一種針對葉酸代謝基因進行基因分型的試劑盒的制作方法
【專利摘要】本發明提供了一種針對葉酸代謝基因進行基因分型的試劑盒，包括PCR反應液和DNA雜交膜條，所述的DNA雜交膜條由基質載體和探針組成，基質載體上依次固定有四種針對MTHFR基因的探針，以及兩種針對MTRR基因的探針和兩種針對人類基因組設計的探針，所述探針均為能夠與上述基因的SNP位點雜交的寡核苷酸序列，所述探針的核苷酸序列如SEQ?ID?NO：1-8所示。本發明提供的試劑盒的敏感度高，檢測快速，穩定性好，能夠實現高通量檢測，也能夠實現低通量的檢測，靈活性高，對于有些醫院臨床樣本不多的情況下可操作性強，且設備投入少，成本低廉。
【專利說明】一種針對葉酸代謝基因進行基因分型的試劑盒

【技術領域】
[0001]本發明涉及一種葉酸代謝能力相關基因檢測技術，屬于分子生物學基因芯片【技術領域】，具體屬于體外診斷試劑領域中SNP多態性檢測方法，更具體地是運用了多重聚合酶鏈式反應技術和反向點雜交技術。

【背景技術】
[0002]中國是世界上出生缺陷的高發國家之一，每年的出生缺陷兒數量約占全世界的20%。我國常見的出生缺陷有神經管畸形、先天性心臟病、唇腭裂、尿道下裂等。據中國疾病預防控制中心統計資料顯示，每年有80萬-120萬名出生缺陷兒，平均每30秒就有一名缺陷兒出生。其中，除20% -30%患兒經早期診斷和治療可以獲得較好生活質量外，30% -40%患兒在出生后死亡，約40%將成為終身殘疾，這意味著每年將有40萬家庭被卷入終生痛苦的漩渦中。
[0003]出生缺陷的發生原因十分復雜，有些還不為人類所認識，但主要是遺傳因素、環境因素或二者的共同作用。我國是全球神經管畸形高發國家，最常見的就是脊柱裂兒和無腦兒，近年來大量研究已經證實，葉酸缺乏是導致新生兒出生缺陷的主要原因。導致機體缺乏葉酸有兩個方面的原因:一是葉酸攝入量不足，二是由于遺傳(基因)缺陷導致機體對葉酸的利用能力低下(葉酸代謝通路障礙)。
[0004]葉酸屬B族維生素，是合成核酸所必須的元素，是細胞生長和組織修復所必需的物質，更是胚胎發育過程中不可缺少的營養素。葉酸的臨床功能除了預防胎兒神經管缺陷外，還能降低孕婦妊娠高血壓、自發性流產和胎兒宮內發育遲緩、早產以及新生兒低出生體重等發病率。
[0005]科學研究發現，葉酸利用能力受遺傳結構(基因)影響，如果與葉酸代謝相關的酶活性偏低(即相關基因功能異常)，這一人群如按常量(400微克/天)補充葉酸，機體葉酸水平也會不足。遺傳體質的差異導致了機體對葉酸利用能力的差異，因此，葉酸增補應因人而異，增補過多或過少都不利于胎兒健康和孕婦健康。隨著生命科學技術的發展，葉酸利用能力基因檢測與風險評估于2008年即已被中國疾病預防控制中心婦幼保健中心列為臨床應用指南(參見《婦幼保健醫療臨床遺傳檢測項目資料匯編》第六卷臨床應用指南之二十一《葉酸利用能力》)。這一嶄新的生命科學技術成果近兩年來已在國內部分婦幼保健院(四川省內如德陽市婦幼保健院)取得較大成效，為個體化(差異化)增補葉酸、預防新生兒出生缺陷提供了更高水平的科學手段和臨床依據。
[0006]但是，在婦幼保健院的應用中發現一個普遍存在的問題，即50%以上的孕婦是在無意中懷孕的，增補葉酸的時間往往滯后至少2~3個月(懷孕前三個月即應開始增補葉酸)，錯過了補充葉酸的關鍵時期，不利于預防胎兒神經管缺陷。因此，應該提倡葉酸增補從新婚開始(在發達國家，新婚期即開始了葉酸的增補)。
[0007]男性增補葉酸對優生有著同等重要的意義。科學研究進一步表明，葉酸攝入不足，男性機體葉酸水平偏低，主要會導致兩方面的不良后果:一是精子密度低、活性下降、勃起功能減弱，二是精液中攜帶的染色體數量異常(過多或過少，即精子中出現“非整倍體”)，引起唐氏綜合癥或流產。
[0008]綜上所述，通過最先進的科學手段檢測每對新婚夫婦對葉酸的利用能力，不僅可以實現個性化增補葉酸，還可以增強新婚夫婦增補葉酸的意識和依從性，從而更有效地降低新生兒出生缺陷風險。
[0009]科學研究證實，與葉酸代謝密切相關的基因是5，10-亞甲基四氫葉酸還原酶(MTHFR)、甲硫氨酸合成酶還原酶(MTRR)。研究發現，MTHFR677位點的多態性是影響該酶活性的一個重要因素，導致酶活性和熱穩定性下降。若以個體攜帶677CC基因型時其MTHFR活性為100%，攜帶CT基因型的活性則為CC的71%，基因型為TT型的只有34%。另外，研究還發現，MTHFRl298位點的多態性也是影響該酶的活性的一個重要因素，攜帶MTHFR1298C等基因的酶活性為野生型1298A的68%左右，因而阻礙了葉酸代謝，引起一系列疾病發病風險增加。
[0010]甲硫氨酸是蛋白質合成和一碳代謝的必須氨基酸，它的合成是由甲硫氨酸合酶(MTR編碼)催化的，而甲硫氨酸合酶因為輔助因子維生素B12被氧化而最終失活。MTRR編碼的甲硫氨酸合成酶還原酶能夠通過還原型甲基化作用重新生成具有功能活性的甲硫氨酸合酶。MTRR突變是造成葉酸/甲基維生素缺乏癥的主要病因。主要突變型有122M(A66G)
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[0011]MTHFR和MTRR等基因變異引起的相應的酶活性降低可阻抑同型半胱氨酸轉化為甲硫氨酸，導致低葉酸血癥和高同型半胱氨酸血癥，從而增加新生兒出生缺陷風險或自發性流產等風險。
[0012]目前市面上有關葉酸相關基因檢測的方法主要是測序法，雖然測序法是基因檢測的“金標準”，但是測序法檢測周期長，在臨床上，對于患者來說，他們是希望越快拿到檢測結果越好，所以測序法不利于臨床上開展葉酸代謝相關基因的檢測。而且測序法成本相對還高，對患者和相關檢測機構來說，成本都很高，這進一步限制其在臨床上的應用。因此，需要一種既方便又經濟的檢測方法就迫在眉睫。


【發明內容】

[0013]本發明提供了一種針對葉酸代謝基因進行基因分型的試劑盒，解決了現有技術中的不足，本發明可以方便靈活地對單個或多個樣本進行檢測。
[0014]實現本發明上述目的所采用的技術方案為:
[0015]一種針對葉酸代謝基因進行基因分型的試劑盒，包括PCR反應液和DNA雜交膜條，所述的DNA雜交膜條由基質載體和探針組成，基質載體上依次固定有四種針對MTHFR基因的探針，以及兩種針對MTRR基因的探針和兩種針對人類基因組設計的探針，所述探針均為能夠與上述基因的SNP位點雜交的寡核苷酸序列，所述探針的核苷酸序列分別為:
[0016]針對MTHFR 基因 677C 位點的探針 Tl:5’ -GGGAGCCGATTTCATC-3’ ；如 SEQ ID NO:I所示，
[0017]針對MTHFR 基因 677T 位點的探針 T2:5’ -GGGAGTCGATTTCATC-3’ ；如 SEQ ID NO:2所示，
[0018]針對MTHFR 基因 1298A 位點的探針 T3:5 ’ -ACCAGTGAAGAAAGTGTC-3 ’ ；如 SEQ IDNO:3所示，
[0019]針對MTHFR 基因 1298C 位點的探針 T4:5 ’ -ACCAGTGAAGCAAGTGTC-3 ’ ；如 SEQ IDNO:4所示，
[0020]針對MTRR 基因 66A 位點的探針 T5:5 ’ -TCGCAGAAGAAATATGTGAG-3 ’ ；如 SEQ ID NO:5所示，
[0021]針對MTRR 基因 66G 位點的探針 T6:5’ -TCGCAGAAGAAATGTGTGA-3’ ；如 SEQ ID NO:6所示，
[0022]針對人類基因組設計的陽性質控探針T7:5’ -TTGAACAGGTGGAGGC-3’ ；如SEQ IDNO:7所示，
[0023]針對人類基因組設計的陰性質控探針T8:5’ -TGGCCAGCGTGGACAAC-3’ ；如SEQ IDNO:8所示，
[0024]上述探針均進行5’端氨基標記以用于與基質載體偶聯，上述探針的濃度為5_20uMo
[0025]所述的基質載體上還設置有顯色控制探針CC，所述顯色控制探針CC的核苷酸序列如SEQ ID NO:9所示:
[0026]5 ’ -TTCGGTTGGGCTTTAC-3 ’，所述顯色控制探針CC的5 ’端進行氨基標記，3 ’端進行生物素標記。
[0027]所述PCR反應液中含有擴增包含MTHFR基因677位點、1298位點以及MTRR基因66位點的引物，所述引物的濃度為0.01-0.05uM，所述引物的核苷酸序列如下:
[0028]針對MTHFR基因677位點的上游引物Ml:
[0029]5，-GGAGGACTGCTCACGAACTTCAGTCATGAGCCCAGCC-3，；如 SEQ ID NO:10 所示，
[0030]針對MTHFR基因677位點的下游引物M2:
[0031]5’ -GGGACACGCAGTCGACATCGCAAGTGATGCCCATGTC-3’ ；如 SEQ ID NO:11 所示，
[0032]針對MTHFR基因1298位點的上游引物M3:
[0033]5，-GGAGGACTGCTCACGAACTTGCTTGTGGTTGACCTGG-3，；如 SEQ ID NO:12 所示，
[0034]針對MTHFR基因1298位點的下游引物M4:
[0035]5，-GGGACACGCAGTCGACATCTCCCTTTGCCATGTCCAC-3，；如 SEQ ID NO:13 所示，
[0036]針對MTRR基因66位點的上游引物M5:
[0037]5，-GGAGGACTGCTCACGAACTAGCCCAAGTAGTTTCGAGC-3，；如 SEQ ID NO:14 所示，
[0038]針對MTRR基因66位點的下游引物M6:
[0039]5，-GGGACACGCAGTCGACATCCCACTGTAACGGCTCTAACC-3，，如 SEQ ID NO:15 所示。
[0040]所述PCR反應液中含有擴增包含MTHFR基因677位點、1298位點以及MTRR基因66位點的通用引物，所述通用引物的濃度為0.01-0.05uM，所述通用引物的核苷酸序列如下:
[0041]通用上游引物M7:5’ -GGAGGACTGCTCACGAACT-3’ ；如 SEQ ID NO:16 所示；
[0042]通用下游引物M8:5’-GGGACACGCAGTCGACATC-3’ ；如 SEQ ID NO: 17 所示；所述通用下游引物的5’端進行生物素標記。
[0043]所述的基質載體為玻片或尼龍膜。
[0044]本發明同時還提供了針對葉酸代謝基因進行基因分型的方法，該方法包括以下步驟:
[0045]A.設計相關基因分型的引物和探針，所述探針如SEQ ID NO: 1_9所示，所述引物如 SEQ ID NO:10-16 所示。
[0046]B.用活性氨基標記步驟A中的探針的5’端，并將其依次固定在尼龍膜上，制成檢測的膜條，對所述下游通用引物M8的5’端進行生物素標記，對顯色控制探針CC的5’端進行氨基標記，并對其3’端進行生物素標記。
[0047]C.利用步驟A所述引物進行人類基因組的PCR擴增，將擴增產物與檢測膜條雜交，以過氧化物酶和四甲基聯苯胺顯色。
[0048]D.采用掃描儀進行雜交信號的掃描或是肉眼直接觀察，然后判斷分型結果。
[0049]本發明提供的技術方案與現有技術相比有以下優點:
[0050](I)本發明的試劑盒的敏感度高，檢測快速，穩定性好，能夠實現高通量檢測，也能夠實現低通量的檢測，靈活性高，對于有些醫院臨床樣本不多的情況下可操作性強，且設備投入少，成本低廉。
[0051](2)本發明對樣本的要求很低，可以是抗凝血，也可以是無創采樣的唾液等。
[0052](3)本發明的試劑盒由于采用通用引物進行PCR擴增，擴增條件一致的情況下，還只使用了一個生物素標記的通用引物，大大節省了試劑成本，相比市面上的一些試劑成本更低廉。
[0053](4)本發明的一個特點是試劑盒中有陽性質控探針、陰性質控探針以及顯色反應質控探針，陽性質控可以監控DNA提取的質量，PCR反應的過程等，陰性質控可以監控PCR過程中的污染等情況，顯色反應點可以監控雜交過程是否正確與否，這些質控的加入，大大增加了結果的可靠性和準確性。
[0054](5)本發明的另一個意義是通過MTHFR基因677、1298位點基因型及MTRR基因66位點基因型的結果，結合臨床情況來綜合判斷葉酸的合理攝入量，從而有效指導合理用藥。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0055]圖1為本發明所提供的試劑盒中基質載體上各探針位置示意圖；
[0056]圖2為本發明實施例中進行PCR擴增的循環參數圖。
[0057]圖3為MTHFR基因677TT、1298GG基因型及MTRR基因66GG基因型結果掃描圖；
[0058]圖4為MTHFR基因677CC、1298AA基因型及MTRR基因66AA基因型結果掃描圖；
[0059]圖5為MTHFR基因677CT、1298AG基因型及MTRR基因66AG基因型結果掃描圖；
[0060]圖6為MTHFR基因677CC、1298AG基因型及MTRR基因66GG基因型結果掃描圖；

【具體實施方式】
[0061]下面結合具體實施例和附圖對本發明做詳細具體的說明，但是本發明的保護范圍并不局限于以下實施例。
[0062]本實施例提供的針對葉酸代謝基因進行基因分型的試劑盒，括PCR反應液和DNA雜交膜條，所述的DNA雜交膜條由基質載體和探針組成，基質載體上依次固定有四種針對MTHFR基因的探針，以及兩種針對MTRR基因的探針和兩種針對人類基因組設計的探針，所述探針均為能夠與上述基因的SNP位點雜交的寡核苷酸序列，基質載體上各探針位置如圖1所示。所述的基質載體可以是玻片、尼龍膜或是其他可以固定探針的載，本實施例中為尼龍膜。
[0063]上述探針中，針對MTHFR基因677C位點的探針Tl其核苷酸序列如SEQ ID N0:1所示。針對MTHFR基因677T位點的探針T2其核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示。針對MTHFR基因1298A位點的探針T3其核苷酸序列如SEQ ID NO:3所示。針對MTHFR基因1298C位點的探針T4其核苷酸序列如SEQ ID NO:4所示。針對MTRR基因66A位點的探針T5其核苷酸序列如SEQ ID NO: 5所示。針對MTRR基因66G位點的探針T6其核苷酸序列如SEQ IDN0:6所示。針對人類基因組設計的陽性質控探針T7其核苷酸序列如SEQ ID N0:7所示。針對人類基因組設計的陰性質控探針T8其核苷酸序列如SEQ ID N0:8所示。上述探針均進行5’端氨基標記以用于與基質載體偶聯，上述探針的濃度為5-20uM。
[0064]本發明中將高靈敏度的多重聚合酶鏈反應(PCR)技術和反向點雜交技術進行了結合，從而得到一種全新的基因及基因突變檢測技術。本發明中將特異的探針分別固定到固相載體上，再將經PCR特異性擴增的產物(在PCR引物5’端預先進行生物素標記，使擴增產物相應標記有生物素)與之雜交，這樣待檢樣本就會與具有同源序列的探針結合，經洗滌去除未結合的DNA樣本，由于待測的DNA樣本具有生物素類的標記物，結合了待測DNA的探針點上就帶有生物素類的標記物，通過酶聯反應及顯色，肉眼就能判斷出基因分型的結果，更適用于臨床檢測的需要。本發明具體針對MTHFR基因677位點、1298位點及MTRR基因66位點的核苷酸序列，設計一套特異性的探針，采用合適的濃度，按照圖1所示位置，采用自動點樣儀進行點樣，將相應探針印制在尼龍膜相應區域上，在本實施例中將探針稀釋到5XSSC、0.05% SDS溶液中，終濃度為5uM，每個探針點樣lul，從而制成特定的雜交膜條。根據顯色位點的不同，來判斷各位點的基因型別。
[0065]所述的尼龍膜上還設置有顯色控制探針CC，所述顯色控制探針CC的核苷酸序列如SEQ ID NO:9所示，所述顯色控制探針CC的5’端進行氨基標記，3’端進行生物素標記。所述的顯色控制探針CC 的引入可對顯色過程進行有效的質量控制。
[0066]所述PCR反應液中含有擴增包含MTHFR基因677位點、1298位點以及MTRR基因66位點的引物，所述引物的濃度為0.01-0.05uM，所述引物的核苷酸序列如下:針對MTHFR基因677位點的上游引物Ml其核苷酸序列如SEQ ID NO:10所示，針對MTHFR基因677位點的下游引物M2其核苷酸序列如SEQ ID NO:11所示，針對MTHFR基因1298位點的上游引物M3:其核苷酸序列如SEQ ID NO: 12所示，針對MTHFR基因1298位點的下游引物M4其核苷酸序列如SEQ ID NO:13所示，針對MTRR基因66位點的上游引物M5其核苷酸序列如SEQ ID NO:14所示，針對MTRR基因66位點的下游引物M6其核苷酸序列如SEQ ID NO:15所示。
[0067]所述PCR反應液中含有擴增包含MTHFR基因677位點、1298位點以及MTRR基因66位點的通用引物，所述通用引物的濃度為0.01-0.05uM，所述通用引物的核苷酸序列如下:通用上游引物M7其核苷酸序列如SEQ ID NO:16所示；通用下游引物M8其核苷酸序列如SEQ ID NO:17所示；所述通用下游引物的5’端進行生物素標記。
[0068]在實際檢測時，將提取好的基因組DNA加入到PCR反應液中，采用多重PCR反應，擴增出帶有生物素標記的目的基因片段，取DNA雜交膜條和45ulPCR產物進行雜交顯色反應，雜交溫度設定為45°C，雜交時間為60分鐘，然后洗滌，再顯色，肉眼判斷顯色結果。
[0069]本實施中例提供的上述試劑盒進行基因分型的方法如下:
[0070]取100例臨床樣本進行本發明的試劑盒進行檢測，同時用測序法進行對比實驗。
[0071]a.樣本DNA的提取。
[0072]臨床樣本可以是EDTA-抗凝血，也可以是唾液樣本，方便靈活多樣，采用市面上相應的試劑盒進行提取DNA。取5ulDNA加入到試劑盒中的PCR反應液中，
[0073]b.按圖2所示循環參數進行PCR擴增:
[0074]c.采用本發明的DNA雜交膜條，對以上PCR產物進行雜交檢測。首先將PCR產物進行預變性，95°C，5min，然后立即置于冰水混合物上預冷。
[0075]d.雜交:
[0076]取5mL離心管，放入標記膜條I張，標記好對應的檢測樣本編號，加2ml雜交緩沖液液、對應的PCR產物40ul，蓋緊管蓋，放入振蕩水槽(或空氣浴搖床)，45°C下輕搖(約100轉/分)40分鐘。同時預熱洗膜緩沖液。
[0077]e.偶聯:
[0078]雜交結束后，將膜條從雜交管里取出，放入50mL離心管中(最多可在同一管里處理10張膜片)；
[0079]加預熱洗膜緩沖液20ml，POD液1ul，混勻，使膜條充分展開。45°C輕搖(40~50轉/分)10分鐘，棄去液體；
[0080]加預熱洗膜緩沖液40ml，45°C輕搖3分鐘，棄去液體；重復I次；
[0081]加顯色緩沖液40ml，室溫輕搖3分鐘，棄去液體。
[0082]f.顯色:
[0083]取50ml離心管，加顯色緩沖液20ml，TMBlml，H2O21ul,混勻即為顯色液。
[0084]放入膜條后水平混勻，使膜條充分展開后在室溫避光靜置8分鐘，棄去液體。
[0085]加顯色緩沖液40ml，輕搖3分鐘，棄去液體。取出雜交膜條，顯色完成。
[0086]g.結果分析:
[0087]用吸水紙吸去膜條表面水分，在掃描儀上盡快掃描。顯色反應控制點(CC)顯色正常，表示偶聯和顯色過程正常，否則需要重新檢查雜交過程。
[0088]圖3、圖4、圖5、圖6為膜條雜交結果顯色掃描圖，參照分型結果進行分析和統計。與測序結果進行對比發現，一致性為100%。
[0089]實施例說明了本發明產品在檢測通量方面的優勢，一次可做任意數量的樣本，檢測的準確性和可靠性都很高，檢測結果與測序結果完全相符。
[0090]以上所述僅為本發明的實施例，并非因此限制本發明的專利范圍，凡是利用本發明說明書及附圖內容所作的等效結構或等效流程變換，或直接或間接運用在其他相關的【技術領域】，均同理包括在本發明的專利保護范圍內。
【權利要求】
1.一種針對葉酸代謝基因進行基因分型的試劑盒，包括PCR反應液和DNA雜交膜條，其特征在于:所述的DNA雜交膜條由基質載體和探針組成，基質載體上依次固定有四種針對MTHFR基因的探針，以及兩種針對MTRR基因的探針和兩種針對人類基因組設計的探針，所述探針均為能夠與上述基因的SNP位點雜交的寡核苷酸序列，所述探針的核苷酸序列分別為: 針對 MTHFR 基因 677C 位點的探針 Tl:5’ -GGGAGCCGATTTCATC-3’ ； 針對 MTHFR 基因 677T 位點的探針 T2:5’ -GGGAGTCGATTTCATC-3’ ； 針對 MTHFR 基因 1298A 位點的探針 T3:5’ -ACCAGTGAAGAAAGTGTC-3’ ； 針對 MTHFR 基因 1298C 位點的探針 T4:5’ -ACCAGTGAAGCAAGTGTC-3’ ； 針對 MTRR 基因 66A 位點的探針 T5:5’ -TCGCAGAAGAAATATGTGAG-3’ ； 針對 MTRR 基因 66G 位點的探針 T6:5’ -TCGCAGAAGAAATGTGTGA-3’ ； 針對人類基因組設計的陽性質控探針T7:5’ -TTGAACAGGTGGAGGC-3’ ； 針對人類基因組設計的陰性質控探針T8:5’ -TGGCCAGCGTGGACAAC-3’ ； 上述探針均進行5’ 端氨基標記以用于與基質載體偶聯，上述探針的濃度為5-20uM。
2.根據權利要求1所述的進行基因分型的試劑盒，其特征在于:所述的基質載體上還設置有顯色控制探針CC，所述顯色控制探針CC的核苷酸序列如下所示: 5’ -TTCGGTTGGGCTTTAC-3’，所述顯色控制探針CC的5’端進行氨基標記，3’端進行生物素標記。
3.根據權利要求1所述的進行基因分型的試劑盒，其特征在于:所述PCR反應液中含有擴增包含MTHFR基因677位點、1298位點以及MTRR基因66位點的引物，所述引物的濃度為0.01-0.05uM，所述引物的核苷酸序列如下: 針對MTHFR基因677位點的上游引物Ml:
5， -GGAGGACTGCTCACGAACTTCAGTCATGAGCCCAGCC-3，； 針對MTHFR基因677位點的下游引物M2:
5’ -GGGACACGCAGTCGACATCGCAAGTGATGCCCATGTC-3’ ； 針對MTHFR基因1298位點的上游引物M3:
5’ -GGAGGACTGCTCACGAACTTGCTTGTGGTTGACCTGG-3’ ； 針對MTHFR基因1298位點的下游引物M4:
5’ -GGGACACGCAGTCGACATCTCCCTTTGCCATGTCCAC-3’ ； 針對MTRR基因66位點的上游引物M5:
5’ -GGAGGACTGCTCACGAACTAGCCCAAGTAGTTTCGAGC-3’ ； 針對MTRR基因66位點的下游引物M6:
5，-GGGACACGCAGTCGACATCCCACTGTAACGGCTCTAACC-3，。
4.根據權利要求1所述的進行基因分型的試劑盒，其特征在于:所述PCR反應液中含有擴增包含MTHFR基因677位點、1298位點以及MTRR基因66位點的通用引物，所述通用引物的濃度為0.01-0.05uM，所述通用引物的核苷酸序列如下: 通用上游引物 M7:5’ -GGAGGACTGCTCACGAACT-3’ ； 通用下游引物 M8:5’ -GGGACACGCAGTCGACATC-3’ ； 所述通用下游引物的5’端進行生物素標記。
5.根據權利要求1所述的進行基因分型的試劑盒，其特征在于:所述的基質載體為玻片或尼龍膜。
【文檔編號】C12Q1/68GK104131087SQ201410330456
【公開日】2014年11月5日 申請日期:2014年7月11日 優先權日:2014年7月11日
【發明者】徐志勇, 秦偉 申請人:武漢千麥醫學檢驗所有限公司