一種高質高效的多酚多糖類植物樣品rna提取方法
【專利摘要】本發明涉及一種多糖多酚類植物樣品RNA的提取方法，結合CTAB法和OMEGA試劑盒所提供的商業試劑盒，開發了一種高效率高質量的RNA提取方法，經過檢驗在黃梁木(Neolamarckia?cadamba)、茶樹(Camellia?sinensis?L.)、枇杷(Eriobotrya?japonica?Lindl.)、月季(Rosa?chinensis)、荔枝(Litchi?chinensis?Sonn.)、銀杏(Ginkgo?biloba?L.)、仙人掌(Opuntia?ficus-indica?L.)、火炬松(Pinus?taeda?L.)、蘆薈(Aloe?barbadensis?Mill.)、紅豆杉(Taxus?media)等植物各組織中都可以使用，效果良好，為今后分子生物學實驗中RNA的提取制備提供了一個良好的選擇。
【專利說明】—種高質高效的多酚多糖類植物樣品RNA提取方法
【技術領域】
[0001]本發明屬于分子生物學【技術領域】，具體地說，本發明涉及一種高效率高質量的植物RNA提取方法。
【背景技術】
[0002]提取高質量的，沒有多糖、多酚、基因組DNA、蛋白質或者其它次生代謝物質污染的RNA對于研究植物生長發育過程中基因的功能和表達方式等很多后續的實驗都至關重要，比如反轉錄PCR,實時定量PCR, cDNA文庫構建，Northern印跡雜交和RNA-seq等。
[0003]酚類很容易被氧化成為醌類，而醌類會和蛋白質及核酸發生不可逆轉的結合。而多糖類物質可以和RNA共沉淀，降低RNA的純度，影響在下游實驗中的使用。
[0004]現在市場上常用的商業RNA提取試劑盒，比如Takara, Promega和Omega等對多酹多糖類植物RNA提取也有較強的局限性。使用CTAB法可以部分克服多糖多酚類物質的干擾，但是CTAB法費時費力，經常會造成RNA的降解。
[0005]以此，我們結合使用CTAB裂解液裂解和試劑盒吸附柱純化的方法，發明了一種高效的在多酚多糖植物樣品中提取高質量RNA的方法。

【發明內容】

[0006]本發明針對目前分子生物學研究中對高質量植物RNA的需求，開發了一種高效率高質量提取含多酚多糖類植物樣品RNA的方法。
[0007]本發明技術方案如下，主要特點是:
[0008]A裂解:液氮研磨后的樣品IOOmg加入經過60 V預熱的CTAB裂解液600 μ I，同時加入12 μ I的β -巰基乙醇，渦旋振蕩2min，60°C裂解lOmin，期間上下顛倒混勻數次，
[0009]B抽提:加入600 μ I按照24:1混勻的氯仿:異戊醇，渦旋震蕩2min離心10min吸取上清后再次用上述氯仿:異戊醇抽提離心10min(對于芽、嫩葉等色素或者其它代謝物質豐富的組織器官要適當增加離心時間，比如黃梁木(Neolamarckia cadamba)的芽離心20min效果最佳)。
[0010]所述裂解液的配制:2% CTAB, 2 % PVP K-40, IOOmM Tris-HCl (pH8.0)，25mMEDTA (pH8.0)，2.0M NaCl，2g/L 亞精胺。
[0011]本發明的高效率高質量的多酚多糖類植物組織RNA提取方法，可以快速提取多酚多糖類植物組織樣品的RNA，并且純度高，無降解，可以直接用于下游實驗。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0012]圖1為使用該方法提取的常見多酚多糖類植物樣品的RNA電泳圖。
[0013]圖2為使用該方法提取的黃梁木各組織RNA電泳圖。
[0014]圖3為使用該方法提取的常見多酚多糖類植物樣品的RNA濃度及OD值。
[0015]圖4為使用該方法提取的黃梁木各組織RNA濃度及OD值。【具體實施方式】
[0016]結合實施例對本發明進行詳細說明。
[0017]實施例一黃梁木葉片RNA的提取
[0018]采取一年生黃梁木(株高1.5m,地徑2.1cm)中上部成熟的葉片,迅速放入液氮速凍，研磨成微小的顆粒放入1.5ml無RNase污染的離心管中，每管樣品約lOOmg。
[0019]提前配制的CTAB裂解液經60°C預熱后，吸取600 μ I加入樣品中，同時加入10 μ I的β -巰基乙醇，渦旋振蕩兩分鐘后60°C恒溫裂解lOmin，期間顛倒混勻數次。
[0020]加入按24:1混勻的氯仿:異戊醇抽提液600ul，渦旋振蕩2min，4°C 14, OOOx g離心IOmin0吸取上清液到一個新的離心管中再次加入600ul的抽提液渦旋振蕩2min，4°C 14，OOOx g 離心 10min.
[0021]吸取上清到一個新的離心管中，加入500ul的Buffer RB,和500ul無水乙醇,顛倒混勻。
[0022]將上述溶液轉移到Hibind RNA Mini column上,常溫10，OOOx g離心Imin,棄去濾液。
[0023]吸附柱上加入300ul RffC wash Buffer,常溫10，OOOx g離心lmin,棄去濾液。
[0024]在吸附柱膜的中央滴入混合好的DNase I消化液75ul (使用時現配，1.5ulRNase-free DNase I 和 73.5ul OBI DNase I Digestion Buffer)，室溫(25°C -30°C )孵育15min。
[0025]將吸附柱轉移至一個新的收集管中，加入400ul RffC wash Buffer,室溫放置5min,常溫10, OOOx g離心lmin,棄去濾液。
[0026]在吸附柱上加入500ul RNA wash Buffer II常溫10，OOOx g離心lmin,棄去濾液(RNA wash Buffer使用前需要按照說明書使用無水乙醇稀釋)。
[0027]重復上述步驟。
[0028]倒出濾液，空管常溫10，OOOx g離心2min。
[0029]將吸附柱放入新的1.5ml無RNase污染的離心管上，加入40ul DEPC water到膜中央，室溫放置2min, 10, OOOx g離心lmin。
[0030]將離心管收集到的溶液重新吸取到吸附柱上，室溫放置2min，10，OOOx g離心Imin0
[0031]棄去吸附柱，保存離心管待用。
[0032]使用核酸蛋白檢測儀及電泳儀檢測濃度、純度及完整度。
[0033]備注:以上步驟所用Buffer RB, Hibind RNA Mini column, RffC wash Buffer,RNase-free DNase I , OBI DNase I Digestion Buffer, RNA wash Buffer II, DEPC water 等試劑及材料均來自Omega產品E.Z.N.A.? Plant RNA KU，其它試劑及材料為常規試劑耗材。
[0034]實施例二黃梁木葉芽RNA的提取
[0035]本實例中將實例一步驟中氯仿:異戊醇抽提離心的時間由IOmin改為20min，其它相同。
[0036]上述實例檢測結果見附圖。
[0037]以上結合附圖對本發明的【具體實施方式】作了說明，但這些說明不能被理解為限制了本發明的范圍，本發明的保護范圍由隨附的權利要求書限定，任何在本發明權利要求基礎上的改動都是本發明的保護范圍。
【權利要求】
1.本發明所述的一種高質高效的多酚多糖類植物組織RNA提取方法，其主要特征在于: A裂解:液氮研磨后的樣品IOOmg加入經過60°C預熱的CTAB裂解液600 μ 1，同時加入10 μ 1的β -巰基乙醇，渦旋振蕩2min，60°C裂解10min，期間上下顛倒混勻數次。 B抽提:加入600 μ I按照24:1混勻的氯仿:異戍醇，潤旋震蕩2min離心10min吸取上清后再次用上述氯仿:異戊醇抽提離心10min(對于芽、嫩葉等色素或者其它代謝物質豐富的組織器官要適當增加離心時間，比如黃梁木(Neolamarckia cadamba)的芽離心20min效果最佳)。 所述裂解液的配制:2 % CTAB, 2 % PVP K-40, 100mM Tris-HCl (pH8.0), 25mMEDTA (pH8.0)，2.0M NaCl，2g/L 亞精胺。 本發明所述的高質高效的多酚多糖類植物組織RNA提取方法，可以快速提取多酚多糖類植物組織樣品的RNA，并且純度高，無降解，可以直接用于下游實驗。
2.根據權利要求1所述的高質高效的多酚多糖類植物組織RNA提取方法，其特征在于步驟A中所涉及的裂解液配方、步驟B中氯仿異戊醇抽提的時間。
3.根據權利要求1所述的高質高效的多酚多糖類植物組織RNA提取方法，其特征在于步驟A中所涉及的CTAB裂解液，DEPC處理后加入2g/L亞精胺。
4.根據權利要求1所述的高質高效的多酚多糖類植物組織RNA提取方法，其特征在于步驟B所涉及的氯仿:異戊醇抽提時間，一般樣品抽提離心10min，對于芽、嫩葉或者其它代謝物質豐富的組織適當延長離心時間。
【文檔編號】C12N15/10GK104017804SQ201410298718
【公開日】2014年9月3日 申請日期:2014年6月26日 優先權日:2014年6月26日
【發明者】李俊成, 歐陽昆唏, 黃浩, 陳曉陽 申請人:華南農業大學