一種檢測活體酵母細胞upr水平的雙熒光素酶監測質粒及其構建和應用的制作方法
【專利摘要】本發明涉及一種檢測活體酵母細胞UPR水平的雙熒光素酶監測質粒及其構建和應用，質粒為pUST-08質粒，利用基因克隆技術，依次將Gal10p、Rluc-Hac1p、Hac1i、Fluc克隆到質粒YCplac33中，組成Gal10p-Rluc-Hac1p-Fluc-Hac1i?UPR檢測雙熒光素酶報告元件。該系統可用于檢測活體酵母細胞UPR水平。本發明檢測周期短、靈敏度高、實驗操作簡便、成本低。
【專利說明】—種檢測活體酵母細胞UPR水平的雙熒光素酶監測質粒及其構建和應用

【技術領域】
[0001]本發明屬于用于細胞UPR檢測質粒及其構建和應用領域，特別涉及一種檢測活體酵母細胞UPR水平的雙熒光素酶監測質粒及其構建和應用。

【背景技術】
[0002]當大量未折疊蛋白或錯誤折疊蛋白在內質網上過度積累時，在真核生物酵母乃至高等哺乳動物細胞中都廣泛存在一種內質網脅迫應激機制，其中最顯著的就是未折疊蛋白響應(UPR)，UPR通過激發IREl在內的多種調節因子，并利用IREl的核酸內切酶活性識別并剪切HAC13’末端的內含子序列，使Hacli喪失對HACl翻譯抑制作用提高HACl的表達水平，進而提高下游蛋白折疊相關的分子伴侶的表達，以此降低未折疊蛋白在內質網上的過度積累應對內質網脅迫。
[0003]內質網脅迫及未折疊蛋白響應與重組蛋白的異源表達產率密切相關(appliedmicrob1logy and b1technology46, 365,1996)，也與人類的神經性病變、心血管疾病、糖尿病等多種疾病有直接的對應關系(Science Translat1nal Medicine5,138, 2013 ；Nature Reviews Drug Discoveryl2, 703, 2013),針對UPR進行的檢測和研究是探索相關工業和醫療蛋白質生產、疾病發病機制的重要技術手段(Methods Enzymol.490,31,2011),同時也是相關疾病治療及診斷的重要突破口(Science Translat1nal Medicine5,138,2013)。
[0004]利用信使HACl選擇性剪接對UPR的響應機制(celll07，103，2001)，將HACl啟動子及內含子移植到表達質粒中研究UPR產生后IREl對質粒HACl的調控機制。證實了 HACl在表達質粒中同樣具有靈敏的UPR響應調控機制。
[0005]現有檢測UPR水平的方法主要有(I) RT-PCR或northern-blot檢測HACl表達水平及HACl內含子剪接率；(2)利用未折疊蛋白響應元件UPRE來檢測UPR水平；(3)利用免疫共沉淀(IP)分析UPR相關蛋白的表達量來檢測UPR水平；(4)通過生化指標，如Ca2+含量等，來檢測細胞UPR水平。但都存在無法克服的缺點，如:
[0006]1.RT-PCR或Northern-blot實驗周期長、靈敏度低；
[0007]2.檢測UPRE或IP時難以避免蛋白折置受抑制后對標記蛋白折置的干擾；
[0008]3.現有的Ca2+等離子測定精度不高，且實驗成本高、實驗周期長；
[0009]4.需要借助內參進行定量，無法對活體細胞進行高通量檢測；


【發明內容】

[0010]本發明所要解決的技術問題是提供一種檢測活體酵母細胞UPR水平的雙熒光素酶監測質粒及其構建和應用，該發明檢測周期短、靈敏度高、實驗操作簡便、成本低。
[0011]本發明的一種檢測活體酵母細胞UPR水平的雙熒光素酶監測質粒，所述質粒為pUST-08質粒；具體為GallOp-Rluc-Haclp-Fluc-Hacli UPR雙熒光素酶報告元件，其核酸序列如SEQ ID NO: 13所示。
[0012]本發明的一種監測活體酵母細胞UPR水平的雙熒光素酶監測質粒的構建，包括:
[0013](I)設計用于GallOp、Rluc-Haclp、Hacl1、Fluc片段PCR擴增的上下游引物；
[0014](2)利用PCR技術，以含Gal 1p序列的質粒YEP51-1 ipinl、含Rluc和Fluc序列的質粒PJD375和含Hacli序列的酵母基因組作為擴增模板，擴增GallOp、Rluc-Haclp、Hacl1、Fluc序列；
[0015](3)利用基因克隆技術，依次將GallOp、Rluc-Haclp、Hacl1、Fluc克隆到質粒YCplac33中，組成Gal1p-Rluc-Haclp-Fluc-HacIi UPR雙熒光素酶報告元件，即為pUST-08 質粒。
[0016]所述步驟(1)中GallOp、Rluc-Haclp、Hacl1、Fluc片段PCR擴增的上下游引物為:
[0017]GallOp - F:ACGCCAAGCTTGATCAAAAATCATCGCTTCG ;如 SEQ ID NO:1 所示
[0018]GallOp - R:GCTCTAGACTCGACTCAAAAATTCTTAC ;如 SEQ ID NO:2 所示
[0019]Rluc - Haclp - F:GCTCTAGAGTCCACCAATGACTTCGAAA ;如 SEQ ID NO:3 所示
[0020]Rluc - Haclp - R:CGGGATCCTAGGTGGGGGAGGAGGAGGTTCGACATTTGTTCATTTTTGAG ；如SEQ ID NO:4 所示
[0021]Hacl1-F:GGGGTAC CTATAGCGGGAAACAGTCTAC ;如 SEQ ID NO:5 所示
[0022]Hacl1-R:CCACCAACAGCGATAATAAC ;如 SEQ ID NO:6 所示
[0023]Fluc - F:TCAAAAATGAACAAATGTCG ;如 SEQ ID NO:7 所示
[0024]Fluc - R:GGGGTACCATGACTCGAGCACGTGTTAC? 如 SEQ ID NO:8 所示
[0025]所述PUST-08是一種能夠在大腸桿菌及釀酒酵母中穩定復制表達的低拷貝穿梭型重組質粒。所述pUST-08能夠通過其雙熒光素酶報告元件中的HACl內含子序列響應UPR，調控其上游的Fluc報告基因的表達。
[0026]所述pUST-08能夠通過其雙熒光素酶報告元件中的GallO啟動子，控制雙熒光素酶報告元件的轉錄的開啟與關閉，提高UPR監測的操作性。
[0027]所述雙熒光素酶報告元件中的Rluc可作為UPR檢測時螢火蟲熒光素酶報告基因Fluc的內對照，消除單一報告基因在UPR檢測過程中，因內質網脅迫后的蛋白折疊效率改變，對單一熒光素酶活性造成的干擾。
[0028]本發明的一種檢測活體酵母細胞UPR水平的雙熒光素酶監測質粒的應用，包括:
[0029](I)將pUST-08轉入釀酒酵母BY4741a中，于SC-URA培養基中篩選；
[0030](2)將上述攜帶有pUST-08的酵母BY4741a進行復蘇，次日進行活化，離心，洗滌，配制酵母菌懸液；
[0031](3)取上述酵母菌懸液，并分成兩等份，分別轉移到培養板中，靜置誘導，然后向一份中加入D-突光素鉀檸檬酸鈉溶液,另一份加入腔腸素溶液，避光晃動20-30s,然后在Imin內檢測熒光素酶熒光值。
[0032]所述步驟⑵中活化為0.60D_的初始菌濃活化4hr。
[0033]所述步驟⑵中洗滌為用無菌水懸洗。
[0034]所述步驟⑵配制酵母菌懸液為:用2%葡萄糖為碳源的SC_URA、2%半乳糖作為碳源的SC-URA或2%半乳糖作為碳源并添加藥物的SC-URA懸起來，即得。
[0035]所述藥物衣霉素Tm和/或二硫蘇糖醇DTT ;優選濃度為0.5mg/ml或2mg/ml的衣霉素(Tm)，0.1mM或0.5mM的二硫蘇糖醇(DTT)。
[0036]所述步驟(3)中靜置誘導為30°C靜置誘導3hr。
[0037]所述步驟(3)中D-熒光素鉀檸檬酸鈉溶液的濃度為ImM，腔腸素溶液的濃度為20 μ M ；D-熒光素鉀檸檬酸鈉溶液或腔腸素溶液于酵母菌懸液的體積比為1:1。
[0038]本發明設計并構建一種能夠檢測活體細胞內UPR的質粒及利用該質粒檢測不同UPR激活劑處理后活體細胞中的UPR水平。更具體的說，將HACl啟動子5’UTR序列Haclp、HACl內含子Hacli及其3’UTR序列完整移植到低拷貝穿梭質粒YCplac33中，借助HACl在UPR激活后的特殊剪接機制，利用該質粒搭載的雙熒光素酶報告基因，監測活體細胞內UPR的情況。
[0039]內質網脅迫及未折疊蛋白響應與重組蛋白的異源表達產率，以及人類的神經性病變、心血管疾病、糖尿病等多種疾病密切相關，以HACl剪切為基礎的UPR檢測技術是研究蛋白藥物生產、相關疾病的發病機制及藥物篩選的重要技術手段。但現有檢測技術存在操作繁瑣、靈敏度低等缺陷，難以滿足相關疾病研究及藥物篩選的高靈敏度、高通量的要求。依照本發明構建的UPR監測質粒能夠方便、快捷、高通量的監測活體細胞的UPR情況。
[0040]有益.效果
[0041](I)檢測周期短:利用pUST-08質粒對酵母UPR水平進行檢測周期短，僅需要3h的誘導、處理時間及Imin的檢測時間即可完成對酵母UPR水平的檢測，而傳統RT-PCR檢測方法，則需要3h的藥物處理、5h的總RNA提取、2h的cDNA合成、3h的PCR檢測、30min的凝膠電泳檢測。本檢測系統可以大大縮短檢測周期；
[0042](2)靈敏度高:傳統RT-PCR法檢測HACl剪切率，僅能檢測高濃度UPR誘導劑的UPR水平，對于低濃度UPR誘導劑的UPR水平則難以檢測。而本檢測系統，在檢測低濃度的UPR誘導劑，如0.5 μ g/mL的衣霉素(Tm)、0.1mM的二硫蘇糖醇(DTT)，依然可以檢測出UPR水平；
[0043](3)實驗操作簡便、成本低:常規RT-PCR操作繁瑣、成本高昂，RT-PCR檢測主要包括總RNA的提取，cDNA的合成，PCR檢測，凝膠電泳檢測等內容，總RNA提取及cDNA的合成需要使用價格較為昂貴的試劑盒。而本檢測系統，僅需要將待測樣品放置在30°C恒溫箱中靜置3h，加入熒光底物，直接可以通過多功能熒光酶標儀進行檢測，相比較傳統RT-PCR檢測法，本法操作更為簡便、成本更低；
[0044](4)不需要額外設置內參:對比與UPRE-LacZ通過檢測淀粉酶活性的辦法，往往需要額外設置內參，且使用檢測精確度不高。而UPR檢測質粒中GallOp啟動子和Rluc海腎熒光素酶基因的加入，為本檢測系統提供了檢測所需的本底和內參。檢測過程中，將不進行半乳糖誘導的熒光值作為本底，將RLU作為內參，可以方便的通過減去本底，對比RLU熒光強度計算出實際的FLU表達水平；
[0045] (5)本檢測系統具有傳統RT-PCR、Northern-blot、UPRE_Lacz不具備的優勢，如周期短、靈敏度高、操作簡便、不需要額外設置內參等特點，此外本檢測系統還可以利用多功能酶標儀進行聞通量檢測，本檢測系統在細胞內質網脅迫、UPR應激等相關疾病及基礎研究中具有良好的應用前景。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0046]圖1為UPR檢測質粒pUST-08的工作原理圖；
[0047]圖2為UPR檢測質粒pUST-08的構建示意圖；
[0048]圖3為常規RT-PCR技術檢測野生型酵母在0.5 μ g/mL的衣霉素、2 μ g/mL的衣霉素、0.1mM DTT,0.5mM DTT 處理后 HAClmRNA 的剪接率，圖中 HAClu 為 unspliced HACl,即代表未發生剪接的HACl ;圖中HACls為spliced HACl，即代表剪接后的HACl ；ACT1為內參；
圖4為hac I Λ、ire I Λ衣霉素、DTT敏感度測試，SC+Tm為SC培養基中額外添加0.5 μ g/mL的衣霉素，SC+DTT為SC培養基中額外添加0.5mM DTT ；
[0049]圖5為通過多功能熒光酶標儀檢測到pUST-08質粒在野生型與HACl缺陷型酵母中誘導表達后產生的相對Fluc/Rluc熒光強度比值；
[0050]圖6為通過多功能熒光酶標儀檢測到pUST-09質粒在野生型酵母中誘導表達后產生的相對Fluc/Rluc熒光強度比值；
[0051]圖7為通過多功能熒光酶標儀檢測到pUST-08質粒在IREl缺陷型酵母中誘導表達后產生的相對Fluc/Rluc熒光強度比值。

【具體實施方式】
[0052]下面結合具體實施例，進一步闡述本發明。應理解，這些實施例僅用于說明本發明而不用于限制本發明的范圍。此外應理解，在閱讀了本發明講授的內容之后，本領域技術人員可以對本發明作各種改動或修改，這些等價形式同樣落于本申請所附權利要求書所限定的范圍。
[0053]實施例1
[0054]UPR檢測質粒pUST-08的構建
[0055]利用常規基因克隆技術依次將可操縱啟動子GallOp、熒光素酶報告基因Rluc、HACl啟動子5’ UTR序列Haclp、HACl內含子Hacli及其3’ UTR序列、熒光素酶報告基因Fluc克隆到酵母低拷貝穿梭型質粒YCplac33中(如圖2所示)。
[0056]1、設計引物
[0057]GallOp - F:ACGCCAAGCTTGATCAAAAATCATCGCTTCG ；
[0058]GallOp - R:GCTCTAGACTCGACTCAAAAATTCTTAC ；
[0059]Rluc - Haclp - F:GCTCTAGAGTCCACCAATGACTTCGAAA ；
[0060]Rluc - Haclp - R:CGGGATCCTAGGTGGGGGAGGAGGAGGTTCGACATTTGTTCATTTTTGAG ；
[0061]Hacl1- F:GGGGTACCTATAGCGGGAAACAGTCTAC ；
[0062]Hacl1-R:CCACCAACAGCGATAATAAC ；
[0063]Fluc - F:TCAAAAATGAACAAATGTCG ；
[0064]Fluc - R:GGGGTACCATGACTCGAGCACGTGTTAC。
[0065]2、以質粒 YEP51-LIPIN1 為模板、GallOp - F 和 GallOp - R 作為擴增引物(GallOp - F:ACGCCAAGCTTGATCAAAAATCATCGCTTCG ；GallOp - R:GCTCTAGACTCGACTCAAAAATTCTTAC ；)，使用常規PCR體系反應程序進行PCR擴增，PCR擴增條件為:95°C預熱3min ；35個循環，每個循環包括:94°C變性20秒，55°C退火30s，72°C延伸
2.5min ;最后72°C延伸lOmin。獲得GallOp的PCR產物，再將PCR產物進行純化回收。
[0066]3、將純化后的Gal 1p的PCR產物及YCplac33進行Hindi 11,XbaI雙酶切，酶切產物進一步進行純化回收。
[0067]4、將純化后的酶切產物GallOp及YCplac33經T4連接酶的作用下進行連接，轉入大腸桿菌DH5 α后，經含氨芐青霉素篩LB平板篩選后獲得正確質粒，所獲質粒為YCplac33-Gall0p。
[0068]5、以質粒PJD375為模板、Rluc - Haclp - F和Rluc - Haclp _ R作為擴增引物(Rluc - Haclp - F:GCTCTAGAGTCCACCAATGACTTCGAAA ；Rluc - Haclp - R:CGGGATCCTAGGTGGGGGAGGAGGAGGTTCGACATTTGTTCATTTTTGAG)，使用常規PCR體系反應程序進行PCR擴增，PCR擴增條件為:95°C預熱3min ;35個循環，每個循環包括:94°C變性20秒，55°C退火30s，72°C延伸Imin ;最后72°C延伸lOmin，獲得Rluc-Haclp的PCR產物，再將PCR產物進行純化回收。
[0069]6、將純化后的 Rluc-Haclp 的 PCR 產物及 YCplac33_Gall0p 進行 Xba1、BamHI 雙酶切，酶切產物進一步進行純化回收。
[0070]7、將純化后的酶切產物Rluc-Haclp及YCplac33_經T4連接酶的作用下進行連接，轉入大腸桿菌DH5 α后，經含氨芐青霉素篩LB平板篩選后獲得正確質粒，所獲質粒為YCplac33_Gal1p-Rluc-HacIp。
[0071]8、以質粒PJD375為模板、Hacl1- F和Hacli _ R作為擴增引物(Hacl1- F:GGGGTACCTATAGCGGGAAACAGTCTAC ；Hacli _ R:CCACCAACAGCGATAATAAC ；)，使用常規 PCR 體系反應程序進行PCR擴增，PCR擴增條件為:95°C預熱3min ;35個循環，每個循環包括:94°C變性20秒，55°C退火30s，72。。延伸30s ;最后72°C延伸lOmin，獲得Hacli的PCR產物，再將PCR產物進行純化回收。
[0072]9、將純化后的 Hacli 的 PCR 產物及 YCplac33-Gall0p-Rluc_Haclp 進行 ΚρηΙ、EcoRI雙酶切，酶切產物進一步進行純化回收。
[0073]10、將純化后的酶切產物Hacli及YCplac33-Gall0p-Rluc_Haclp經T4連接酶的作用下進行連接，轉入大腸桿菌DH5 α后，經含氨芐青霉素篩LB平板篩選后獲得正確質粒，所獲質粒為 YCplac33-Gal 1p-Rluc-HacIp-HacIi。
[0074]11、以質粒PJD375為模板、Fluc - F和Fluc _ R作為擴增引物(Flue - F:TCAAAAATGAACAAATGTCG ；Fluc - R:GGGGTACCATGACTCGAGCACGTGTTAC)，使用常規 PCR 體系反應程序進行PCR擴增，PCR擴增條件為:95°C預熱3min ;35個循環，每個循環包括:94°C變性20秒，55°C退火30s, 72°C延伸lmin30s ;最后72°C延伸1min,獲得Fluc的PCR產物，再將PCR產物進行純化回收。
[0075]12、將純化后的 Fluc 的 PCR 產物及 YCplac33-Gall0p-Rluc_Haclp-Hacli 進行BamH1.Kpnl雙酶切，酶切產物進一步進行純化回收。
[0076]13、將純化后的酶切產物 Hacli 及 YCplac33-Gall0p-Rluc_Haclp-Hacli 經 T4 連接酶的作用下進行連接，轉入大腸桿菌DH5 α后，經含氨芐青霉素篩LB平板篩選后獲得正確質粒，所獲質粒 YCp Iac33-Gal 1p-Rluc-Hac lp-Fluc-Hac I i，并命名為 pUST-08。
[0077]14、對所構建的pUST-08質粒送測序公司進行測序，測序結果與釀酒酵母基因文庫(SOT)中的HACl序列、YEP51-LIPIN1質粒、PJD375質粒序列分別進行比對，證明所構建的質粒序列完全正確。
[0078]實施例2
[0079]利用UPR常規檢測技術RT-PCR來檢測HAClmRNA的選擇性剪接規律
[0080]利用常規RT-PCR技術檢測野生型酵母在0.5 μ g/mL的衣霉素、2 μ g/mL的衣霉素、
0.1mM DTT,0.5mM DTT 處理后 HAClmRNA 的剪接率
[0081]1、優選地使用引物
[0082]ACT1-F:GCTTTGTTCCATCCTTCTG，如 SEQ ID NO: 9 所示；
[0083]ACT 1-R: GAAACACTTGTGGTGAACGjn SEQ ID NO: 10 所示；
[0084]HAC1-F:AGGAAAAGGAACAGCGAAGGjn SEQ ID NO: 11 所示；
[0085]HAC1-R:GAATTCAAACCTGACTGCGC，如 SEQ ID NO: 12 所示。
[0086]2、按照常規RT-PCR技術檢測HACl剪接率其步驟為:(I)將野生型酵母BY4741a克隆，挑入3mL SC-URA液體培養基中作為種子菌，30°C，180rpm，過夜培養；(2)次日，將上述種子菌分別轉接到新鮮6mL SC-URA液體培養基，保證初始菌濃在0.40D_左右，30°C，180rpm，額外添加0.5 μ g/mL的衣霉素、2 μ g/mL的衣霉素、0.1mM DTT,0.5mM DTT進行處理3h，同時以不添加任何藥物的組作為對照組，同樣步驟處理3h ； (3)按照takara公司的酵母總RNA提取試劑盒(yeast RNAiso kit, code:D300)的步驟提取野生型酵母總RNA ; (4)按照 takara 公司的 cDNA 合成試劑盒(PrimeScript?IIlst Strand cDNA Synthesis Kit,6210A)操作方法合成cDNA ； (5)按照常規PCR技術對HACl進行PCR檢測，通過凝膠電泳及凝膠成像儀進行光密度分析，并根據分析結果計算不同藥物處理后酵母HACl的剪接率。
[0087]3、結果，采集各處理組的樣品(n = 2)進行HACl剪接率分析，不進行藥物處理的對照組HACl剪接率7.5 %，0.5 μ g/mL衣霉素處理的酵母HACl剪接率為8.9 %，2 μ g/mL衣霉素處理的酵母HACl剪接率為24.9%，0.1mM的DTT處理的酵母HACl剪接率為9.1%，
0.5mM的DTT處理的酵母HACl剪接率為11.5%。對各組的酵母HACl剪接率進行顯著性方差分析，設定α為0.05，發現僅2 μ g/mL衣霉素處理后的酵母HACl剪接率與對照組的HACl剪接率有顯著性差異(如附圖3所示)。
[0088]實施例3
[0089]had Δ、irel Δ為UPR超敏感菌株的證實
[0090]IREl介導的HAClmRNA剪切激活是UPR的重要途徑之一，合成的HACl能夠通過激活下游UPR相關基因的表達提聞內質網蛋白折置能力，以緩解內質網脅迫。HACl或IREl的缺陷將導致細胞應對環境脅迫下的IRE1/HAC1為的內質網脅迫解救機制失效，加劇細胞內的未折疊蛋白在內質網上的積累。為了證實該論點，對HACl和IREl缺失突變體進行UPR誘導藥物的敏感性試驗。
[0091]1、將待測菌株(BY4741a，hacl Λ、irel Λ)挑入3mL SC液體培養基中作為種子菌，30°C，180rpm，過夜培養。
[0092] 2、取約I X 17的酵母細胞(0D_~I)，10倍比進行梯度稀釋后(稀釋5個梯度)，每個濃度梯度取5ul稀釋后的菌液，滴在含有待測藥物(0.5 μ g/mL的衣霉素、0.5mM DTT)的SC固體培養基中，以不含的待測藥物的SC固體培養基作為對照，30°C培養2~5d后觀察。
[0093]3、通過藥物敏感性試驗，可以發現HACl和IREl的缺陷菌株表現出對UPR誘導藥物高度敏感(如圖4所示)，證實了 haclA、irelA為UPR超敏感菌株。
[0094]實施例4
[0095]pUST-08質粒檢測UPR可靠性、靈敏度的證實為了驗證所構建的pUST_08UPR檢測質粒的可靠性，將所構建的pUST-08質粒分別轉入野生型和HACl缺陷型酵母中，檢測衣霉素、DTT等藥物處理后UPR水平。利用藥物、濃度及菌株間的藥物敏感度不同所產生的UPR水平差異，來檢測本檢測系統的可靠性，并對比實施例2的RT-PCR結果，進一步論證本檢測系統的靈敏度。
[0096]1、利用常規酵母電轉化方法，將構建好的pUST-08分別轉入野生型和HACl缺陷型釀酒酵母BY4741a中，經SC-URA平板篩選后獲得陽性克隆。
[0097]2、將上述攜帶有pUST-08質粒的BY4741a陽性克隆，挑入3mL SC-URA液體培養基中作為種子菌，300C，180rpm,過夜培養。
[0098]3、次日，將上述種子菌分別轉接到新鮮6mL SC-URA液體培養基，保證初始菌濃在0.60D_左右，30°C，180rpm，培養約4hr后菌濃達到1.40D6(I(I，從中各取ImL分成1、2、3、4、5、6共6組轉移到1.5mL EP管中，6000g/min，3min收集。收集后各組菌沉淀用ImL的無菌水懸洗一次，以同樣轉速離心收集后，組I用ImL等體積的2%葡萄糖為碳源的SC-URA懸起來、組2用等體積的2%半乳糖作為碳源的SC-URA懸起來、組3~6分別等體積的2%半乳糖作為碳源并額外添加不同藥物(0.5 μ g/mL的衣霉素、2 μ g/mL的衣霉素、0.1mM DTT>0.5mM DTT)的 SC-URA 中懸起來。
[0099]4、各組設立2~4個平行各200 μ L，每個平行等分成兩份各100 μ L轉移到黑色96孔培養板中，封蓋后30°C恒溫靜置3hr。
[0100]5、避光條件下，向其中一份中加入100 μ L的熒光蟲熒光底物ImM D-1uciferin檸檬酸溶液(ImM D-luciferin0.1M檸檬酸鈉，PH = 5.0溶劑)，向另一份加入100 μ L的腔腸素溶液(ImM腔腸素0.1M檸檬酸鈉，PH = 5.0溶劑)，立即避光輕輕晃動30s，使底物與熒光素酶充分混勻。
[0101]6、立即在Imin內根據常規多功能酶標儀檢測規程各樣品的熒光值，檢測模式為luminescence模式,檢測類型為endpoint,積分時間Is,其他均為系統默認值。
7、實驗過程中以同樣攜帶pUST-08的hacl缺陷菌株作為對照，按本實施例步驟中的2~6步的方法對攜帶有pUST-08質粒的hacl缺陷菌株進行相同的操作及檢測。
[0102]8、在野生型酵母進行的檢測中，對比0.5 μ g/mL的衣霉素、2 μ g/mL的衣霉素、
0.1mM DTT,0.5mM DTT處理后的Fluc/Rluc比值，發現野生型酵母經不同濃度不同藥物處理后，Fluc/Rluc比值與不進行處理的對照有顯著差異，且其比值與藥物種類、處理濃度相對應(如附圖5所示);通過與實施例2的結果進行對比，發現本檢測系統且能檢測出常規RT-PCR技術難以檢測的低濃度的衣霉素和DTT所引起的UPR，證實該檢測系統較常規UPR檢測技術靈敏度更高；在1^(31突變菌株的檢測中，進行相同藥物及濃度的處理后，所檢測到的UPR水平較野生型要高。但對于2 μ g/mL的衣霉素處理后UPR水平，兩者無明顯差異(如附圖5所示)。基于上述結果，可以證實pUST-08質粒檢測UPR可靠性高、靈敏度高。
[0103]實施例5
[0104]pUST-08質粒中的Haclintron剪接調節機制的證實
[0105]為了驗證pUST-08質粒中的Haclintron剪接調節機制與內源Haclintron調節機制的一致性，分別針對Haclintron轉錄后調控及IREl介導的Haclintron剪接進行了驗證。
[0106]1、在構建好的pUST-08基礎上，在Fluc-Hacli序列中插入甘油CYCl終止序列CYClt,即 Fluc-CYClt-Hacli，將該質粒命名為 pUST-09 (PUST-09 型 Gal 10p-Rluc-Haclp-Fluc-CYCIt-HacIi UPR檢測雙熒光素酶報告元件，其核酸序列如SEQ ID NO: 14所示)。通過在Fluc下游引入CYCl終止序列，阻礙質粒中Hacli的轉錄,使質粒中的Hacli喪失翻譯調控功能，以此驗證pUST-08質粒中Haclintron對Fluc的調控作用。
[0107]2、按照實施例1的方法，在pUST-08中的Fluc-Hacli序列中插入甘油CYCl終止序列CYClt，將純化后的pUST-08及PJD375進行BamH1、KpnI雙酶切，酶切后進行凝膠電泳，將pUST-08酶切所得的約8.0kbp的pUST-08載體及PJD375酶切后所得的約1.9kbp的Fluc-CYClt片段進行割膠回收并純化。
[0108]3、將純化后的酶切產物pUST-08載體及Fluc-CYClt經T4連接酶的作用下進行連接，轉入大腸桿菌DH5 α后，經含氨芐青霉素篩LB平板篩選，后經菌落PCR驗證獲得正確質粒，所獲質粒即為pUST-09。
[0109]4、按照實施例4的方法，將質粒pUST-09轉入野生型釀酒酵母中，經SC-URA平板篩選后獲得陽性克隆。
[0110]5、按照實施例4的方法，利用pUST-09質粒檢測衣霉素、DTT處理后野生型酵母的UPR水平。結果發現攜帶pUST-09的野生型酵母在不同濃度不同藥物處理后，Fluc/Rluc比值與不進行處理的對照同樣沒有顯著差異(如附圖6所示)，pUST-08中Haclintron的正常轉錄是保證pUST-08具有UPR檢測功能的重要前提。
[0111]6、按照實施例4的方法，將質粒pUST-08轉入IREl缺陷型酵母中，經SC-URA平板篩選后獲得陽性克隆。
[0112]7、按照實施例4 的方法，利用pUST-08質粒檢測衣霉素、DTT處理后IREl缺陷型酵母的UPR水平。結果發現攜帶pUST-08的IREl缺陷型酵母在不同濃度不同藥物處理后，Fluc/Rluc比值與不進行處理的對照同樣沒有顯著差異(如附圖7所示)，pUST-08中Haclintron剪接機制與內源Haclintron —樣，是依賴于IREl的剪接調節機制。
[0113]8、基于本實例中第5條和第7條的結果，證實了 pUST-08質粒中的Haclintron剪接調節機制與內源Haclintron調節機制是一致的。
【權利要求】
1.一種檢測活體酵母細胞UPR水平的雙熒光素酶監測質粒，其特征在于:所述質粒為pUST-08質粒；具體為GallOp-Rluc-Haclp-Fluc-Hacli UPR檢測雙熒光素酶報告元件，其核酸序列如SEQ ID NO: 13所示。
2.一種如權利要求1所述的檢測活體酵母細胞UPR水平的雙熒光素酶監測質粒的構建，包括: (1)設計用于GallOp、Rluc-Haclp、Hacl1、Fluc片段PCR擴增的上下游引物； (2)利用PCR技術，以含Gal1p序列的質粒YEP51-1 ipinl、含Rluc和Fluc序列的質粒PJD375和含HACi序列的酵母基因組作為擴增模板，擴增GallOp、Rluc-Haclp、Hacl1、Fluc序列； (3)利用基因克隆技術，依次將GallOp、Rluc-Haclp、Hacl1、Fluc克隆到質粒YCplac33中，組成GallOp-Rluc-Haclp-Fluc-Hacli UPR雙熒光素酶報告元件，即為pUST_08質粒。
3.根據權利要求2所述的一種檢測活體酵母細胞UPR水平的雙熒光素酶監測質粒的構建，其特征在于:所述步驟(1)中GallOp、Rluc-Haclp、Hacl1、Fluc片段PCR擴增的上下游引物為:
GallOp - F:ACGCCAAGCTTGATCAAAAATCATCGCTTCG ；
GallOp - R:GCTCTAGACTCGACTCAAAAATTCTTAC ；
Rluc - Haclp - F :GCTCTAGAGTCCACCAATGACTTCGAAA ；
Rluc - Haclp _ R:CGGGATCCTAGGTGGGGGAGGAGGAGGTTCGACATTTGTTCATTTTTGAG ；
Hacl1- F:GGGGTACCTATAGCGGGAAACAGTCTAC ；
Hacl1-R:CCACCAACAGCGATAATAAC ；
Fluc - F:TCAAAAATGAACAAATGTCG ；
Fluc - R:GGGGTACCATGACTCGAGCACGTGTTAC。
4.一種如權利要求1所述的檢測活體酵母細胞UPR水平的雙熒光素酶監測質粒的應用，包括: (1)將pUST-08轉入釀酒酵母BY4741a中，于SC-URA培養基中篩選； (2)將上述攜帶有pUST-08的酵母BY4741a進行復蘇，次日進行活化，離心，洗滌，配制酵母菌懸液； (3)取上述酵母菌懸液，并分成兩等份，分別轉移到培養板中，靜置誘導，然后向一份中加入D-熒光素鉀檸檬酸鈉溶液,另一份加入腔腸素溶液,避光晃動20-30s,然后在Imin內檢測熒光素酶熒光值。
5.根據權利要求4所述的一種檢測活體酵母細胞UPR水平的雙熒光素酶監測質粒的應用，其特征在于:所述步驟(2)中活化為0.60D_的初始菌濃活化4hr。
6.根據權利要求4所述的一種檢測活體酵母細胞UPR水平的雙熒光素酶監測質粒的應用，其特征在于:所述步驟(2)中洗滌為用無菌水懸洗。
7.根據權利要求4所述的一種檢測活體酵母細胞UPR水平的雙熒光素酶監測質粒的應用，其特征在于:所述步驟(2)配制酵母菌懸液為:用2%葡萄糖為碳源的SC-URA、2%半乳糖作為碳源的SC-URA或2%半乳糖作為碳源并添加藥物的SC-URA懸起來，即得。
8.根據權利要求7所述的一種檢測活體酵母細胞UPR水平的雙熒光素酶監測質粒的應用，其特征在于:所述藥物為衣霉素Tm和/或二硫蘇糖醇DTT。
9.根據權利要求4所述的一種檢測活體酵母細胞UPR水平的雙熒光素酶監測質粒的應用，其特征在于:所述步驟(3)中靜置誘導為30°C靜置誘導3hr。
10.根據權利要求4所述的一種檢測活體酵母細胞UPR水平的雙熒光素酶監測質粒的應用，其特征在于:所述步驟(3)中D-熒光素鉀檸檬酸鈉溶液的濃度為ImM，腔腸素溶液的濃度為20 μ M ；D-熒光 素鉀檸檬酸鈉溶液或腔腸素溶液于酵母菌懸液的體積比為1:1。
【文檔編號】C12Q1/68GK104164443SQ201410333939
【公開日】2014年11月26日 申請日期:2014年7月14日 優先權日:2014年7月14日
【發明者】黃志偉, 房志家, 匡鑫, 杜秀秀, 劉偉偉, 肖君華 申請人:東華大學