，目前已經有把EBNAl作為治療NPC疫苗的報導。Taylor等將EBV的EBNAl的CD4細胞識別表位集中區域(363-641位氨基酸)基因和LMP2全長的全長基因連接起來創建了 EL融合基因，構建了重組安卡拉痘苗病毒疫苗人(rMVA-EL)，表達嵌合抗原，以此激活特異性的⑶4+和⑶8+T細胞的免疫應答。結果表明在EBV陽性的白人和華人中，rMVA-EL可以激活記憶性CD4+和⑶8+T免疫應答。并且，高的免疫劑量激發更強程度的EBNA1/LMP2應答水平。目前rMVA-EL已經在英國和香港完成了 I期臨床試驗，正在進行II期臨床試驗。Lutzky VP等利用非復制型的腺病毒5/F35載體(Ad5F35)將LMP1、LMP2和EBNAl氨基酸序列以30個氨基酸長度為一個肽段依次進行分割，相鄰肽段之間有15個氨基酸重疊，然后利用計算機軟件將各肽段隨機串聯，拼接成一個全新的蛋白序列，其中LMPl去除11個氨基酸共5個拷貝的重復區，EBNAl去除283個甘氨酸一丙氨酸重復區。然后，根據新蛋白序列合成的6869bp的cDNA，依據密碼子偏愛性選擇第一或第二密碼子，避免重疊氨基酸的編碼相同，插入到Ad5F35載體中構建一個新的抗原拼接疫苗(Ad-SAVINE)。實驗表明構建的Ad-SAVINE可以激活健康人和鼻咽癌患者的LMP特異性的細胞免疫應答。Smith等用Ad-SAVINE疫苗對復發和轉移的NPC患者進行正規臨床試驗效果評估。在24個參加試驗的病人中，16個病人EBV特異性的CTL水平明顯升高(72.7%)，6個僅有微小或沒有增加。在過繼性免疫治療后，EBNAl和LMPl、LMP2特異性CTL增加的NPC患者出現一度流感樣癥狀或輕微不適。NPC的生存期38?420d，均值136d，同沒有接受T細胞的比較，平均生存期從22(T523d。結果表明Ad-SAVINE疫苗進行過繼性免疫治療安全性和耐受性良好，可以使NPC患者臨床受益。盡管如此，EBNAl對于具有CD8+T細胞識別表位的LMP2特異性細胞免疫應答的影響，還不清明確。因此，根據EBNAl本身的特性構建質粒，以EBNAl作為一種T細胞治療腫瘤的有限靶抗原，也是目前研究的新熱點，將為EB病毒相關腫瘤的靶向性基因治療提供一個更新、更有效的途徑。
[0016]


【發明內容】

[0017]基于本科室在EB病毒相關重組疫苗的研究基礎，依據EBNAl基因特異性及腺病毒的廣泛應用，我們將構建EBNAl蛋白羧基末端序列939bp重組腺病毒pDC316_EBNAl質粒，使用AdMax包裝系統:其包裝系統包括pBHG骨架質粒，穿梭質粒，HEK293細胞，通過Cre/LoxP獲得重組病毒，這個過程發生在293細胞中，得到的重組病毒是El缺失的復制缺陷型腺病毒，病毒在不能夠提供El區的細胞中只能實現外源基因的表達而本身不具備增殖能力。具體而言，本發明涉及經所述的攜帶EB病毒核抗原I的重組腺病毒疫苗和與其疫苗聯合的疫苗。本發明還提供了攜帶EB病毒核抗原I的重組腺病毒疫苗的制備方法。
[0018]EB病毒與許多人類腫瘤相關,其中EBV核抗原I (EB nuclear antigenl,EBNA1)是在NPC組織細胞中有限表達的幾種抗原之一，也是唯一在EBV潛伏感染和活化狀態中均表達的抗原。EBNAl蛋白中含有⑶4+T細胞識別表位，但其中也中包含一段甘氨酸-丙氨酸重復區(Gly-Ala repeat reg1n),具有阻止EBNAl全長蛋白的降解,抑制其遞呈給⑶8+T細胞的作用，這種潛在的免疫抑制作用限制了其在EBV相關腫瘤免疫治療中的應用，因此，結合我們在EBV疫苗研究方面的工作，通過基因工程手段改造的EBNA1(去除重復序列)，同時攜帶該基因的疫苗對其他攜帶EBV相關基因疫苗細胞免疫應答的起促進作用的部分。
[0019]本發明的發明人成功構建了一種復制缺陷型的重組腺病毒，該病毒攜帶外源基因，所述的外源基因編碼的蛋白是一種能夠很好的引發CTL反應和增強其他特異性的CTL反應的抗原。本發明的具體實施方案中，所述的外源基因為EB病毒核抗原I編碼的基因(EBNA1)，這種攜帶有EB病毒核抗原I編碼的基因的復制缺陷型重組腺病毒簡稱^rAd-EBNAl或含有EBNAl基因的重組腺病毒。所述的rAd-EBNAl滴度不小于IX 101° VP/mL，可在體內誘導EBNAl特異性的抗體生成反應和細胞毒性淋巴細胞反應。本發明的一個優選實施方案中，該重組病毒的滴度為IXlO13 VP/mL.本發明的一個優選實施方案中，所述的rAd-EBNAl是利用Admax系統構建的。
[0020]簡而言之，為了得到本發明所述的rAd-EBNAl，我們首先PCR法擴增B95-8細胞株中EBV ebnal基因的C-端部分片段，經I和汝^ II酶切位點插入pDC316穿梭質粒。測序比對正確后，與腺病毒骨架質粒PBHG共轉染293細胞。收集病變后細胞，獲得的重組病毒顆粒。并進一步在293細胞擴增和純化，獲得高純度病毒。
[0021]PCR擴增獲得939 bp 基因片段，通過I和及^7 II酶切位點插入，獲得重組穿梭質粒PDC316-EBNA1，測序結果與標準株序列一致。pDC316_EBNAl和骨架質粒pBHG共轉染293細胞后，細胞出現病變，獲得含EBV 基因片段的重組腺病毒(rAd-EBNAl)。流式細胞術和Western blot檢測結果證實，EBNAl在293細胞中表達，電鏡下觀察到典型的腺病毒顆粒，病毒二代滴度可達18 TCID5(l/mL。進一步擴增可獲得重組病毒的滴度為I X 113 VP/mL.另一方面，本發明提供了攜帶EBNAl基因的rAd-EBNAl。在一個具體的實施方案中，本發明提供了經本發明所述的rAd-EBNAl。本發明中所述的重組腺病毒是E1、E3基因缺失的非復制型腺病毒5型載體系統一AdMax?系統。腺病毒載體是基因治療中發展最為成熟的載體系統。具有安全性高、穩定性好、宿主細胞范圍廣泛、對人致病性低、規?；蜕虡I化程度高、同時表達多個基因等優點。因而已在基因工程疫苗研制和基因治療中顯示出巨大的應用前景。AdMax?腺病毒系統是由腺病毒載體鼻祖Dr.Frank Graham在1999年創建的一套重組腺病毒構建系統，該系統基本原理是通過Cre-1oxP重組酶，使共轉染到293細胞中的腺病毒載體穿梭質粒和骨架質粒在重組酶的作用下產生重組腺病毒，得到的重組病毒是E1/E3缺失的復制缺陷型腺病毒。與其他腺病毒包裝系統相比，該系統表現出明顯的優勢，具有出毒速度快(7-10d)、效率高(高約100倍)、可信度高(序列<7-8kb，外源蛋白對腺病毒沒有毒性，可以完全表達)、過程簡單(僅需構建穿梭質粒和共轉染兩步)優勢。
[0022]本文中所述的含EBV EBNAl基因片段的rAd-EBNAl疫苗，表達外源基因編碼的蛋白抗原。其中所述的外源基因為EBNAl蛋白基因。
[0023]本文中所述的rAd-EBNAl，表達外源基因編碼蛋白復制缺陷型rAd-EBNAl疫苗。
[0024]另一方面本發明提供的一種制備rAd-EBNAl疫苗的方法包括:
Cl) 本實驗成功從B95-8細胞中獲取EBV EBNAl基因片段；
(2)構建了重組穿梭質粒PDC316-EBNA1 ;
(3)在293細胞內包裝出重組腺病毒rAd-EBNAl，并表達了 EBNAl蛋白。
[0025](4) 用如上方法的到rAd-EBNAl疫苗。
[0026]在一個具體的實施方案中，其中所述的腺病毒穿梭質粒是PDC316。
[0027]在一個具體的實施方案中，其中所述的腺病毒骨架質粒是pBHG。
[0028]在一個具體的實施方案中，其中所述的腺病毒包裝細胞是293細胞。
[0029]試驗證明本發明所述的rAd-EBNAl能夠在體外激發EBNAl特異性的CTL，同時對LMP2特異性CTL反應起增強作用。
[0030]本發明所述的rAd-EBNAl疫苗，用于治療和預防EBV相關腫瘤的疫苗和藥物用途。在一個具體的實施方案中所述的疫苗為rAd-EBNAl疫苗，所述的腫瘤為鼻咽癌。
[0031]根據給藥的途徑不同，可將本發明的疫苗組合配置成靜脈、肌肉內、體腔內、組織內、皮內或皮下給藥的可注射溶液或分散劑。
[0032]為了制備注射溶劑，例如可以使用無菌蒸餾水、注射用水、磷酸緩沖液、以及含有乙醇、多元醇的溶劑或分散介質作為載體或稀釋劑。在任何情況下，所述的可注射制劑均應是無菌和可流動并適合于通過注射器注射給藥的。
[0033]也可用于制藥工業中已知的方法和輔助成分，將本發明的疫苗組合制成包裹劑。
[0034]另一方面，本發明提供了所述的疫苗制備用于預防和治療EB病毒相關腫瘤，特別是鼻咽癌的疫苗或藥物應用。
[0035]

【專利附圖】

【附圖說明】
[0036]圖1:ebnal基因片段擴增及回收電泳圖；
圖2:pDC316-EBNAl雙酶切、單酶切、pDC316單酶切鑒定；
圖3:質粒在293細胞內的重組不意圖；
圖4:感染rAd-EBNAl后293細胞出現的典型病變(200 X)；
圖5:rAd-EBNAl顆粒電鏡負染結果(X97 000)；
圖 6:ffestern blot 鑒定 EBNAl 表達；
圖?:流式細胞儀檢測EBNAl在細胞中表達；
圖8:ELISP0T法檢測小鼠EBNAl特異性細胞免疫反應；
A:免疫后I周EBNAl特異性細胞免疫反應 B:免疫后2周EBNAl特異性細胞免疫反應 C:免疫后4周EBNAl特異性細胞免疫反應 D:免疫后8周EBNAl特異性細胞免疫反應圖9 =EBNAl CD4+T特異性細胞免疫應答持續時間。
[0037]

【具體實施方式】
實施例
[0038]在本申請中，如無特殊說明，本發明的實施都使用分子生物學、微生物學、重組DNA和免疫學常規，技術，這些技術都是本領域技術人員所掌握。
[0039]實驗材料和方法
大腸桿菌DH5a、質粒PDC316、pBHG、B95_8、293細胞細胞株為中國疾病預防控制中心病毒病預防控制所曾毅院士實驗室保存。培養條件為含10% FBS、1%青鏈霉素、1%谷氨酰胺的DMEM培養液。其中FBS購自美國GIBCO公司、DMEM購自Hyclone公司，其他培養液均由中國疾病預防控制中心病毒病預防控制所配液室提供。
[0040]質粒大量提取試劑盒QIAGEN Plasmidega Kits購自德國QIAGEN公司；常用限制性內切酶l、bgl I1、核酸凝膠純化試劑盒、PCR試劑盒購自寶生物工程(大連)有限公司；連接酶購自美國NEB公司；真核轉染試劑FuGene HD購自美國Promega公司；RPMI1640細胞培養基、DMEM細胞培養基和無菌PBS購自美國HyClone公司；胎牛血清購自美國GIBCO公司；PVDF膜MultiScreenHTS購自瑞典MABTECH公司；Tris堿(SERVA公司)，硼酸(上海云嶺化工廠，AR)，EDTA (Sigma原裝)，胰蛋白胨(0X0ID公司)，酵母提取物(0X0ID公司)，山羊抗小鼠EBNAl單抗購自美國Santa Cruz B1technology公司，辣根過氧化物酶(HRP)標記山羊抗小鼠IgG、流式抗體購自中衫金橋生物技術有限公司。其他分析純化學試劑由中國疾控中心病毒病所提供。
[0041]實施例1
1.1.ebnal基因片段的獲取
EBV ebnal片段的PCR擴增引物的設計及合成用Primer5.0、DNAstar軟件配合設計，由B95-8標準株為模板擴增939 bp (108937-109875) (aa329_aa641)的ebnal基因，具體序列見 SEQ NO:1 ；
c gaggaggcag tggaggccgg
108961 ggtcgaggag gtagtggagg ccggggtcga ggaggtagtg gaggccgccg gggtagagga
109021 cgtgaaagag ccaggggggg aagtcgtgaa agagccaggg ggagaggtcg tggacgtgga
109081 gaaaagaggc ccaggagtcc cagtagtcag tcatcatcat ccgggtctcc accgcgcagg
109141 ccccctccag gtagaaggcc atttttccac cctgtagggg aagccgatta ttttgaatac
109201 caccaagaag gtggcccaga tggtgagcct gacgtgcccc cgggagcgat agagcagggc
109261 cccgcagatg acccaggaga aggcccaagc actggacccc ggggtcaggg tgatggaggc
109321 aggcgcaaaa aaggagggtg gtttggaaag catcgtggtc aaggaggttc caacccgaaa
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109441 accgacgaag gaacttgggt cgccggtgtg ttcgtatatg gaggtagtaa gacctccctt
109501 tacaacctaa ggcgaggaac tgcccttgct attccacaat gtcgtcttac accattgagt
109561 cgtctcccct ttggaatggc ccctggaccc ggcccacaac ctggcccgct aagggagtcc
109621 attgtctgtt atttcatggt ctttttacaa actcatatat ttgctgaggt tttgaaggat
109681 gcgattaagg accttgttat gacaaagccc gctcctacct gcaatatcag ggtgactgtg
109741 tgcagctttg acgatggagt agatttgcct ccctggtttc cacctatggt ggaaggggct
109801 gccgcggagg gtgatgacgg agatgacgga gatgaaggag gtgatggaga tgagggtgag
109861 gaagggcagg agtga
在引物上下游分別插入EcoR 1、Bgl II酶切位點，以便于克隆基因插入到腺病毒穿梭質粒PDC316中。(引物序列如下:上游5 ’ CGGAATTCATGCGAGGAGGCAGTG3，下游5’GAAGATCTTCACTCCTGCCCTT3’其中斜體部分分別為EcoR 1、Bgl II酶切位點。)PCR反應體系及反應條件如下:10 X PCR buff er2.5 μ L, dNTP(10 mmol) 2 yL，上下游引物20 μ M各 0.5 yL，Taq 酶 0.5 yL，模板 I μ L，ddH2018 yL，共計 25 μ L 反應體系。95°C X4min, (94 °C X 30 s,56°C X 30 s,72°C Xl min) X 30Cycles, 72°C 8 min，4°C 儲存。同時做陰性對照(陰性模板為高壓滅菌水)。
[0042]1.2.ebnal基因片段切膠回收
將PCR產物10 μ L上樣，1%瓊脂糖凝膠電泳，充分分離后在紫外燈照射下觀察是否出現目的條帶，切下目的條帶，做切膠回收(用試劑盒)。方法如下:按照0.1 g膠加入300μ L QG 的比例，50°C 10 min,間斷混勻 2-3 次；上清轉入 QIA quick spin column, 12 000rpm 離心 I min JPAPE Buffer 700 μ L, 12 000 rpm 離心 I min ; 12 000 rpm 再次離心I min ;加15 μ L ddH20于純化柱介質上,靜置I min ; 12 000 rpm離心I min,收集DNA溶液；3 yL上樣，在110 V電壓下1%瓊脂糖凝膠觀察擴增產物回收的情況，結果見圖1。
[0043]1.3.ebnal基因片段及穿梭質粒pDC316雙酶切及回收
參照限制性內切酶雙酶切使用表用限制性內切酶EcoR I和Bgl II分別雙酶切PDC316、EBV-ebnal PCR擴增后膠回收片段。雙酶切體系是20 yL(DNA/質粒2 yL ；NEBufferf μ L ；EcoR I 0.5 μ L ；Bgl II 0.5 μ L, ddH20 14 μ L)，在建議最適溫度 37°C培養箱中酶切過夜。將酶切產物10 μ L上樣，在110 V電壓下1%瓊脂糖凝膠電泳，充分分離后在紫外燈照射下觀察是否出現目的條帶，在紫外燈下切膠并使用Qiagen公司的切膠回收試劑盒回收目的片段，具體操作參見相關說明書。3 UL上樣，在110 V電壓下1%瓊脂糖凝膠觀察酶切產物回收的情況。
[0044]1.4.ebnal片段和穿梭質粒pDC316的連接
回收產物測濃度，連接比例按照載體:目的片段=1:3飛(摩爾比)的比例進行連接。連接體系如下(20 yL):pDC316 9 μ L ；EBV-ebnal 4 μ L ;連接酶 I μ L ;Buffer 2 μ L ；Η204 yL，16°C連接過夜。
[0045]1.5.連接產物轉化大腸桿菌DH5 α
將連接產物加入200 μ L DH5 α感受態細胞的Eppendorf管中，輕輕旋轉混勻，冰浴30min。將管移入預熱的42°C水浴箱中水浴90 S，然后迅速將試管轉移到冰上，使細菌冷卻2^3 min。每管加入800 μ L不含抗生素的LB培養基，移至37°C搖床上，溫育45 min (轉速<150 rpm)。取50 μ L已轉化的感受態細胞，用一支無菌的彎頭玻棒輕輕涂到含AMP (100μ g/mL)的瓊脂平板表面，將平板平置于室溫至液體被吸收，倒置平皿，于37°C培養箱中培養12?16 h(同時做陰性對照)。
[0046]1.6.pDC316-EBNAl 的提取及鑒定
挑瓊脂平板上的3個單菌落分別于5 mL含Amp(100 μ g/mL)的LB培養基中，37 °C，220rpm搖床過夜。用無菌吸頭吸取5 μ L做PCR反應模板，反應體系與反應條件同目的片段的獲取。將PCR鑒定正確的菌液進行質粒的小量制備(用Qiagen質粒提取Kit)，具體步驟參考試劑盒說明書。對提取的質粒進行濃度測定及單、雙酶切鑒定，體系10 μ L(質粒3μ L ；NEBuffer I μ L ；EcoR I 0.5 μ L ；Bgl II 0.5 μ L ；ddH20 5 μ L)，37°C水浴 / 孵育箱4 h，將酶切產物3 μ L上樣，進行瓊脂糖凝膠電泳，紫外燈下觀察結果。初步鑒定正確后取5 μ L送由北京天一輝遠生物科技有限公司測序，用以確定擴增過程中是否出現堿基錯配以及讀框正確。將測序鑒定正確的質粒命名為PDC316-EBNA1。
[0047]實施例2
2.1.穿梭質粒及骨架質粒的提取
包裝腺病毒所用質粒的質量與包裝的成功率有密切的關系，為此在包裝前用EndoFreePlasmid Maxi Kit提取所需的骨架質粒pBHGLox Δ El.3Cre,制備方法依試劑盒的操作說明所述。穿梭質粒為上述構建的PDC316-EBNA1。將制備好的質粒溶于試劑盒附帶的無菌TE溶液中，用紫外分光光度計測定260 nm/280 nm的OD值，計算核酸純度(要求0D260/0D280>1.8)及核酸含量，分裝保存于_20°C備用。
[0048]2.2.重組腺病毒rAd-EBNAl的包裝
本部分研究采用真核表達系統，將B95-8標準株中的基因與腺病毒穿梭質粒載體PDC316連接，構建重組質粒，與骨架質粒pBHG共轉染293細胞，包裝重組腺病毒，具體方法參考真核轉染試劑說明書。用FuGene HD將質粒pDC316_EBNAl與pBHG共轉染293細胞，見圖3。具體方法為:按照4X 15細胞/孔的量接293細胞到六孔板中，每孔用含2%FBS的DMEM培養基培養。次日細胞達到80°/Γ90%匯合度，按說明書將構建好的骨架質粒與穿梭質粒按照1:3的比例加入100 uL的無抗生素DMEM中，渦旋混勻后靜置5 min，再加入6 μ LHD轉染試劑注意轉染試劑在液面下緩慢加入，吹打混勻f 2次，室溫靜置25 min。再將轉染混合物分散緩慢地滴加到待轉染的細胞孔中，邊加邊搖晃，并做一陰性對照。將板子放于37°C、5% C02培養箱中孵育7-14 d，注意每天觀察細胞的變化，看有無病變或者細菌污染的情況發生，培養基不足時注意補加，此時期是雙質粒在293細胞內重組成腺病毒的過程。
[0049]2.3.原代病毒的收獲及擴增
大約7 d后，加入質粒的細胞開始出現病變(CPE)，再觀察1-2 d，待細胞病變明顯時，開始收獲病毒。將細胞用I mL無菌Tip頭吹下,連同培養基一起移入15 mL Eppendorf管中，用洗液洗細胞兩次。注意細胞吹打后不能脫落要加入2 mL胰酶消化， 2 min后棄胰酶，輕敲培養瓶側壁使細胞脫落。在_80°C和37°C (水浴)反復凍融3次(使細胞破碎，釋放病毒)；3 000 rpm離心10 min,吸取上清，即為原代病毒,命名為rAd-EBNAl,于_80°C保存。取原代病毒2 mL再次感染T75培養瓶中的293細胞，37°C、5%的C02培養箱中孵育2h，后補加8 mL新鮮培養基繼續培養，代細胞完全病變后，收獲病毒，在-80°C和37°C (水浴)反復凍融3次，此為rAd-EBNAl第一代病毒，于-80°C保存。
[0050]2.4.rAd-EBNAl DNA和形態鑒定及滴度測定
PCR鑒定在200 UL病毒上清中加入20 μ L蛋白酶K(20 mg/mL)，56°C消化蛋白I h，煮沸10 min，使蛋白酶K失活，10 000 rpm離心5 min，除去蛋白，此為病毒DNA模板。PCR引物采用構建PDC316-EBNA1的引物，反應體系及程序同目的片段的獲取。取5 μ L PCR產物加上I μ L的6Χ加樣緩沖液，進行110 V恒壓電泳，紫外燈下觀察結果。形態觀察收集的病毒上清液，磷鎢酸負染后于電鏡下觀察重組腺病毒形態。
[0051]50%組織培養感染劑量(TCID50)方法測定rAd-EBNAl的滴度TCID50實驗的基礎是應用極限稀釋法使293細胞出現病變從而估計滴度。本項檢測須做兩組重復試驗，兩組試驗可在同一天進行，也可在不同天進行。細胞的準備:取用DMEM+5%FBS預培養的293細胞I個75 cm2方瓶，待細胞生長至80%，收集細胞并用胰酶消化計數。用5%FBS的DMEM制備細胞懸液，每板需要10 mL濃度為I X 105個/mL的細胞懸液，后按每孔100 μ L (即I X 104個細胞)加入2個96孔板。
[0052]制備感染樣品:10-5開始連續8個稀釋梯度，稀釋液用5%FBS的DMEM。按表2_1接種樣品:各加100 μ L梯度稀釋好的樣品溶液，蓋上第I個板并在37°C，5%C02培養箱培養。同步驟操作感染第2板。從第3 d到第10 d觀察細胞狀況，第10 d分析、記錄CPE結果:CPE應在10 d之間出現。第10 d在顯微鏡下觀察每孔CPE情況，并與陰性對照的一排對比，記錄每排樣品的陽性孔數。(如有一個板被污染，試驗必須重做)
表1 TCID5tl法檢測重組腺病毒滴度

【權利要求】
1.一種攜帶EB核抗原I基因片段的重組腺病毒疫苗，其特征在于，所述重組腺病毒疫苗是由EB核抗原I基因片段插入到腺病毒載體構建而成。
2.如權利要求1所述重組腺病毒疫苗，其特征在于，所述EB核抗原I基因片段編碼EB核抗原I的C端氨基酸序列。
3.如權利要求1-2任其一所述重組腺病毒疫苗，其特征在于，所述EB核抗原I基因片段的核苷酸序列為939bp。
4.如權利要求1-3任其一所述重組腺病毒疫苗，其特征在于，所述EB核抗原I基因片段的核苷酸序列如序列I所示。
5.如權利要求1-4任其一所述重組腺病毒疫苗，其特征在于，所述腺病毒載體為復制缺陷型。
6.如權利要求5所述重組腺病毒疫苗，其特征在于，所述腺病毒載體是利用Admax系統構建。
7.權利要求1-6所述的重組腺病毒疫苗在制備治療或預防EBV相關疾病的藥物中的應用；所述EBV相關疾病優選鼻咽癌。
8.一種組合物，其中含有權利要求1-6任其一所述的重組腺病毒疫苗和一種或多種藥物學上可接受的載體、佐劑和/或賦形劑。
9.一種活化的細胞毒性T淋巴細胞，該細胞是利用權利要求1-6任其一所述的重組腺病毒疫苗刺激細胞毒性T淋巴細胞使其活化得到的。
10.權利要求9所述的活化的細胞毒性T淋巴細胞在制備用于過繼性治療藥物中的用途。
【文檔編號】C12N7/01GK104162153SQ201410285165
【公開日】2014年11月26日 申請日期:2014年6月24日 優先權日:2014年6月24日
【發明者】曾毅, 杜海軍, 仝艷艷, 周玲, 王湛, 張麗霞 申請人:中國疾病預防控制中心病毒病預防控制所