專利名稱：葉酸利用能力基因檢測試劑盒及檢測方法
技術領域：
本發明涉及一種基因檢測技術領域，尤其涉及一種葉酸利用能力基因檢測試劑盒及檢測方法。
背景技術：
葉酸是一種B族維生素，人體本身不能合成。從食物中攝取的葉酸只有在葉酸還原酶的作用下，還原為四氫葉酸，才能參與人體許多重要的生化代謝反應，是機體細胞生長和分裂所必需的物質，也是人體內參與合成堿基的關鍵輔助因子。因此，缺乏葉酸，胎兒、嬰幼兒會出現發育缺陷和遲緩。在孕婦中大力推廣“葉酸強化”，從某種程度上減少了出生缺陷。孕婦一般采用每天服用一粒葉酸片(400微克)的形式補充葉酸，對于葉酸利用能力正常的孕婦這個用量是充足的，但對于葉酸利用能力不足的孕婦卻遠遠不夠。此外，最近發現“葉酸強化”還存在一定負面效應，大范圍人群大量補充葉酸，人為地造成未來的人口對于 大量維生素產生依賴性，由此，可能導致人口整體的基因組成發生變化，這種人群對于某些致命的疾病將變得十分脆弱。因此，鑒別出葉酸利用能力正常和葉酸利用能力不足的人群，個性化合理的補充葉酸具有重要的現實意義和長遠意義。部分葉酸利用能力不足的孕婦，其葉酸代謝途徑相關酶基因發生了突變，導致了酶分子一個氨基酸的替換，使酶活性大大下降而影響葉酸的利用能力。已經報道葉酸代謝途徑中一些酶基因的多態性與神經管畸形、心血管疾病、唐氏綜合征、流產、淋巴細胞性白血病、乳腺癌、胃癌、Andesophageal腫瘤、阿爾茨海默病等疾病相關聯。在葉酸利用能力相關的基因檢測技術臨床應用之前，婦產科醫師通常只能建議所有孕婦按照標準量、標準時間來服用葉酸。我們提出個體化合理使用葉酸，為此研發了本試劑盒，通過本試劑盒檢測，可檢測出影響葉酸代謝和利用能力的一些已知的常見的突變，將亞健康人群分為疾病風險高、中、低三個亞群，指導這些人群個性化使用葉酸，對高風險人群進行特異性個性化干預。有針對性的合理補充葉酸，可以消除過度“葉酸強化”帶來的負面影響。本試劑盒以我國常見的葉酸不足引發的疾病(神經管畸形、心血管疾病、唐氏綜合征、流產、淋巴細胞性白血病、乳腺癌、胃癌、andesophageal腫瘤、阿爾茨海默病)為代表性目標疾病，對于阻止亞健康向疾病轉變以及促進健康恢復起到一定作用，為我國出生缺陷的降低將起到一定作用。此外，腫瘤生長過程中需要大量合成DNA，由于葉酸對DNA的加工很重要，因此葉酸代謝途徑也被作為抗腫瘤治療的靶點。一個叫甲氨喋呤的化合物就是葉酸的類似物，它可抑制葉酸的代謝，目前仍是臨床上多種腫瘤的化療藥物，適用于急性白血病、乳腺癌、絨毛膜上皮癌及惡性葡萄胎、頭頸部腫瘤、骨腫瘤、白血病腦膜脊髓浸潤、肺癌、生殖系統腫瘤、肝癌、頑固性普通牛皮癬及自身免疫病等。這類化療藥物對葉酸代謝正常的患者療效較為明顯。因此在使用針對葉酸代謝的抗腫瘤藥物之前，也可通過本試劑盒檢測，篩選出存在葉酸利用能力低下風險的個體，指導臨床醫生合理選擇抗腫瘤藥物。
目前，傳統基因突變檢測方法包括單鏈構象多態性分析(Single StrandConformation Polymorphism, SSCP)、PCR-限制性片段長度多態性(Restriction FragmentLength Polymorphism, RFLP)、變性高效液相色譜(Denaturing High Performance LiquidChromatography,DHPLC)、直接測序、基因芯片等。這些方法或者檢測能力有限、或者耗時費力、所需設備和耗材昂貴，更重要的是，除基因芯片外，這些方法難以針對不同基因的多個突變位點同時進行高通量檢測。而基因芯片技術平臺成本昂貴，對環境和人員素質要求高，難以在我國廣大醫療機構中普及，因此有必要建立一種高通量、高效能、低成本的葉酸代謝相關酶基因突變篩查方法，以實現臨床快速檢測和規模化篩查。我們研發的試劑盒在臨床應用上具有明顯的優勢。傳統的基因檢測技術中每個位點都要單獨檢測，大大浪費了檢測的時間、試劑、人力和物力，效率低。使用本試劑盒檢測，在一個反應管中可以同時對16個位點進行檢測，最終給出16個位點的基因分型結果。我們開發的利用SNaPshot技術檢測葉酸利用能力相關酶基因的技術平臺，其原理是多重PCR擴增目的區域后，經寡核苷酸引物延伸標記擴增，突變位點匹配上一個熒光 標記的雙脫氧核苷酸后終止延伸。然后通過毛細管電泳進行片段分析，相當于單個位點的微測序，可以檢測單核苷酸的突變。延伸位點堿基的類型決定電泳峰的顏色，根據峰的顏色可以清楚方便的判斷為野生型(正常)還是突變型；延伸引物的片段長度決定峰的位置；延伸引物的濃度影響電泳檢測的峰高。

發明內容
本發明的目的是提供一種葉酸利用能力基因檢測試劑盒及檢測方法，它能針對目前中國人群葉酸利用能力相關基因突變的特點，選擇覆蓋范圍廣泛的16個突變熱點作為篩查目標，彌補目前現有突變篩查方法的不足，提供一種簡單、高通量、高效能、低成本的適合中國人群的葉酸利用能力基因突變篩查方法。為了解決背景技術所存在的問題，本發明是采用以下技術方案葉酸利用能力基因檢測試劑盒包含(1) 0 反應試劑，包括(1見1\5\和10XPCR緩沖液、Mg2+離子、去離子水、FastTaq酶、SNaPshot Mix 混合液；(2)按一定比例混合的PCR擴增的正向引物和反向引物；各引物的濃度見圖I ;(3)按一定比例混合的的延伸引物；各引物的終濃度參見圖I ;圖I為推薦的使用濃度配比，具體在使用時，如果某個電泳峰的峰高過低，可適當增加引物加入量，如果峰過高，可以適當減少引物用量，以達到最佳檢測效果。(4)純化用SAP酶、Exon I酶及其配套的緩沖液；(5)單個位點純合、雜合突變的陽性和陰性對照DNA ；(6)使用說明書。它的檢測方法為通過多重PCR擴增，使被檢測樣本的16個目的片段得到擴增富集；然后進行擴增產物的酶反應純化，去除多余的引物及dNTP “雜質”；再利用針對突變位點設計的16條延伸引物，對16個富集的片段進行單堿基的延伸反應，僅對突變位點的單個堿基進行熒光標記擴增，突變位點匹配上一個熒光標記的雙脫氧核苷酸后終止延伸；然后再進行一次擴增產物的酶反應純化；最后經毛細管電泳進行擴增片段分析，相當于單個位點的微測序，這樣可以檢測單核苷酸的突變，延伸位點堿基的類型決定電泳峰的顏色，延伸弓I物的片段長度決定峰的位置，延伸弓I物的濃度影響電泳檢測的峰高。所述的試劑盒包含檢測CBS基因C699T、DHFR基因c594+59dell9、FOLHl基因T1561C,GSTOl 基因 C428T、MTHFD1 基因 G878A、MTHFD 基因 G1958A、MTHFR基因 A1298C、MTHFD基因 C677T、MTR基因 A2756G、MTRR基因 A66G、NAT1 基因 C1095A、NFE2L2基因 insl+C11108T、RFCl基因G80A、SHMT1基因C1420T、TCN2基因C776G和TYMS基因1494del6十六個基因突變位點的引物第一組所述檢測CBS基因C699T位點突變的引物的堿基序列為擴增引物P1_FTTTCTATGCAGTACCGCAACG ；Pl-R AATCAAGATGGACAGAGGGAC ；

延伸引物El: (T) 22AGCAACCCCCTGGCTCACTA ；第二組所述檢測DHFR基因c594+59dell9位點突變的引物的堿基序列為擴增引物P2-FACTGCATCGTCGCTGTGTC ；P2-R CGGGCAGAAATCAGCAAC ；延伸引物E2: (T) 34AGGCTGCCCACGGTCGGGGT ；第三組所述檢測FOLHl基因T1561C位點突變的引物的堿基序列為擴增引物P3-FTCCAACTTCAGAAACCTT ；P3-R TTAGTATACCGTGCTCTGC ；延伸引物E3 :⑴ 34GCAAATTGGGATCTGGAAATGAT ；第四組所述檢測GSTOl基因C428T位點突變的引物的堿基序列為擴增引物P4-FATTCTCTGTCTAGGTGCCATC ；P4-R CTCCTCTAGCTTGGTAAATTC ；延伸引物E4:⑴ 29CCAAAATAAAGAAGACTATG ；第五組所述檢測MTHFDl基因G878A位點突變的引物的堿基序列為擴增引物P5-FGCTTGAAACTGAGGTGAG ；P5-R AGGTTGTTATACTGAATCATCC ；延伸引物E5: (T) 4CACAGTAGAGAGTGCCAAGC ；第六組所述檢測MTHFD基因G1958A位點突變的引物的堿基序列為擴增弓 I物P6-F GTTTGCCAACATCGCACATG ；P6-R CTAACCTACAAACCCTTCTGG ；延伸引物E6: (T) 12CCTCCATCATTGCAGACC ；第七組所述檢測MTHFR基因A1298C位點突變的引物的堿基序列為擴增引物P7-F:CGAGAGGTAAAGAACGAAGAC ；P7-R TTCTACCTGAAGAGCAAGTCC ；延伸引物E7:⑴ 34GGAGGAGCTGACCAGTGAAG ；第八組所述檢測MTHFD基因C67H位點突變的引物的堿基序列為擴增引物P8-FTGAAGCACTTGAAGGAGAAGG ；P8-R CCTTCACAAAGCGGAAGAATG ；延伸引物E8 :⑴ 12GGAGAAGGTGTCTGCGGGAG ；
第九組所述檢測MTR基因A2756G位點突變的引物的堿基序列為擴增引物P9_FCATTGACCATTACTACACCAG ；P9-R TCTGTTTCTACCACTTACCTTG ；延伸引物E9ATGGAAGAATATGAAGATATTAGACAGG ；第十組所述檢測MTRR基因A66G位點突變的引物的堿基序列為擴增引物P10-FTATATGCTACACAGCAGGGAC ；PlO-R GGCTCTAACCTTATCGGATTC ；延伸引物ElO:⑴ 2(iAAGGCCATCGCAGAAGAAAT ； 第^^一組所述檢測NATl基因C1095A位點突變的引物的堿基序列為擴增引物Pll-FCTAGACATCAAATCATTTCACC ；Pll-R CTTTCTAGCATAAATCACCAAT ；延伸引物E11TAACCACAGGCCATCTTTAAAA ；第十二組所述檢測NFE2L2基因insl+C11108T位點突變的引物的堿基序列為擴增引物P12-FAACTGACTGAGCAACTATTACG ；P12-R ATTGCTCCTCTGTGTCTCC ；延伸引物E12: (T) 14CTTAGAGGAACTCATATCCTAAG ；第十三組所述檢測RFCl基因G80A位點突變的引物的堿基序列為擴增引物P13-F:CATGAAGCCGTAGAAGCAAAG ；P13-R AGAAGCAGGTGCCCGTGGAA ；延伸引物E13 (T) 25CGAGCTCCGGTCCTGGCGGC ；第十四組所述檢測SHMTl基因C1420T位點突變的引物的堿基序列為擴增引物P14-FGTTCAAGGAGAGACTGGC ；P14-R GCTCATCCATCTCTCAGG ；延伸引物E14⑴ 7AGGTTGAGAGCTTCGCCTCT ；第十五組所述檢測TCN2基因C776G位點突變的引物的堿基序列為擴增引物P15-FTCCTCACTCTATCACCAGTTC ；P15-R TCATGAGAGCATTCTGGAAGG ；延伸引物E15 (T) 38CCTCATGACTTCCCCCATGC ；第十六組所述檢測TYMS基因1494del6位點突變的引物的堿基序列為擴增引物P16-FAGGAACTGAGCAGATAAGTGG ；P16-R CGATCATGATGTAGAGTGTGG ；延伸引物E16 (T)4qGAGTGTGGTTATGAACTTTA。所述的PCR擴增引物及延伸引物用于針對人類基因組中目的區域DNA的擴增以及目的位點的微測序，進而達到基因分型的目的，以實現特定核苷酸變異的檢測(其序列參見圖I)。所述的PCR擴增引物和延伸引物濃度的優化配置，使其能夠在延伸反應時兼顧各個位點的產量，利于后續檢測中各個位點突變情況的判斷識別。本發明中的PCR擴增引物設計時選擇目的區域上下游70_150bp的距離作為引物設計的起始部位，引物與之序列匹配的特異性要好，引物間的退火溫度要盡量一致(55°C左右)。使在一個多重PCR反應中的各個擴增引物的擴增效率相當。本發明中16個突變位點的延伸引物在設計時的指導思想是根據不同序列情況，在突變點的上游或下游選取正向或反向與突變位點5’端或3 ‘端序列互補結合的17-25bp的序列；避免序列中有難以解鏈的二級結構；確保延伸的單個堿基不在序列上，并保證缺失型突變下一個堿基與缺失的堿基為不同堿基；各個延伸引物片段全長應該有一定的差異，通過在片段的5 ‘端加上若干個T，使得延伸引物長度均勻分布在18-70bp之間(參見圖I)，以便于通過毛細管電泳分離檢測(其序列參見圖I)。16個位點的延伸產物長度見圖I。這樣經過PCR擴增后，帶有不同熒光的不同長度的片段經毛細管電泳后就能夠分析出相應片段所攜帶的堿基類型，進而可以判斷是否存在該堿基的突變，并區分屬于野生型、純合突變還是雜合突變，使上述16個位點一次性得到精確的基因分型。本發明中設計的PCR擴增引物和延伸引物序列，通過核酸合成儀人工合成，并與PCR擴增反應試劑，包括dNTP、5X和10XPCR緩沖液、Mg2+離子、去離子水、FastTaq酶、SNaPshot Mix混合液、純化用SAP酶、Exon I酶及其配套的緩沖液；16個位點雜合突變型 的混合DNA陽性標本，以及說明書組合起來，提供用于體外檢測葉酸利用能力基因突變篩查的試劑盒，其主要功能在于，將所需的試劑集成在一個小盒內，使得核酸片段擴增、純化可以在試劑盒提供試劑的基礎上順序完成。本發明能針對目前中國人群葉酸利用能力相關基因突變的特點，選擇覆蓋范圍廣泛的16個突變熱點作為篩查目標，彌補目前現有突變篩查方法的不足，提供一種簡單、高通量、高效能、低成本的適合中國人群的葉酸利用能力基因突變篩查方法。


圖I為本發明的PCR擴增引物、延伸引物及結果判讀的表格圖；圖2為本發明的SNaPshot實驗流程示意圖；圖3為本發明的毛細管電泳結果圖。電泳順序由左向右依次為NATl C1095A、MTHFDl G878A、SHMTl C1420T、MTHFD G1958A、MTHFRC677T、MTR A2756G、NFE2L2insl+C11108T、MTRR A66G、CBS C699T、RFCl G80A、GSTOl C428T、MTHFR A1298C、DHFRc594+59dell9、F0LHlT1561C、TCN2 C776G、TYMS 1494del6。理論上的片段長度分別為 22bp、24bp,27bp,30bp,32,33bp,37bp,40bp,42bp,45bp,49bp,51bp,54bp,56bp,57bp,61bp 和60bp。實際電泳過程可能會存在飄移現象，即與分子量標記所測片段大小有一定差距，如60bp片段會飄移到61bp片段后面，但不會影響整體結果判讀。
具體實施例方式參照圖1-3本具體實施方式
采用以下技術方案葉酸利用能力基因檢測試劑盒包含(1) 0 反應試劑，包括(1見1\5\和IOXPCR緩沖液、Mg2+離子、去離子水、FastTaq酶、SNaPshot Mix 混合液；(2)按一定比例混合的PCR擴增的正向引物和反向引物；各引物的濃度見圖I ;(3)按一定比例混合的延伸引物；各引物的終濃度參見圖I ;圖I為推薦的使用濃度配比，具體在使用時，如果某個電泳峰的峰高過低，可適當增加引物加入量，如果峰過高，可以適當減少引物用量，以達到最佳檢測效果。(4)純化用SAP酶、Exon I酶及其配套的緩沖液；(5)單個位點純合、雜合突變的陽性和陰性對照DNA ；(6)使用說明書。它的檢測方法為通過多重PCR擴增，使被檢測樣本的16個目的片段得到擴增富集；然后進行擴增產物的酶反應純化，去除多余的引物及dNTP “雜質”；再利用針對突變位點設計的16條延伸引物，對16個富集的片段進行單堿基的延伸反應，僅對突變位點的單個堿基進行熒光標記擴增，突變位點匹配上一個熒光標記的雙脫氧核苷酸后終止延伸；然后再進行一次擴增產物的酶反應純化；最后經毛細管電泳進行擴增片段分析，相當于單個位點的微測序，這樣可以檢測單核苷酸的突變，延伸位點堿基的類型決定電泳峰的顏色，延伸弓I物的片段長度決定峰的位置，延伸引物的濃度影響電泳檢測的峰高。 所述的試劑盒包含檢測CBS基因C699T、DHFR基因c594+59dell9、FOLHl基因T1561C,GSTOl 基因 C428T、MTHFD1 基因 G878A、MTHFD 基因 G1958A、MTHFR基因 A1298C、MTHFD基因 C677T、MTR基因 A2756G、MTRR基因 A66G、NAT1 基因 C1095A、NFE2L2 基因 insl+C11108T、RFCl基因G80A、SHMT1基因C1420T、TCN2基因C776G和TYMS基因1494del6十六個基因突變位點的引物第一組所述檢測C699T位點突變的引物的堿基序列為擴增引物P1_FTTTCTATGCAGTACCGCAACG ；Pl-R AATCAAGATGGACAGAGGGAC ；延伸引物El:⑴ 22AGCAACCCCCTGGCTCACTA ；第二組所述檢測DHFR基因c594+59dell9位點突變的引物的堿基序列為擴增引物P2-FACTGCATCGTCGCTGTGTC ；P2-R CGGGCAGAAATCAGCAAC ；延伸引物E2: (T) 34AGGCTGCCCACGGTCGGGGT ；第三組所述檢測FOLHl基因T1561C位點突變的引物的堿基序列為擴增弓丨物P3-FTCCAACTTCAGAAACCTT ；P3-R TTAGTATACCGTGCTCTGC ；延伸引物E3:⑴ 34GCAAATTGGGATCTGGAAATGAT ；第四組所述檢測GSTOl基因C428T位點突變的引物的堿基序列為擴增引物P4-FATTCTCTGTCTAGGTGCCATC ；P4-R CTCCTCTAGCTTGGTAAATTC ；延伸引物E4:⑴ 29CCAAAATAAAGAAGACTATG ；第五組所述檢測MTHFDl基因G878A位點突變的引物的堿基序列為擴增弓丨物P5-FGCTTGAAACTGAGGTGAG ；P5-R AGGTTGTTATACTGAATCATCC ；延伸引物E5: (T) 4CACAGTAGAGAGTGCCAAGC ；第六組所述檢測MTHFD基因G1958A位點突變的引物的堿基序列為擴增弓I物P6-F GTTTGCCAACATCGCACATG ；P6-R CTAACCTACAAACCCTTCTGG ；
延伸引物E6: (T) 12CCTCCATCATTGCAGACC ；第七組所述檢測MTHFR基因A1298C位點突變的引物的堿基序列為擴增引物P7-F:CGAGAGGTAAAGAACGAAGAC ；P7-R TTCTACCTGAAGAGCAAGTCC ；延伸引物E7:⑴ 34GGAGGAGCTGACCAGTGAAG ；第八組所述檢測MTHFD基因C677T位點突變的引物的堿基序列為擴增引物P8-FTGAAGCACTTGAAGGAGAAGG ；P8-R CCTTCACAAAGCGGAAGAATG ； 延伸引物E8:⑴ 12GGAGAAGGTGTCTGCGGGAG ；第九組所述檢測MTR基因A2756G位點突變的引物的堿基序列為擴增弓丨物P9-FCATTGACCATTACTACACCAG ；P9-R TCTGTTTCTACCACTTACCTTG ；延伸引物E9ATGGAAGAATATGAAGATATTAGACAGG ；第十組所述檢測MTRR基因A66G位點突變的引物的堿基序列為擴增引物P10-FTATATGCTACACAGCAGGGAC ；PlO-R GGCTCTAACCTTATCGGATTC ；延伸引物ElO:⑴ 2(iAAGGCCATCGCAGAAGAAAT ；第^^一組所述檢測NATl基因C1095A位點突變的引物的堿基序列為擴增引物Pll-FCTAGACATCAAATCATTTCACC ；Pll-RCTTTCTAGCATAAATCACCAAT ；延伸引物ElITAACCACAGGCCATCTTTAAAA ；第十二組所述檢測NFE2L2基因insl+C11108T位點突變的引物的堿基序列為擴增引物P12-FAACTGACTGAGCAACTATTACG ；P12-R ATTGCTCCTCTGTGTCTCC ；延伸引物E12⑴ 14CTTAGAGGAACTCATATCCTAAG ；第十三組所述檢測RFCl基因G80A位點突變的引物的堿基序列為擴增引物P13-F:CATGAAGCCGTAGAAGCAAAG ；P13-R AGAAGCAGGTGCCCGTGGAA ；延伸引物E13 (T) 25CGAGCTCCGGTCCTGGCGGC ；第十四組所述檢測SHMTl基因C1420T位點突變的引物的堿基序列為擴增引物P14-FGTTCAAGGAGAGACTGGC ；P14-R GCTCATCCATCTCTCAGG ；延伸引物E14⑴ 7AGGTTGAGAGCTTCGCCTCT ；第十五組所述檢測TCN2基因C776G位點突變的引物的堿基序列為擴增引物P15-FTCCTCACTCTATCACCAGTTC ；P15-R TCATGAGAGCATTCTGGAAGG 延伸引物E15 (T) 38CCTCATGACTTCCCCCATGC ；第十六組所述檢測TYMS基因1494del6位點突變的引物的堿基序列為擴增引物P16-FAGGAACTGAGCAGATAAGTGG ；
P16-R CGATCATGATGTAGAGTGTGG ；延伸引物E16 (T)4qGAGTGTGGTTATGAACTTTA。所述的PCR擴增引物及延伸引物用于針對人類基因組中目的區域DNA的擴增以及目的位點的微測序，進而達到基因分型的目的，以實現特定核苷酸變異的檢測(其序列參見圖I)。所述的PCR擴增引物和延伸引物濃度的優化配置，使其能夠在延伸反應時兼顧各個位點的產量，利于后續檢測中各個位點突變情況的判斷識別。本具體實施方式
中(I)Touchdown多重PCR:反應體系總體積IOii L，10XPCR緩沖液 I. Ou L, MgCl2 (25mM) I. Ou L, dNTP (2mM) I. 5u L, Primer Mix 4. 0 u L, FastTaqE (5U/U L)、模板DNA 2. 35 u L ;反應程序，95°C預變性4min ;94°C變性30s，66°C退火50s，每循 環降0. 5°C，72°C延伸50s, 11個循環；94°C變性30s，61。。退火50s，72。。延伸50s, 24個循環；72°C充分延伸10min，4°C保存，PCR反應在9700熱循環儀(ABI公司)中進行。(2) PCR 產物純化反應體系總體積 6 ii L，ddH20 2. 6 u L, SAP 酶(I. OU/ u L)2u L,Exon I 酶(5. OU/ii L)0. L、上述 PCR 產物 l.OuL ;反應程序，37°C 反應 80min，80°C 終止反應15min,4°C保存。(3)標記延伸反應體系總體積 6. Ou L, ddH20 I. 8 U L, 5 X SeqBuffer I. L，混合延伸引物(E-Primer) I. 0 y L、SNaPshot Mix I. 0 y L，上述純化產物I u L ;PCR反應程序96°C預變性Imin ;96°C變性10s，52°C退火5s，60°C延伸30s，28個循環，4°C保存，PCR反應可選擇在9700熱循環儀(ABI公司)中進行。(4) 二次純化反應總體積7 iiL，反應結束后每反應產物中加入SAP酶(I. OU/U UliiL ;反應程序37°C反應60min，75°C滅活反應15min，4°C保存，反應可選擇在9700熱循環儀(ABI公司)中進行。(5)毛細管電泳反應體系總體積10. L，Hi-Di甲酰胺(ABI公司)9ii L，內標LIZ-120(ABI公司)0. 2iiL，第二次純化產物IiiL;反應程序95°C變性5min，立即置冰上5min。在ABI公司遺傳分析儀進行毛細管電泳,應用GeneMapper系列軟件進行數據的采集和分析。(6)結果分析根據峰顏色來區分野生型、雜合突變和純合突變，得出其多態圖譜(圖3)，分析其基因型。本具體實施方式
中的PCR擴增引物設計時選擇目的區域上下游70_150bp的距離作為引物設計的起始部位，引物與之序列匹配的特異性要好，引物間的退火溫度要盡量一致(55°C左右)。使在一個多重PCR反應中的各個擴增引物的擴增效率相當。本具體實施方式
具有高通量、高效能、低成本、簡單適用，適合中國人群的葉酸利用能力基因檢測。采用多重PCR加上引物延伸微測序技術，在一個反應管中同時完成14個基因16個位點的基因分型的優點I、相對于傳統Sanger直接測序法，本檢測方法可同時檢測不同基因的16個多態位點，技術穩定，結果容易判讀，成本低廉。2、相對于SSCP和RFLP兩種方法，本方法不受是否存在限制性酶切位點的限制，且可同時檢測多個位點。3、相對于DHPLC檢測方法，本檢測方法不但可以同時檢測多個位點，而且突變具體類型判斷更加準確。4、相對于基因芯片技術，本檢測方法成本低廉，操作簡單，凡是具有分子生物學實驗相關經驗的人員均可完成。實施例一先天性心臟病患者葉酸利用能力基因檢測I、檢測樣本樣本來源于蘇州市立醫院生殖與遺傳中心非綜合征型患者DNA文庫，均是蘇州大市為主的蘇南地區患者，其中男71例，女54例，庫中所有患者樣本收集前均簽署了知情同 意書。2、檢測方案見具體實施方式
的檢測方法。3、檢測結果根據野生型和突變型峰的顏色不同進行判斷，88例先心病樣本中，發現DHFR、MTR、SHMT, TCN2、TYMS基因突變分布頻率與正常對照組有顯著差異，參見附件4。
基因多態位點CHD患者例數(所占百分數)正常人群例數(所占百分數)
__野生型純合突變雜合突變—寄生型純合突變雜合突萎一
CBS__C699T 80(90.91%) 0(0.00%) 8(9.09%) 83(94.32%) 0 (0.00%) 5(5.68%)
DHFR A594dell9G 16(18.18%)* 35(39.77%) 37(42.05%) 7(7.95%) 42(47.73%) 39(44.32%)
FOLHl 一 T1561C 40(45.45%) 10(11.36%) 38 (43. 18%) 38(43. 18%) 9(10.23%) 41 (46.59%)
GSTOl 一 C428A 80 (90.90%) 0(0.00%) 8(9. 10%) 82(93.18%) 0(0.00%) 6(6.82%)
G878A 86(97.73%) 0(0.00%) 2(2.27%) 88(100%) Q (0.00%) 0(0.00%)
G1958A 46 (52. 27%) 2(2.27%) 40(45.45%) 41 (46. 59%) 6 (6. 82%) 41 (46. 59%)
C677T 34 (38.64%) 15(17.05%) i9(44.32%) 26(29.55%) 22(25.00%) 40(45.45%)
MTHFR _____________________--.
A1298C 61(69.32%) 2(2.27%) 25(28.41%) 56(63.64%) 3(3.41%) 29(32.95%)
MTRA2756G76(86.36%)1(1. 14%)11(12.50%)65(73.86%)*9(10.23%)14(15.91%)
MTRRA66G54(61.36%)3(3.41%)31(35.23%)50 (56.82%)5(5.61%)33(37.50%)
NATl__C1095A28(31.82%)29(32.95%)31(35.23%)27(30.68%)19(21.59%)42 (47.73%)
NFE2L2 ins+C11108T78(88.64%)0 (0.00%)10(11.36%)0(90. 1%)80 (90.9%)8 (9. 10%)附件4 :先天性心臟病和對照樣本(各88例)突變分布頻率
權利要求
1.葉酸利用能力基因檢測試劑盒及檢測方法，其特征在于葉酸利用能力基因檢測試劑盒包含 (1)PCR反應試劑，包括dNTP、5X和IOXPCR緩沖液、Mg2+離子、去離子水、FastTaq酶、SNaPshot Mix 混合液； (2)按一定比例混合的16對PCR引物混合物； (3)按一定比例混合的16條延伸引物混合物； (4)純化用SAP酶、ExonI酶及其配套的緩沖液； (5)單個位點純合、雜合突變的陽性和陰性對照DNA； (6)使用說明書。
2.根據權利要求I所述的葉酸利用能力基因檢測試劑盒及檢測方法，其特征在于它的檢測方法為使用Primer 5> Gene runner和MassARRAY Assay Design引物設計軟件協助設計引物，通過多重PCR擴增，使被檢測樣本的16個目的片段得到擴增富集；然后進行擴增產物的酶反應純化，去除多余的引物及dNTP“雜質”;再利用針對突變位點設計的16條延伸引物，對16個富集的片段進行單堿基的延伸反應，僅對突變位點的單個堿基進行熒光標記擴增，突變位點匹配上一個熒光標記的雙脫氧核苷酸后終止延伸；然后再進行一次擴增產物的酶反應純化；最后經毛細管電泳進行擴增片段分析，相當于單個位點的微測序，這樣可以檢測單核苷酸的突變，延伸位點堿基的類型決定電泳峰的顏色，延伸引物的片段長度決定峰的位置，延伸引物的濃度影響電泳檢測的峰高。
3.根據權利要求I所述的葉酸利用能力基因檢測試劑盒及檢測方法，其特征在于所述的試劑盒包含檢測CBS基因C699T、DHFR基因c594+59del 19、FOLHl基因T1561C、GSTOl基因 C428T、MTHFDl 基因 G878A、MTHFD 基因 G1958A、MTHFR 基因 A1298C、MTHFD 基因 C677T、MTR 基因 A2756G、MTRR 基因 A66G、NAT1 基因 C1095A、NFE2L2 基因 insl+C11108T、RFCl 基因G80A、SHMTl基因C1420T、TCN2基因C776G和TYMS基因1494del6十六個基因突變位點的引物 第一組所述檢測CBS基因C699T位點突變的引物的堿基序列為 擴增引物P1_F TTTCTATGCAGTACCGCAACG ；Pl-R AATCAAGATGGACAGAGGGAC ；延伸引物E1 (T) 22AGCAACCCCCTGGCTCACTA ； 第二組所述檢測DHFR基因c594+59dell9位點突變的引物的堿基序列為 擴增引物P2_F ACTGCATCGTCGCTGTGTC ；P2-R CGGGCAGAAATCAGCAAC ；延伸引物E2 (T) 34AGGCTGCCCACGGTCGGGGT ； 第三組所述檢測FOLHl基因T1561C位點突變的引物的堿基序列為 擴增引物P3_F TCCAACTTCAGAAACCTT ；P3-R TTAGTATACCGTGCTCTGC ；延伸引物E3 (T) 34GCAAATTGGGATCTGGAAATGAT ； 第四組所述檢測GSTOl基因C428T位點突變的引物的堿基序列為 擴增引物P4-F ATTCTCTGTCTAGGTGCCATC ；P4-R CTCCTCTAGCTTGGTAAATTC ；延伸引物E4 (T) 29CCAAAATAAAGAAGACTATG ； 第五組所述檢測MTHFDl基因G878A位點突變的引物的堿基序列為 擴增引物P5_F GCTTGAAACTGAGGTGAG ；P5-R AGGTTGTTATACTGAATCATCC ；延伸引物E5 (T) 4CACAGTAGAGAGTGCCAAGC ； 第六組所述檢測MTHFD基因G1958A位點突變的引物的堿基序列為 擴增引物P6_F GTTTGCCAACATCGCACATG ；P6-R CTAACCTACAAACCCTTCTGG ；延伸引物E6 (T) 12CCTCCATCATTGCAGACC ； 第七組所述檢測MTHFR基因A1298C位點突變的引物的堿基序列為擴增引物P7_F CGAGAGGTAAAGAACGAAGAC ；P7-R TTCTACCTGAAGAGCAAGTCC ；延伸引物E7 (T) 31GGAGGAGCTGACCAGTGAAG ； 第八組所述檢測MTHFD基因C67H位點突變的引物的堿基序列為 擴增引物P8_F TGAAGCACTTGAAGGAGAAGG ；P8-R CCTTCACAAAGCGGAAGAATG ；延伸引物E8 (T) 12GGAGAAGGTGTCTGCGGGAG ； 第九組所述檢測MTR基因A2756G位點突變的引物的堿基序列為 擴增引物P9_F CATTGACCATTACTACACCAG ；P9-R TCTGTTTCTACCACTTACCTTG ； 延伸引物E9 ATGGAAGAATATGAAGATATTAGACAGG ； 第十組所述檢測MTRR基因A66G位點突變的引物的堿基序列為 擴增引物P10-F TATATGCTACACAGCAGGGAC ；PlO-R GGCTCTAACCTTATCGGATTC ；延伸引物E10 (T) 20AAGGCCATCGCAGAAGAAAT ； 第i^一組所述檢測NATl基因C1095A位點突變的引物的堿基序 列為擴增引物P11-F CTAGACATCAAATCATTTCACC ；Pll-R CTTTCTAGCATAAATCACCAAT ； 延伸引物E11 TAACCACAGGCCATCTTTAAAA ； 第十二組所述檢測NFE2L2基因insl+C11108T位點突變的引物的堿基序列為 擴增引物P12-F AACTGACTGAGCAACTATTACG ；P12-R ATTGCTCCTCTGTGTCTCC ；延伸引物E12 (T) 14CTTAGAGGAACTCATATCCTAAG ； 第十三組所述檢測RFCl基因G80A位點突變的引物的堿基序列為 擴增引物P13-F CATGAAGCCGTAGAAGCAAAG ；P13-R AGAAGCAGGTGCCCGTGGAA ；延伸引物E13 : (T) 25CGAGCTCCGGTCCTGGCGGC ； 第十四組所述檢測SHMTl基因C1420T位點突變的引物的堿基序列為擴增引物P14-F GTTCAAGGAGAGACTGGC ；P14-R GCTCATCCATCTCTCAGG ；延伸引物E14 (T) 7AGGTTGAGAGCTTCGCCTCT ； 第十五組所述檢測TCN2基因C776G位點突變的引物的堿基序列為 擴增引物P15-F TCCTCACTCTATCACCAGTTC ；P15-R TCATGAGAGCATTCTGGAAGG ；延伸引物E15 (T)38CCTCATGACTTCCCCCATGC ； 第十六組所述檢測TYMS基因1494del6位點突變的引物的堿基序列為 擴增引物P16-F AGGAACTGAGCAGATAAGTGG ；P16-R CGATCATGATGTAGAGTGTGG ；延伸引物E16 : (T)4qGAGTGTGGTTATGAACTTTA。
4.根據權利要求I所述的葉酸利用能力基因檢測試劑盒及檢測方法，其特征在于所述的PCR引物及延伸引物，用于針對人類基因組中目的DNA區域進行擴增以及目的位點進行微測序，進而達到基因分型的目的，以實現特定核苷酸變異的檢測。
5.根據權利要求I所述的葉酸利用能力基因檢測試劑盒及檢測方法，其特征在于所述的PCR擴增引物和延伸弓I物濃度的優化配置，使其能夠在延伸反應時兼顧各個位點的產量，利于后續檢測中各個位點突變情況的判斷識別。
全文摘要
葉酸利用能力基因檢測試劑盒及檢測方法，它涉及基因檢測技術領域，葉酸利用能力基因檢測試劑盒包含(1)PCR反應試劑，包括dNTP、5×和10×PCR緩沖液、Mg2+離子、去離子水、FastTaq酶、SNaPshot Mix混合液；(2)按一定比例混合的16對PCR引物混合物；(3)按一定比例混合的16條延伸引物混合物；(4)純化用SAP酶、Exon I酶及其配套的緩沖液；(5)單個位點純合、雜合突變的陽性和陰性對照DNA；(6)使用說明書。它能提供一種簡單、高通量、高效能、低成本的適合中國人群的葉酸利用能力基因突變篩查方法。
文檔編號C12Q1/68GK102676645SQ20111034884
公開日2012年9月19日 申請日期2011年11月8日 優先權日2011年11月8日
發明者李紅, 毛君, 王本敬, 陳瑛 申請人:蘇州市立醫院