一種檸檬酸桿菌溶藻基因的獲取方法
【專利摘要】本發明公開了一種檸檬酸桿菌溶藻基因的獲取方法，通過Tail-PCR以及常規PCR技術克隆出了檸檬酸桿菌中的溶藻關鍵基因。本發明通過轉座子以基因重組方式整合到細菌基因組上，從而制備出其突變株，進而使用Tail-PCR克隆出插入位點，克隆出上游基因，再根據上游基因與CitrobacterfreundiiCFNIH1基因組中glucose-1-phosphateadenylyltransferase基因設計一對引物，通過PCR擴增后得到溶藻基因下游基因，將上游基因和下游基因拼接，得到完整的檸檬酸桿菌溶藻基因。
【專利說明】一種檸檬酸桿菌溶藻基因的獲取方法
【技術領域】
[0001]本發明屬于生物【技術領域】，尤其涉及一種檸檬酸桿菌溶藻基因的獲取方法。
【背景技術】
[0002]目前，水污染問題日益加重，尤其是水華的爆發每年都會對人類的生活活動造成不同程度的影響，已嚴重威脅到人類及其他生物的安全。為了避免傳統物理治藻、化學治藻方法在水華治理過程中造成的二次污染，近幾年使用生物治藻的研究越來越多，但是這些研究多數集中在表層溶藻現象的研究，很少在基因層面上對溶藻菌的溶藻機制進行研究。
[0003]目前，轉座突變技術是一種常用的未知基因獲取方法，而常用的用于檸檬酸桿菌突變株構建的轉座子如載體PAG408上的Tn5轉座子、載體pFAG1820上的Tn5轉座子均以卡那霉素抗性基因作為篩選基因，而本發明中的檸檬酸桿菌具有很高的卡那霉素抗性，因此用此類轉座子很難進行突變株的構建，尋找合適的適用于該檸檬酸桿菌突變株的構建方法顯得尤為重要。
【發明內容】
[0004]本發明的目的在于針對現有技術的不足，提供一種檸檬酸桿菌溶藻基因的獲取方法。
[0005]本發明的目的是通過以下技術方案來實現的:以檸檬酸桿菌突變株基因組為模板進行tail-PCR，擴增出檸檬酸桿菌中轉座子插入位點，得到長度為559bp的上游基因，該上游基因序列如SEQ ID N0.5所示，進一步通過PCR擴增技術克隆出其完整下游基因，該下游基因序列如SEQ ID N0.20所示，將上游基因和下游基因拼接，得到完整的檸檬酸桿菌溶藻基因，該基因序列如SEQ ID N0.6所不。
[0006]本發明的有益效果是，通過驗證可知含有Tcl/himarl mariner transposonvector pFAC的質粒pFAC能夠成功用于具有高卡納抗性的檸檬酸桿菌突變株的構建,可以為檸檬酸桿菌基因功能的研究提供技術借鑒，也是首次證明該轉座子能夠成功應用于檸檬酸桿菌屬突變株的構建。同時，檸檬酸桿菌溶藻基因的獲得，對于檸檬酸桿菌屬細菌溶藻機理的研究具有一定的指導作用。
[0007]所述檸檬酸桿菌突變株(TRl)保存于北京市朝陽區北辰西路I號院3號的中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心(CGMCC)，保藏編號=CGMCC N0.9199，分類命名:檸檬酸桿菌(Citrobacter sp.),保藏日期為2014年5月23日。
【專利附圖】
【附圖說明】
[0008]圖1是質粒pFAC圖譜。
【具體實施方式】
[0009] 下面結合具體實施例，進一步闡述本發明。應理解，這些實施例僅用于說明本發明而不用于限制本發明的范圍。在不背離本發明精神和實質的情況下，對本發明的方法、步驟或條件所做的修改或替換，均屬于本發明范圍，若未特殊指明，實施例中所用的技術手段為本領域技術人員所熟悉的常規手段。
[0010]實例I 一種檸檬酸桿菌溶藻突變株(TRl)的制備方法，包括以下步驟:
[0011](I)培養基的配制
[0012]LB培養基的配置:以水為溶劑，每升中含有5g酵母粉、1g蛋白胨和1g NaCl。
[0013]固體培養基的配置:在上述LB培養基中加入2%瓊脂粉。必要時，在培養基中加入50 μ g/mL的慶大霉素(Gm)以增加培養基的選擇性。
[0014]MM培養基的配置:以水為溶劑，每升中含有2gK2HP04.3Η20，0.3g MgSO4.7H20，
0.2g (NH4)2SO4^0.03g CaCl2,0.9gNaCl，微量元素溶液0.5mL，20g葡萄糖；其中，微量元素溶液配方為:MnSO41.2311g/L, ZnSO40.356g/L, FeSO40.256g/L, CuSO4.5Η200.3127g/L。
[0015](2)檸檬酸桿菌突變株的制備
[0016](2.1)使用 5mL LB (含有 50 μ L 濃度為 30mM 的 DAP，7.5 μ L 濃度為 10mg/mL 的慶大霉素)培養基培養E.coli WM3064, 5mLLB培養基培養的檸檬酸桿菌(Rl)，培養條件均為37°C,200rpm, 12h。
[0017]檸檬酸桿菌Rl保存于北京市朝陽區北辰西路I號院3號的中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心(CGMCC)，保藏編號=CGMCC N0.9198，分類命名:檸檬酸桿菌(Citrobacter sp.)，保藏日期為 2014 年 5 月 23 日。
[0018](2.2)將2mLE.coli WM3064的LB培養液與ImL檸檬酸桿菌(Rl)的LB培養液混勻，使用注射器注射到濾膜上，取下濾膜，將濾膜含菌面朝上貼在LB平板上(含DAP和慶大霉素)，37°C培養12h ；
[0019](2.3)使用無菌水洗脫濾膜上的菌體，梯度稀釋后涂布在含有慶大霉素(濃度為15 μ g)的LB平板上，37 °C倒置培養24h ；
[0020](2.4)挑取單菌落到MM培養基中，培養48h后，使用24板挑選出溶藻活性喪失的菌株，即檸檬酸桿菌突變株(TRl)；
[0021](3)突變株(TRl)的驗證
[0022]根據質粒pFAC上慶大霉素抗性基因，質粒pFAC的序列如SEQ ID N0.1所示，慶大霉素抗性基因的序列如SEQ ID N0.21所示，設計一對引物(Gm-S/Gm-A)，Gm-S的序列如SEQID N0.7所示，Gm-A的序列如SEQ ID N0.8所示，
[0023]以突變株基因組作為模板進行PCR驗證，將大小在331bp的突變株基因條帶割膠回收，送至上海生工測序，將測序結果(序列如SEQ ID N0.2所示)與質粒pFAC上攜帶的慶大霉素基因序列比較相似度；同時對篩選到的突變株進行16SrDNA測序(序列如SEQ IDN0.3所示)，測序結果與原始菌株16SrDNA (序列如SEQ ID N0.4所示)序列比對，比較突變株是否由原始菌株突變而來。
[0024]從測序(序列如SEQ ID N0.2)可以看出，該序列大小為331bp，經過blast比對結果可知，該序列一段慶大霉素抗性基因序列，由于原始菌株中并沒有慶大霉素基因，因此可以說明，該突變株中的慶大霉素基因是轉座子所攜帶的，即成功的發生了專做突變。同時將突變株16SrDNA測序結果(序列如SEQ ID N0.3所示)與原始菌株16SrDNA測序結果(序列如SEQ ID N0.4所示)blast比對后發現，其相似度為100%，均為檸檬酸桿菌屬，即證明該突變株是由原始檸檬酸桿菌突變而來的。
[0025]實例2:—種檸檬酸桿菌溶藻基因的獲取方法，包括以下步驟:
[0026](I)獲取上游基因
[0027]以實施例1得到的檸檬酸桿菌突變株的基因組為模板，根據質粒pFAC序列設計兩對引物(Roundl-S/Roundl-A, Round2-S/Round2_A)進行 tail-PCR, Roundl-S 的序列如SEQIDN0.11 所示，Roundl-A 的序列如 SEQ ID N0.12所示，Round2_S 的序列如 SEQ ID N0.13所示，Round2-A的序列如SEQ ID N0.14所示，將第二輪PCR結果中條帶大小在750bp大小的條帶割膠回收，回收產物TA克隆后，轉化到大腸桿菌DH5a中，挑取單菌落提質粒并且PCR驗證后送測，得到長度為559bp的上游基因，序列如SEQ ID N0.5所示。
[0028](2)獲取下游基因
[0029]根據上游基因，設計一條特異引物glaA(序列如SEQ ID N0.17所示)，根據Citrobacter freundii CFNIHl 基因組中 glucose-1-phosphate adenylyltransferase 基因(序列如SEQ ID N0.18所示)設計一條引物glaS，glaS序列如SEQ ID N0.19所示，進一步使用PCR擴增技術克隆出其完整的下游基因，下游基因的序列如SEQ ID N0.20所示。
[0030](3)獲取完整的溶藻基因
[0031]將步驟(1)得到的上游基因和步驟(2)得到的下游基因拼接，得到完整的檸檬酸桿菌的溶藻基因，該基因序列如SEQ ID N0.6所示。
[0032]所述PCR體系及擴增條件
[0033](I)慶大霉素抗性驗證PCR (總體積為20 μ I)
[0034]
【權利要求】
1.一種檸檬酸桿菌溶藻基因的獲取方法,其特征在于,該方法具體為:以檸檬酸桿菌突變株基因組為模板進行tail-PCR，擴增出檸檬酸桿菌中轉座子插入位點，得到長度為559bp的上游基因，該上游基因序列如SEQ ID N0.5所示，進一步通過PCR擴增技術克隆出其完整下游基因，該下游基因序列如SEQ ID N0.20所示，將上游基因和下游基因拼接，得到完整的檸檬酸桿菌溶藻基因，該基因序列如SEQ ID N0.6所示。
2.根據權利 要求1所述的一種檸檬酸桿菌溶藻基因的獲取方法，其特征在于，所述檸檬酸桿菌突變株保存于北京市朝陽區北辰西路I號院3號的中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏編號為CGMCC N0.9199，分類命名:檸檬酸桿菌(CYirohctersp.)。
【文檔編號】C12N15/11GK104131002SQ201410293899
【公開日】2014年11月5日 申請日期:2014年6月26日 優先權日:2014年6月26日
【發明者】孫朋飛, 趙宇華, 王冠, 盧麗玲 申請人:浙江大學