專利名稱：黑猩猩腺病毒疫苗載運體的制作方法
技術領域：
本發明涉及重組載體領域，更具體地涉及重組復制缺陷性黒猩猩腺病毒載體的產生和用途，來在哺乳動物宿主中引發免疫反應。
背景技術：
腺病毒(Ads)包含在兩棲動物、禽類和哺乳動物中發現的、具有無包被的二十面 體衣殼結構的雙鏈DNA病毒的大家族(Straus, Adenovirus infections in humans. InThe Adenoviruses. 451-498，1984 ；Hierholzer et al.，J.Infect. Dis.，158 :804-813,1988 ；Schnurr and Dondero, Intervirology.，36 :79-83,1993 ；Jong et al.，J ClinMicrobiol.，37 :3940-3945 :1999)。與逆轉錄病毒相比，腺病毒可以轉導幾個哺乳動物物種的許多細胞類型，包括分裂和非分裂細胞，而不整合到宿主細胞的基因組中。一般而言，腺病毒DNA—般是非常穩定的并保持游離(例如，染色體外)，除非發生了轉化或腫瘤發生。此外，在容易進行臨床級組合物的制藥規模生產的良好定義的生產系統中，腺病毒載體可以繁殖到高產量。這些特征和它們被良好表征的分子遺傳學，使得重組腺病毒載體成為用作疫苗載運體(carrier)的好的候選者。一般地，重組腺病毒載體的生產依靠使用能夠補足腺病毒基因產物的功能的包裝細胞系，所述功能已經被刪除或被工程化為無功能的。目前，兩種良好表征的人類C亞群腺病毒血清型(即，hAd2和hAd5)被廣泛地用作大多數用于基因治療的腺病毒載體的病毒主干的來源。也已經測試了復制缺陷性人類腺病毒載體作為用于遞送各種免疫原的疫苗載體，所述免疫原來源于各種傳染原(例如，病毒、寄生蟲或細菌性病原體)和腫瘤細胞，包括腫瘤相關抗原(TAA)。在實驗動物(例如，嚙齒動物、犬和非人靈長類)中進行的研究表明，攜帶轉基因的重組復制缺陷性人類腺病毒載體引發了針對轉基因產物的體液和細胞介導的免疫反應，所述轉基因編碼來源于人類乳頭狀瘤病毒(HPV-16)的 E6 和 E7 癌蛋白(He, Z et al.，(2001) Virology, 270 :3583-3590)、狂犬病病毒糖蛋白(Xiang, Z. et al (1996) Virolgy, 219 :220-227)、Plasmodium falciparum的環子孢子蛋白 Rodriguez E. et al. (1997) J. Immunol. 158 :1268-1274)以及其他異源抗原的免疫原。一般而言，研究人員已經報道了，通過使用利用預計可引發免疫反應的高劑量重組腺病毒載體的免疫方案；或通過使用采用腺病毒載體的連續施用的免疫方案，所述腺病毒載體來源于不同血清型但攜帶相同的轉基因產物用作強化免疫，在非人類實驗系統中成功地使用人類腺病毒載體作為疫苗載運體(Mastrangeli, et al. ,Human Gene Therapy,7 :79-87(1996)。
然而，預計的是，來源于遍在的人類血清型，例如2和5型的疫苗載運體將在人類群體中遇到先存的(pre-existing)體液和細胞免疫。因而，盡管已經在采用嚙齒動物、犬和非人靈長類宿主的實驗系統中成功地使用復制缺陷性重組人類腺病毒作為疫苗載運體，預計人類的先天和適應性免疫會顯著地限制這些血清型作為疫苗載運體的實用性。這種預期是基于這一事實，包括2型和5型的C亞群腺病毒感染在人類群體中是地方性的。結果，作為自然感染的結果，大多數人類在生命的頭五年內血清轉變。因而，來源于在人類中天然感染并復制的病毒的載體，可能不是用作疫苗載運體的最優候選者。
與使用人類腺病毒衍生載體相關的另ー個問題是，用于繁殖重組病毒的生產方法產生被有復制能力的腺病毒(RCA)污染的載體成品的風險。這是起因于，來自重組載體和存在于 El 補足輔助細胞系，例如人類 293 (Graham，F. L. et al, (1977) J. Gen. Virol. 36 59-72.)細胞中的腺病毒基因的重疊序列之間的同源重組。在為用于臨床試驗制備的載體成品中RCA的存在構成了安全風險，因為它可能促進復制缺陷性病毒的流動和傳播。缺陷病毒的傳播可能加重宿主免疫應答，并引起其他有害的免疫病理后果。(Fallux，F. J.，etal. Human Gene Therapy 9 :1909-1917 (1998)。因此，食品和藥品管理局(FDA)和其他管理機構已經頒布了指導原則，其建立了對可能存在于用于臨床用途的載體制品中的RCA水平的限制。加以RCA限制的意圖是確保患者有限地暴露于用于臨床試驗的組合物中的復制性腺病毒。因而，存在著開發適用于哺乳動物宿主的腺病毒疫苗載運體的持續的需求，其是易于操作、可經受制藥規模的生產和長期儲存、在人類補足細胞系中能以高水平復制、高度的免疫原性、沒有與人類腺病毒的常見血清型交叉反應的中和B細胞表位、符合管理機構頒布的安全RCA標準、并且其符合在適合人類使用的激發/強化(prime/boost)方案中使用。

發明內容
本發明涉及來源于黑猩猩腺病毒的重組復制缺陷性腺病毒載體和用于在人類El表達細胞系中產生黑猩猩腺病毒載體的方法。本發明還提供了產生適用于人類的臨床級載體成品的方法，和使用所公開的載體作為疫苗載運體來引發保護性和/或治療性免疫反應的方法。本發明進一歩提供了使用本發明的重組腺病毒來制備疫苗組合物的方法，所述疫苗組合物被設計以遞送編碼免疫原的轉基因和指導編碼免疫原的轉基因的表達。在ー個實施方式中，本發明考慮使用所公開載體作為疫苗載運體用于疫苗的施用，所述疫苗包含編碼來源于傳染原的免疫原的轉基因。在第二種實施方式中，本發明考慮使用所公開的載體來制備和施用癌癥疫苗。在特定的實施方式中，本發明考慮制備和施用包含編碼TAA的轉基因的癌癥疫苗。在ー個方面，本發明公開了五種黑猩猩腺病毒(ChAds)的完整基因組序列，在此稱為 ChAd3 (SEQ ID NO :1)(附圖 5A-5K)、ChAd6 (SEQ ID NO 2)(附圖 6A-6K)、CV32 (SEQID NO 3)(附圖 7A-7K)、CV33 (SEQ ID NO 4)(附圖 8A-8K)和 CV23 (SEQ ID NO 5)(附圖9A-9J)。ChAd3和ChAd6是根據在此公開的方法分離的新的腺病毒。ChAd3和ChAd6的基因組長度分別是37741和36648個堿基對。ChAd3六鄰體基因(SEQ ID NO 41)包含SEQ IDNO :1的核苷酸(nt) 19086-21965(不包括終止密碼子)，ChAd3纖維基因(SEQ ID NO 42)包含SEQ ID NO 1的nt 32805-34487 (不包括終止密碼子)。ChAd6六鄰體(hexon)基因包含SEQ ID N0:2的nt 18266-21124 (SEQ ID NO :43)(不包括終止密碼子)，它的纖維基因(SEQ ID NO 44)包含SEQ ID NO 2的nt 32218-33552 (不包括終止密碼子)。根據從全長六鄰體肽的多重序列比對得出的序列同源性，ChAd3被分類入人類C亞群，ChAd6被分類入人類E亞群。CV32、CV33和CV23腺病毒的基因組的長度分別是36，606、36，535和32，020個堿基對。CV32 (Pan 6) (ATCC N. VR-592)、CV33 (Pan7) (ATCC N. VR-593)和 CV23 (Pan5) (Esoterix Inc.，)全都被確定為與人類 Ad4 (hAd4) (E 亞群)相關(ffigand, R etal. Intervirologyl989,30 :1_9)。然而，根據六鄰體序列比對，隨后將CV32表征為與類似于hAd4相比更接近地類似于人類D亞群成員。

在第二個方面，本發明提供了根據在此公開的方法分離的21種其他黒猩猩腺病毒(ChAd20、ChAd4、ChAd5、ChAd7、ChAd9、ChAd10、ChAd11、ChAd16、ChAd17、ChAd19、ChAd8、ChAd22、ChAd24、ChAd26、ChAd30、ChAd31、ChAd37、ChAd38、ChAd44、ChAd63 和 ChAd82)的纖維基因和TK鄰體基因的核昔酸序列。ChAd20、ChAd4、ChAd5、ChAd7、ChAd9、ChAdlO、ChAdll、ChAdl6、ChAdl7、ChAd19 的纖維基因核苷酸序列分別在附

圖10-19中列出，在此稱為SEQ ID NO :6-15: (SEQ ID NO:6，ChAd20) ； (SEQ ID NO -J, ChAd4) ； (SEQ ID NO 8, ChAd5) ； (SEQ ID NO 9, ChAd7) ； (SEQID NO 10, ChAd9) ； (SEQ ID NO 11, ChAdlO) ； (SEQ ID NO: 12，ChAdll) ； (SEQ ID NO: 13，ChAd16) (SEQ ID NO 14, ChAd17)和(SEQ ID NO 15, ChAd19)ChAd8、ChAd22、ChAd24、ChAd26、ChAd30、ChAd31、ChAd37、ChAd38、ChAd44、ChAd63和ChAd82的纖維基因核苷酸序列在此稱為(SEQ ID NO :58，ChAd8)、(SEQ ID NO 60,ChAd22)、(SEQ ID NO 62, ChAd24)、(SEQ ID NO 64, ChAd26)、(SEQ ID NO 66, ChAd30)、(SEQ ID NO :68，ChAd31)、(SEQ ID NO :70，ChAd37)、(SEQ ID NO :72，ChAd38)、(SEQ BD NO:74，ChAd44)、(SEQ ID NO :76, ChAd63)和(SEQ ID NO 78, ChAd82)，并在序列表中列出。ChAd20、ChAd4、ChAd5、ChAd7、ChAd9、ChAdlO、ChAdll、ChAdl6、ChAdl7、ChAd19 的六鄰體基因核苷酸序列分別在附圖21-30中列出，在此稱為SEQ ID NO 16-25 (SEQ ID NO:16，ChAd20) ； (SEQ ID NO 17, ChAd4) ； (SEQ ID NO 18, ChAd5) ； (SEQ ID NO 19, ChAd7)；(SEQ ID NO 20,ChAd9) ； (SEQ ID NO 21,ChAdlO) ； (SEQ ID NO 22,ChAdll) ； (SEQ ID NO:23，ChAd16) ； (SEQ ID NO 24, ChAd17)和(SEQ ID NO 25, ChAd19)。ChAd8、ChAd22、ChAd24、ChAd26、ChAd30、ChAd31、ChAd37、ChAd38、ChAd44、ChAd63和ChAd82的六鄰體基因核苷酸序列在此稱為(SEQ ID NO :97，ChAd8)、(SEQ ID NO 99,ChAd22)、(SEQ ID NO :101，ChAd24)、(SEQ ID NO :103，ChAd26)、(SEQ ID NO :105,ChAd30)、(SEQ ID NO :107，ChAd31)、(SEQ ID NO : 109，ChAd37)、(SEQ ID NO : 111，ChAd38)、(SEQ IDNO 113, ChAd44)、(SEQ ID NO 115, ChAd63)和(SEQ ID NO 117, ChAd82)，并在序列表中列出。在第三個方面，本發明提供了根據在此公開的方法分離的21種其他黒猩猩腺病毒(ChAd20、ChAd4、ChAd5、ChAd7、ChAd9、ChAd10、ChAd11、ChAd16、ChAd17、ChAd19、ChAd8、ChAd22、ChAd24、ChAd26、ChAd30、ChAd31、ChAd37、ChAd38、ChAd44、ChAd63 和 ChAd82)的纖維蛋白和六鄰體蛋白的氨基酸序列。在此公開和要求權利的纖維蛋白稱為(SEQ ID NO :83，ChAd3)、(SEQ ID NO :84，ChAd6)、(SEQ ID NO 48, ChAd20)、(SEQ ID NO 49, ChAd4)、(SEQ ID NO 50, ChAd5)、(SEQID NO 51, ChAd7)、(SEQ ID NO 52, ChAd9)、(SEQ ID NO 53, ChAdlO)、(SEQ ID NO 54,ChAdll)、(SEQ ID NO 55, ChAd16), (SEQ ID NO 56, ChAd17), (SEQ ID NO 57, ChAd19),(SEQ ID NO 59,ChAd8)、(SEQ ID NO 61,ChAd22)、(SEQ ID NO 63,ChAd24)、(SEQ ID NO 65，ChAd26)、(SEQ ID NO :67,ChAd30)、(SEQ ID NO 69,ChAd31)、(SEQID NO 71,ChAd37)、(SEQ ID NO 73, ChAd38)、(SEQ ID NO :75，ChAd44)、(SEQ ID NO :77，ChAd63)和(SEQ IDNO 79, ChAd82)。附圖20A-20G提供了比較在此公開和要求權利的纖維蛋白的氨基酸序列與以下纖維蛋白的氨基酸序列的比對Cl (SEQ ID NO :85)、CV68(SEQ ID NO :86)、Pan5 (作為選擇稱為 CV23) (SEQ ID NO :80)、Pan6 (作為選擇稱為 CV32) (SEQ ID NO :81)和 Pan7(作為選擇稱為 CV33) (SEQ ID NO :82)。在此公開和要求權利的六鄰體蛋白稱為(SEQ ID NO :122，ChAd3)、(SEQ ID NO 123，ChAd6)、(SEQ ID NO 87, ChAd20)、(SEQ ID NO 88, ChAd4)、(SEQ ID NO 89, ChAd5)、(SEQ ID NO 90, ChAd7)、(SEQ ID NO :91，ChAd9)、(SEQ ID NO :92, ChAdlO)、(SEQ ID NO 93，ChAdll)、(SEQ ID NO :94，ChAd16)、(SEQ ID NO :95,ChAdl7)、(SEQ ID NO :96,ChAdl9)、(SEQ ID NO 98, ChAd8)、(SEQ ID NO 100, ChAd22)、(SEQ ID NO 102, ChAd24)、(SEQ IDNO :104,ChAd26)、(SEQ ID NO : 106，ChAd30)、(SEQ ID NO : 108，ChAd31)、(SEQ ID NO :110，ChAd37)、(SEQ ID NO :112，ChAd38)、(SEQ ID NO :114，ChAd44)、(SEQ ID NO 116,ChAd63)和(SEQ ID勵118，0^(182)。附圖3認-311提供了在此公開和要求權利的六鄰體蛋白的氨基酸序列與以下六鄰體蛋白的氨基酸序列的比較Cl (SEQ ID NO :124)、CV68 (SEQ ID NO:125)、Pan5(做為選擇稱為 CV23) (SEQ ID NO :119)、Pan6 (做為選擇稱為 CV32) (SEQ ID NO 120)和Pan7 (做為選擇稱為CV33) (SEQ ID NO :121)。六鄰體蛋白的多重序列比對容許技術人員進行與人類腺病毒血清型的建議分類一致的系統發生分析(Rux，J. J. ,et al (2003)J. Virol. 77 :9553-9566)。在可選擇的方面，本發明進一歩提供了 21種其他的黒猩猩腺病毒分離物。將包含 ChAd20、ChAd4、ChAd5、ChAd7、ChAd9、ChAdlO、ChAdll、ChAdl6、ChAdl7、ChAdl9、ChAd8、ChAd22、ChAd24、ChAd26、ChAd30、ChAd31、ChAd37、ChAd38、ChAd44、ChAd63 和 ChAd82 的樣品根據布達佩斯條約保藏在歐洲動物細胞保藏中心(ECACC, Porton Down, Salisbury,Wiltshire, SP4 0JG,英國)。其保藏日、分類命名和保藏號如下表所示
保藏日期保藏編號分類命名
2003 年 12 月 12 日 03121201 CHIMPANZEE ADENOVIRUS TYPE 4_
2003 年 12 月 12 日 03121202 CHIMPANZEE ADENOVIRUS TYPE 5_
2003 年 12 月 12 日 03121203 CHIMPANZEE ADENOVIRUS TYPE 7_
2003 年 12 月 12 日 03121204 CHIMPANZEE ADENOVIRUS TYPE 9_
權利要求
1.復制缺陷性腺病毒載體，其包含腺病毒基因組，所述基因組包含編碼SEQID NO 77或116或SEQ ID NO :57或96所示的肽的核苷酸序列，和與調節序列可操作連接的編碼至少ー個免疫原的轉基因，所述調節序列指導所述轉基因在哺乳動物細胞中的表達，其中所述載體是修飾的，所述修飾是至少一個選自E1、E2和E4的基因被功能性刪除。
2.權利要求I的復制缺陷性載體，其中所述腺病毒基因組包含SEQID NO :115或SEQID NO 25所示的核苷酸序列。
3.權利要求I或2的復制缺陷性腺病毒載體，其中所述腺病毒基因組包含SEQID NO:76或SEQ ID NO : 15所示的核苷酸序列。
4.權利要求1-3的任一項的復制缺陷性腺病毒載體,其特征在于El核苷酸序列中的功能性刪除。
5.宿主細胞,包含根據權利要求1-3的任一項的復制缺陷性腺病毒載體，其中所述宿主細胞表達選自 Ela、Elb、E2a、E2b、E4 orfs l、2、3、4、5、6、6/7、pIX、IVa2、區域 L1、L2、 L3、L4、L5的ー種或多種腺病毒區域。
6.分離的重組腺病毒基因組，其包含 a)包含SEQID NO :115或SEQ ID NO :25所示的核苷酸序列的六鄰體基因序列；和 b)包含SEQID N0:76或SEQ ID NO : 15所示的核苷酸序列的纖維基因序列。
7.權利要求1-4的任一項的復制缺陷性腺病毒載體，其用于在哺乳動物中強化抗原特異性免疫反應的方法，該方法包括向所述哺乳動物施用足夠量的所述載體，其中施用所述腺病毒載體引發強化的反應。
8.權利要求7的復制缺陷性腺病毒載體，其中所述載體包含其El基因的完全刪除，并且進一歩地，其中所述載體任選包含其E3基因的刪除。
9.權利要求7的復制缺陷性腺病毒載體，其中所述免疫反應是特異于TAA的強化的免疫反應。
10.權利要求7或權利要求9的復制缺陷性腺病毒載體，其中所述強化的免疫反應包括產生抗原特異性⑶8+T細胞。
11.權利要求1-4的任一項的復制缺陷性腺病毒載體，其用于在幼稚哺乳動物中引發免疫反應的方法，該方法包括向所述哺乳動物施用足夠量的所述至少含有其El基因的功能性刪除的腺病毒載體，其中施用所述腺病毒載體引發初級免疫反應。
12.權利要求7或權利要求11的復制缺陷性腺病毒載體，其中所述強化的免疫反應或初級免疫反應分別特異于來源于傳染原的抗原，所述傳染原例如，但不限于HIV、HBV、HCV,HPV、HSVI、HSV2、SARS CoV、Leishmania major、惡性瘧原蟲、埃博拉病毒、西尼羅河病毒、登革熱病毒、流感A、流感B、RSV, CMV、結核分枝桿菌。
13.權利要求7的復制缺陷性腺病毒載體，其中所述免疫反應是特異于TAA的初級免疫反應，所述哺乳動物針對所述TAA是耐受性的。
14.權利要求1-4的任一項的復制缺陷性腺病毒載體，其用于誘導針對來源于傳染原的抗原的免疫反應的方法，該方法包括步驟 (a)通過施用第一疫苗組合物激發宿主以響應傳染原-抗原，所述第一疫苗組合物包含編碼傳染原-抗原的核苷酸序列，針對所述傳染原-抗原的抗原特異性免疫反應是期望的；和(b)通過施用第二疫苗組合物強化步驟(a)的免疫反應，所述第二疫苗組合物包含至少含有其El基因的功能性刪除的權利要求4的腺病毒載體，和在所述El基因刪除的位點中，包含ー種序列，所述序列包含能指導DNA的表達的啟動子，所述DNA編碼與激發步驟中遞送的傳染原-抗原相同的傳染原-抗原； 其中所述強化組合物的施用引發具有賦予保護性免疫的效果的免疫反應。
15.權利要求14的載體，其中所述抗原來源于選自下組的傳染原HIV、HBV、HCV、HPV、HSVl、HSV2、SARS Cov、Leishmania major、惡性瘧原蟲、埃博拉病毒、西尼羅河病毒、登革熱病毒、流感A、流感B、RSV, CMV和結核分枝桿菌。
16.權利要求14的復制缺陷性腺病毒載體，其中所述免疫反應包括產生抗原特異性⑶8+T細胞。
17.權利要求1-4的任一項的復制缺陷性腺病毒載體,其用于破壞宿主對自體抗原的耐受性的方法，該方法包括(a)通過施用第一疫苗組合物激發宿主以響應自體抗原，所述 第一疫苗組合物包含編碼自體抗原的核苷酸序列，針對所述自體抗原的抗原特異性免疫反應是期望的，從而引發激發的反應；和(b)通過施用第二疫苗組合物強化步驟(a)的激發的免疫反應，所述第二疫苗組合物包含至少含有其El基因的功能性刪除的重組腺病毒載體，和在所述El基因刪除的位點中，包含ー種序列，所述序列包含能指導DNA的表達的啟動子，所述DNA編碼與激發步驟中遞送的自體抗原相同的自體抗原，其中所述強化組合物的施用引發具有破壞宿主對所述自體抗原的耐受性的效果的免疫反應。
18.權利要求17的復制缺陷性腺病毒載體，其中所述第二疫苗組合物包含腺病毒載體，所述腺病毒載體包含編碼自體抗原的DNA，所述自體抗原選自HER2NEU、CEA、HEPCAM、PSA、PSMA、端粒酶、GP100、MELAN-A/MART-l、MUC-U NY-ES0-1、存活蛋白、溶基質蛋白酶 3、酪氨酸酶、MAGE3、CML68、CML66、OY-TES-1、SSX-2、SART-1、SART-2、SART-3、NY-C0-58、NY-BR-62、HKLP2、5T4 和 VEGFR2。
19.權利要求17的復制缺陷性腺病毒載體，其中所述免疫反應包括產生抗原特異性⑶8+T細胞。
20.權利要求18或19的復制缺陷性腺病毒載體，其中所述第一和第二疫苗組合物疫苗組合物都是以不同的血清型為特征的腺病毒載體。
全文摘要
本發明涉及黑猩猩腺病毒疫苗載運體。本發明提供來源于黑猩猩腺病毒的重組復制缺陷性腺病毒載體和用于在人類E1表達細胞系中產生重組腺病毒的方法。本發明還提供了適用于遞送和表達編碼免疫原的轉基因的組合物和方法，針對所述免疫原的強化的免疫反應是期望的。本發明進一步提供了產生適合在人類中使用的臨床級載體成品的方法。在特定的實施方式中，本發明考慮在疫苗和藥物組合物中使用包含編碼腫瘤相關抗原的轉基因的載體用于癌癥的預防和治療。
文檔編號A61K39/00GK102719478SQ20121005679
公開日2012年10月10日 申請日期2005年1月18日 優先權日2004年1月23日
發明者A·奇里洛, A·尼科西亞, A·梅奧拉, B·B·埃爾科勒, E·斯波雷諾, S·科洛卡 申請人:P.安杰萊蒂分子生物學研究所