一種酶溶性高純超螺旋結(jié)構(gòu)Ⅰ型膠原蛋白的制備方法
【專利摘要】本發(fā)明是一種酶溶性高純超螺旋結(jié)構(gòu)Ⅰ型膠原蛋白，也是一種低抗原性高純超螺旋結(jié)構(gòu)Ⅰ型膠原蛋白的制備方法，其特征在于：選取主要含有Ⅰ型膠原蛋白的魚鱗作為原料，經(jīng)堿處理去除雜蛋白和脂肪，酸處理去除魚鱗的鈣鹽后，添加弱酸溶液作為提取劑，同時(shí)加入胃蛋白酶進(jìn)行低溫?cái)嚢杞幔岷罄鋬鲭x心得酶溶性Ⅰ型膠原蛋白粗提液；然后將酶溶性Ⅰ型膠原蛋白粗提液通過膜分離技術(shù)純化，再用冷凍干燥，即得純度不低于90％，保持三螺旋結(jié)構(gòu)的酶溶性Ⅰ型膠原蛋白。運(yùn)用本發(fā)明方法所制備的膠原蛋白產(chǎn)品抗原性低，構(gòu)型明確，三螺旋結(jié)構(gòu)完整，通過HPLC檢測(cè)，為純度≥90％的Ⅰ型膠原蛋白，通過MALDI-TOF-MS檢測(cè)，質(zhì)譜圖無雜峰，其分子量為288kDa。
【專利說明】一種酶溶性高純超螺旋結(jié)構(gòu)I型膠原蛋白的制備方法

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及到一種具有三螺旋結(jié)構(gòu)的酶溶性高純I型膠原蛋白的制備工藝，同時(shí) 也是一種低抗原性高純I型膠原蛋白的制備工藝，屬于生物提取【技術(shù)領(lǐng)域】。

【背景技術(shù)】
[0002] 膠原蛋白是動(dòng)物支持結(jié)構(gòu)中最主要也是最重要的一類蛋白質(zhì)，在人體的皮膚、血 管、骨骼、軟骨以及結(jié)締組織中廣泛分布。它具有特殊的三螺旋結(jié)構(gòu)，也稱為超螺旋結(jié)構(gòu)，即 由三條左手螺旋α鏈通過右手螺旋的方式互相纏繞而成。同時(shí)，膠原蛋白的甘氨酸含量幾 乎占了 1/3,脯氨酸和羥脯氨酸的含量為各種蛋白質(zhì)中含量最高，膠原蛋白還擁有其它蛋白 質(zhì)不存在的羥基賴氨酸。膠原蛋白特有的空間結(jié)構(gòu)和化學(xué)組成，使其具備很強(qiáng)的生物活性 和獨(dú)特的生物功能，在食品、保健品、化妝品、生物醫(yī)藥等眾多領(lǐng)域中都有十分廣泛的應(yīng)用。
[0003] 特別是在高端的生物醫(yī)藥領(lǐng)域，高純超螺旋結(jié)構(gòu)膠原蛋白是細(xì)胞外基質(zhì)（EMC)的 主要化合物，具有其他材料所不具備的低毒性、低免疫抗原性、高生物相容性、可生物降解 性等優(yōu)勢(shì)，它能參與細(xì)胞的遷移、分化和增殖，并使骨、腱、軟骨和皮膚具有一定的機(jī)械強(qiáng) 度，可作為生物材料，具有巨大的市場(chǎng)價(jià)值。據(jù)統(tǒng)計(jì)，全球市場(chǎng)每年要銷售超過40億美元的 以膠原蛋白為原料的生物醫(yī)用材料。
[0004] 由于從不同組織中分離純化得到的膠原蛋白在肽鏈、氨基酸組成、理化性質(zhì)和膠 原蛋白構(gòu)型方面有顯著的差異，因此本發(fā)明選擇生物體內(nèi)含量最為豐富和市場(chǎng)潛力最為巨 大的I型膠原蛋白作為目標(biāo)產(chǎn)品，同時(shí)，針對(duì)近年來由于瘋牛病、口蹄疫等疾病在全球范圍 內(nèi)肆虐，而導(dǎo)致人們逐漸對(duì)原來以豬、牛等陸生哺乳動(dòng)物的皮、腱等為原料提取的膠原蛋白 的安全性產(chǎn)生置疑的不利趨勢(shì)，以及由于特定宗教原因，在信仰伊斯蘭教地區(qū)的人民對(duì)源 自牲畜的膠原蛋白存在固有排斥的不利情況，本發(fā)明挑選主要含有I型膠原蛋白的魚鱗作 為制備原料。
[0005] 生物制品的抗原性將大大限制其在食品、化妝品、藥品等領(lǐng)域的應(yīng)用。相關(guān)文獻(xiàn)顯 示以魚鱗或魚皮為原料制備膠原蛋白，如果采取酸溶提取或因處理不當(dāng)而導(dǎo)致膠原蛋白變 性成為明膠，均有可能使制品的抗原性增大。而酶溶提取可以去除膠原蛋白的主要抗原決 定基團(tuán)一位于非螺旋部分的端肽，這樣既可以保持膠原蛋白的三螺旋結(jié)構(gòu)，又可以有效 降低膠原蛋白制品的抗原性，保證膠原蛋白在食品、保健品、化妝品、生物醫(yī)藥領(lǐng)域的廣泛 應(yīng)用。正因如此，它被大量中外文獻(xiàn)推崇使用。
[0006] 目前，現(xiàn)有技術(shù)中膠原蛋白的提取分離工藝基本都是先將原料經(jīng)過氫氧化鈉脫除 雜蛋白，再在低溫條件下，采用單純的醋酸溶劑或一定量的胃蛋白酶配合醋酸溶劑長(zhǎng)時(shí)間 浸泡提取粗酸溶性膠原蛋白或粗酶溶性膠原蛋白，在此基礎(chǔ)上，加入大量的鹽（氯化鈉或 是硫酸銨）進(jìn)行鹽析沉淀，或是調(diào)解pH至中堿性條件凝絮成蛋白質(zhì)凝膠，再將蛋白沉淀或 凝膠用酸溶解，然后裝入透析袋中，使用蒸餾水或〇. 02M磷酸氫二鈉進(jìn)行長(zhǎng)時(shí)間的反復(fù)透 析，透析后得到的膠原蛋白液體通過冷凍干燥得到最終的酸溶性膠原蛋白或酶溶性膠原蛋 白。這些制備工藝的缺陷在于：工藝設(shè)計(jì)沒有關(guān)注酸溶和酶溶兩種提取方法對(duì)膠原蛋白產(chǎn) 品抗原性的影響，流程繁瑣復(fù)雜，分離純化周期冗長(zhǎng)，制備成本高，工藝很難放大并實(shí)施規(guī) 模化生產(chǎn)；而且制備的酶溶性膠原蛋白構(gòu)型不明確，三螺旋結(jié)構(gòu)是否完整不清楚，分子量的 數(shù)值不確切，產(chǎn)品的純度有限--最多只能達(dá)到SDS-PAGE電泳級(jí)別，產(chǎn)品的得率也不高。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0007] 本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)的不足，提供一種工藝更為簡(jiǎn)便，成 本更為低廉，周期更為緊湊，后續(xù)放大規(guī)模化生產(chǎn)更為容易，同時(shí)保證產(chǎn)品的純度、得率、低 抗原性和特有的三螺旋結(jié)構(gòu)的酶溶性高純I型膠原蛋白的制備工藝，為大宗魚類水產(chǎn)下腳 料--魚鱗突破制約高值開發(fā)的技術(shù)瓶頸，在食品、保健品、化妝品和藥品，特別在高端生 物材料領(lǐng)域的高值開發(fā)利用開拓新的途徑。
[0008] 本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是通過以下的技術(shù)方案來實(shí)現(xiàn)的。本發(fā)明是一種酶溶 性高純超螺旋結(jié)構(gòu)I型膠原蛋白的制備工藝，所述的"高純"為色譜純度90%以上，方法包 括以下步驟： (1) 原料預(yù)處理 將魚鱗投入反應(yīng)荃中，加入魚鱗重量2?10倍的堿溶液，攪拌1?12小時(shí)，除掉魚鱗 的脂肪和雜蛋白等雜質(zhì)，用水洗凈，加入魚鱗重量2?10倍的酸溶液，攪拌1?12小時(shí)，再 用水洗凈，其中堿溶液的質(zhì)量體積濃度為1?4%，酸溶液的質(zhì)量體積濃度為3?8%，預(yù)處 理溫度控制在0?25°C之間； (2) I型膠原蛋白提取 向處理后的原料中添加0. 05?10m〇l/L的弱酸作為提取液，浸提溫度為0?10°C，原 料與提取劑的重量比為1:10,同時(shí)加入原料重量〇. 05%?5%的胃蛋白酶進(jìn)行2?72小時(shí) 的攪拌浸提，提取步驟可重復(fù)〇?5次，浸提液可混合匯總，再進(jìn)行離心過濾5?120分鐘， 所得的離心上清液為酶溶性I型膠原蛋白粗提液， (3) I型膠原蛋白分離純化 膜分離工藝技術(shù)純化酶溶性I型膠原蛋白粗提液。粗提液用孔徑為〇. 2?0. 1 μ m或 相對(duì)分子量為300KD?200KD的超濾膜，超濾膜流速為0. 91?1. 82立方米/小時(shí)，膜壓力 為0. 1?0. 4Mpa，溫度為0?10°C，去除殘余的胃蛋白酶、小分子雜質(zhì)和無機(jī)鹽，濃縮得到 色譜純度> 90%，具備三螺旋結(jié)構(gòu)的高純I型膠原蛋白溶液。 (4) I型膠原蛋白冷凍干燥 冷凍干燥熱敏性的I型膠原蛋白溶液，得到酶溶性高純超螺旋結(jié)構(gòu)I型膠原蛋白固體 成品。
[0009] 所述步驟（1)原料預(yù)處理所使用的魚鱗可以是海洋魚類魚鱗或淡水魚類魚鱗。
[0010] 所述步驟⑴原料預(yù)處理所使用的堿為碳酸氫鈉（鉀）或氫氧化鈉（鉀）；酸為 鹽酸或硝酸。
[0011] 所述步驟（2)所使用的弱酸為醋酸、檸檬酸、草酸或蘋果酸。
[0012] 所述步驟（2)所使用的離心機(jī)為8000?15000rpm的大型高速冷凍離心機(jī)。
[0013] 所述步驟（3)所使用的孔徑為0. 2?0. 1 μ m或相對(duì)分子量為300KD?200KD的 超濾膜流速為1. 20?L 50立方米/小時(shí)，膜壓力為0· 2?0· 3Mpa，溫度為0?10°C。
[0014] 所述步驟（2)中離心過濾和步驟（3)分離純化的溫度為0?10°C。
[0015] 所述步驟（4)所使用的冷凍干燥的隔板溫度為-10?-20°c、真空度為13. 33Pa、 凍干時(shí)間為12?36小時(shí)。
[0016] 所述預(yù)處理步驟前，先對(duì)魚鱗進(jìn)行清洗以除去顆粒雜質(zhì)。
[0017] 與現(xiàn)有技術(shù)和產(chǎn)品相比，本發(fā)明具有以下優(yōu)點(diǎn)：
[0018] 1.本發(fā)明選擇主要含有I型膠原蛋白的魚鱗作為原料，保證了提取的膠原蛋白是 具備明確單一構(gòu)型的I型膠原蛋白。
[0019] 2.本發(fā)明的提取步驟中加入適當(dāng)?shù)奈傅鞍酌福蟠筇岣吡嗣溉苄訧型膠原蛋白的 得率。
[0020] 3.本發(fā)明的提取分離純化步驟全程低溫（0?10°C )控制并結(jié)合冷凍干燥技術(shù)， 保證提取的I型膠原蛋白特有的三螺旋結(jié)構(gòu)的完整性。
[0021] 4.本發(fā)明摒棄了傳統(tǒng)工藝中常用的Tris試劑和用于鹽析步驟的大量中性鹽，節(jié) 約了生產(chǎn)成本。
[0022] 5.本發(fā)明運(yùn)用膜分離技術(shù)純化I型膠原蛋白，快速去除殘余的胃蛋白酶、小分子 雜質(zhì)和無機(jī)鹽，大大縮短了純化時(shí)間和生產(chǎn)周期。
[0023] 6.本發(fā)明工藝流程簡(jiǎn)單合理，工藝得率高，適合規(guī)模化生產(chǎn)。
[0024] 7.本發(fā)明得到的超螺旋結(jié)構(gòu)I型膠原蛋白為具有明確分子量的海洋源高純I型 膠原蛋白，通過MALDI-T0F-MS檢測(cè)，質(zhì)譜圖整體無雜峰，其分子量為288kDa ;通過HPLC檢 測(cè)，其純度彡90%。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0025] 圖1是本發(fā)明的工藝流程圖。
[0026] 圖2是本發(fā)明得到的酶溶性高純超螺旋結(jié)構(gòu)I型膠原蛋白與市場(chǎng)上購(gòu)買的高純I 型膠原蛋白對(duì)照品的SDS-PAGE電泳圖。圖中：marker :SDS-PAGE蛋白質(zhì)高分子量標(biāo)準(zhǔn)蛋白； 1 :鼠尾I型膠原蛋白，Sigma化學(xué)試劑公司（St. Louis，M0, USA) ;2 :三文魚魚皮I型膠原蛋 白，Wako化學(xué)試劑公司（Tokyo, Japan) ;3:酶溶性高純超螺旋結(jié)構(gòu)I型膠原蛋白，本發(fā)明實(shí) 施例1制得。
[0027] 圖3是本發(fā)明得到的酶溶性高純超螺旋結(jié)構(gòu)I型膠原蛋白與市場(chǎng)上購(gòu)買的高純I 型膠原蛋白對(duì)照品的凝膠色譜圖。圖中：(a)酶溶性高純超螺旋結(jié)構(gòu)I型膠原蛋白，本發(fā)明 實(shí)施例1制得；(b)三文魚魚皮I型膠原蛋白，Wako化學(xué)試劑公司（Tokyo, Japan) ; (c)鼠 尾I型膠原蛋白，Sigma化學(xué)試劑公司（St. Louis, M0, USA)。
[0028] 圖4是本發(fā)明得到的酶溶性高純超螺旋結(jié)構(gòu)I型膠原蛋白與市場(chǎng)上購(gòu)買的高純I 型膠原蛋白對(duì)照品的高效液相色譜圖。圖中：(a)酶溶性高純超螺旋結(jié)構(gòu)I型膠原蛋白，本 發(fā)明實(shí)施例1制得；(b)三文魚魚皮I型膠原蛋白，Wako化學(xué)試劑公司（Tokyo, Japan) ;(c) 鼠尾I型膠原蛋白，Sigma化學(xué)試劑公司（St. Louis，M0, USA)。
[0029] 圖5是本發(fā)明實(shí)施例1得到的酶溶性高純超螺旋結(jié)構(gòu)I型膠原蛋白的傅里葉紅外 光譜圖。
[0030] 圖6是本發(fā)明實(shí)施例1得到的酶溶性高純超螺旋結(jié)構(gòu)I型膠原蛋白的基質(zhì)輔助激 光解吸電離飛行時(shí)間質(zhì)譜圖。

【具體實(shí)施方式】
[0031] 下面結(jié)合附圖和具體實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步詳述。
[0032] 實(shí)施例1 :
[0033] -種酶溶性高純超螺旋結(jié)構(gòu)I型膠原蛋白的制備工藝，步驟如下： (1) 原料預(yù)處理 洗凈的魚鱗2kg，先粉碎，再投入反應(yīng)釜中，加入魚鱗重量10倍的堿溶液，攪拌12小時(shí)， 用水洗凈，加入魚鱗重量10倍的酸溶液，攪拌12小時(shí)，再用水洗凈，其中堿溶液的質(zhì)量體積 濃度為3%，酸溶液的質(zhì)量體積濃度為5%，預(yù)處理溫度為25°C ; (2) I型膠原蛋白提取 向處理后的原料中添加0. lmol/L的醋酸、檸檬酸、草酸或蘋果酸作為提取液，浸提溫 度為4°C，原料與提取劑的重量比為1:10,同時(shí)加入原料重量0. 5 %的胃蛋白酶進(jìn)行24小時(shí) 的攪拌浸提，提取步驟可重復(fù)3次，浸提液混合匯總，再進(jìn)行離心過濾，離心機(jī)轉(zhuǎn)速設(shè)定為 lOOOOrpm，離心時(shí)間15分鐘，離心溫度4°C。所得的離心上清液為酶溶性I型膠原蛋白粗 提液， (3) I型膠原蛋白分離純化 用孔徑為0. 2 μ m的超濾膜截留酶溶性I型膠原蛋白粗提液，超濾膜流速為0. 5立方米 /小時(shí)，膜壓力為〇. 4Mpa，溫度為4°C。濃縮得到色譜純度為93. 62%，具備三螺旋結(jié)構(gòu)的高 純I型膠原蛋白溶液。 (4) I型膠原蛋白冷凍干燥 冷凍干燥I型膠原蛋白溶液，設(shè)定隔板溫度為-l〇°C、真空度為13. 33Pa、凍干時(shí)間為24 小時(shí)。即得高純超螺旋結(jié)構(gòu)I型膠原蛋白固體成品。
[0034] 實(shí)施例2 :
[0035] -種酶溶性高純超螺旋結(jié)構(gòu)I型膠原蛋白的制備工藝，步驟如下： (1) 原料預(yù)處理 將洗凈的魚鱗5kg投入反應(yīng)釜中，加入魚鱗重量8倍的堿溶液，攪拌10小時(shí)，用水洗 凈，加入魚鱗重量8倍的酸溶液，攪拌10小時(shí)，再用水洗凈，其中堿溶液的質(zhì)量體積濃度為 2%，酸溶液的質(zhì)量體積濃度為6%，預(yù)處理溫度為20°C ; (2) I型膠原蛋白提取 向處理后的原料中添加0. 25mol/L的醋酸、檸檬酸、草酸或蘋果酸作為提取液，浸提溫 度為4°C，原料與提取劑的重量比為1:10,同時(shí)加入原料重量1%的胃蛋白酶進(jìn)行12小時(shí) 的攪拌浸提，提取步驟可重復(fù)3次，浸提液混合匯總，再進(jìn)行離心過濾，離心機(jī)轉(zhuǎn)速設(shè)定為 SOOOrpm，離心時(shí)間25分鐘，離心溫度6°C。所得的離心上清液為酶溶性I型膠原蛋白粗提 液， (3) I型膠原蛋白分離純化 用孔徑為〇. 1 μ m的超濾膜截留酶溶性I型膠原蛋白粗提液，超濾膜流速為0. 25立方 米/小時(shí)，膜壓力為〇. 3Mpa，溫度為7°C。濃縮得到色譜純度為93. 57%，具備三螺旋結(jié)構(gòu)的 高純I型膠原蛋白溶液。 (4) I型膠原蛋白冷凍干燥 冷凍干燥I型膠原蛋白溶液，設(shè)定隔板溫度為-15°C、真空度為13. 33Pa、凍干時(shí)間為 18小時(shí)。即得1?純超螺旋結(jié)構(gòu)I型I父原蛋白固體成品。
[0036] 實(shí)施例3 :
[0037] -種酶溶性高純超螺旋結(jié)構(gòu)I型膠原蛋白的制備工藝，步驟如下： (1) 原料預(yù)處理 將洗凈的魚鱗〇. 5kg投入反應(yīng)釜中，加入魚鱗重量6倍的堿溶液，攪拌4小時(shí)，用水洗 凈，加入魚鱗重量6倍的酸溶液，攪拌12小時(shí)，再用水洗凈，其中堿溶液的質(zhì)量體積濃度為 1 %，酸溶液的質(zhì)量體積濃度為8%，預(yù)處理溫度為15°C ; (2) I型膠原蛋白提取 向處理后的原料中添加 lmol/L的醋酸、檸檬酸、草酸或蘋果酸作為提取液，浸提溫度 為8°C，原料與提取劑的重量比為1:10,同時(shí)加入原料重量2%的胃蛋白酶進(jìn)行12小時(shí) 的攪拌浸提，提取步驟可重復(fù)2次，浸提液混合匯總，再進(jìn)行離心過濾，離心機(jī)轉(zhuǎn)速設(shè)定為 12000rpm，離心時(shí)間5分鐘，離心溫度8°C。所得的離心上清液為酶溶性I型膠原蛋白粗提 液， (3) I型膠原蛋白分離純化 用相對(duì)分子量為300KD的超濾膜截留酶溶性I型膠原蛋白粗提液，超濾膜流速為0. 15 立方米/小時(shí)，膜壓力為〇. 2Mpa，溫度為3°C。濃縮得到色譜純度為92. 88%，具備三螺旋結(jié) 構(gòu)的高純I型膠原蛋白溶液。 (4) I型膠原蛋白冷凍干燥 冷凍干燥I型膠原蛋白溶液，設(shè)定隔板溫度為_20°C、真空度為13. 33Pa、凍干時(shí)間為24 小時(shí)。即得高純超螺旋結(jié)構(gòu)I型膠原蛋白固體成品。
[0038] 實(shí)施例4 :
[0039] -種酶溶性高純超螺旋結(jié)構(gòu)I型膠原蛋白的制備工藝，步驟如下： (1) 原料預(yù)處理 洗凈的魚鱗l〇kg先粉碎，再投入反應(yīng)釜中，加入魚鱗重量10倍的堿溶液，攪拌8小時(shí)， 用水洗凈，加入魚鱗重量10倍的酸溶液，攪拌8小時(shí)，再用水洗凈，其中堿溶液的質(zhì)量體積 濃度為4%，酸溶液的質(zhì)量體積濃度為6%，預(yù)處理溫度為10°C ; (2) I型膠原蛋白提取 向處理后的原料中添加2mol/L的醋酸、檸檬酸、草酸或蘋果酸作為提取液，浸提溫度 為2°C，原料與提取劑的重量比為1:10,同時(shí)加入原料重量4%的胃蛋白酶進(jìn)行36小時(shí)的攪 拌浸提，提取步驟可重復(fù)〇次，浸提液進(jìn)行離心過濾，離心機(jī)轉(zhuǎn)速設(shè)定為15000rpm，離心時(shí) 間35分鐘，離心溫度:TC。所得的離心上清液為酶溶性I型膠原蛋白粗提液， (3) I型膠原蛋白分離純化 用相對(duì)分子量為200KD的超濾膜截留酶溶性I型膠原蛋白粗提液，超濾膜流速為0. 5 立方米/小時(shí)，膜壓力為〇. IMpa，溫度為5°C。濃縮得到色譜純度為92. 80%，具備三螺旋結(jié) 構(gòu)的高純I型膠原蛋白溶液。 (4) I型膠原蛋白冷凍干燥 冷凍干燥I型膠原蛋白溶液，設(shè)定隔板溫度為_15°C、真空度為13. 33Pa、凍干時(shí)間為36 小時(shí)。即得高純超螺旋結(jié)構(gòu)I型膠原蛋白固體成品。
[0040] 將本發(fā)明得到的酶溶性高純超螺旋結(jié)構(gòu)I型膠原蛋白進(jìn)行SDS-PAGE凝膠電泳檢 測(cè)，發(fā)現(xiàn)其構(gòu)型明確：是典型的I型膠原蛋白一包含兩組不同的α鏈（α?鏈、α2鏈） 和兩者的二聚體（β鏈）；同時(shí)與市場(chǎng)上購(gòu)買到的兩種高純I型膠原蛋白對(duì)照品--美國(guó) Sigma公司制備的鼠尾I型膠原蛋白和日本W(wǎng)ako公司制備的三文魚魚皮I型膠原蛋白對(duì) t匕，本發(fā)明制備的酶溶性高純I型膠原蛋白在電泳級(jí)別上的純度雖與鼠尾I型膠原蛋白相 仿，但優(yōu)于三文魚魚皮I型膠原蛋白。結(jié)果參照?qǐng)D2。電泳方法可參見文章：陳思謹(jǐn)，易瑞 灶，洪碧紅，陳暉，陳俊德，樂卿清，高效液相色譜法測(cè)定魚鱗中的I型膠原蛋白的含量.中 國(guó)海洋藥物（2013, Vol. 32, No. 3)，54-58。
[0041] 將本發(fā)明得到的酶溶性高純超螺旋結(jié)構(gòu)I型膠原蛋白進(jìn)行蛋白層析和高效液 相色譜檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)酶溶性高純超螺旋結(jié)構(gòu)I型膠原蛋白的純度> 90%，在色譜級(jí)別上優(yōu) 于美國(guó)Sigma公司制備的鼠尾I型膠原蛋白和日本W(wǎng)ako公司制備的三文魚魚皮I型膠 原蛋白。結(jié)果參照?qǐng)D3和圖4。蛋白層析方法可參見GE公司說明書：GE Healthcare， Instructions71-5017-96AF，17-5175-01，Superdex20010/300GL。色譜方法可參見文章：陳 思謹(jǐn)，易瑞灶，洪碧紅，陳暉，陳俊德，樂卿清，高效液相色譜法測(cè)定魚鱗中的I型膠原蛋白 的含量·中國(guó)海洋藥物（2013, Vol. 32, No. 3)，54-58。
[0042] 將本發(fā)明得到的酶溶性高純超螺旋結(jié)構(gòu)I型膠原蛋白進(jìn)行傅里葉紅外光譜 (FTIR)測(cè)定，光譜圖中1240cm-l和1454cm-l兩處的吸收比例大約等于1. 0,由此判定酶溶 性高純I型膠原蛋白的三螺旋結(jié)構(gòu)完整。結(jié)果參照?qǐng)D5。光譜測(cè)定和三螺旋結(jié)構(gòu)判定方法 可參見以下文章： 1) Plepis AMDG, Goissis G,Das-Gupta DK. (1996). Dielectric and pyroelectric characterization of anionic and native collagen. Polym Eng Sci36 (24),2932 -2938. 2) Lin Wang, Xinxin An, Fangmei Yang, Zhihong Xin, Liyan Zhao, Qiuhui Hu*. (2008) . Isolation and characterisation of collagens from the skin, scale and bone of deep-sea redfish (Sebastes mentella). Food Chemistryl08, 616-623. 3) L. WANG, X. AN, Z. XIN, L· ZHAO, AND Q. HU. (2007). Isolation and Characterization of Collagen from the Skin of Deep-Sea Redfish(Sebastes mentella). JOURNAL OF FOOD SCIENCE Vol. 72, NO. 8, 〇
[0043] 將本發(fā)明得到的酶溶性高純超螺旋結(jié)構(gòu)I型膠原蛋白進(jìn)行基質(zhì)輔助激光解吸電 離飛行時(shí)間質(zhì)譜（MALDI-T0F-MS)測(cè)定，質(zhì)譜圖整體無雜峰，從中可以清楚地看見位于 96kDa的三倍電荷峰以及位于48kDa的兩倍電荷峰，由此可得，本發(fā)明得到的酶溶性高純超 螺旋結(jié)構(gòu)I型膠原蛋白的分子量為288kDa，質(zhì)譜測(cè)定和分子量判定方法可參見以下文章： 1) Kim, S. H. , Lee, J. H. , Yun, S. Y. , Yoo, J. S. , Jun, C. H. , Chung, K. Y. , &Suh, H. (2000). Reaction monitoring of succinylation of collagen with matrix-assisted laser desorption/ionization mass spectrometry. Rapid Communication Mass Spectrometry, 14, 2125-2128. 2) Xiong, X. , Ghosh, R. , Hi ller, E. , Drepper, F. , Knapp, B. , Brunner, H. , &Rupp, S. (2009) . A new procedure for rapid, high yield purification of Type I collagen for tissue engineering. Process Biochemistry, 44, 1200 - 1212. 3) Kumar, R. , Sripriya, R. , Balaji, S. , Kumar, M. S. , &Sehgal, P. K. (2011). Physical characterization of succinylated type I collagen by Raman spectra and MALDI-TOF/MS and in vitro evaluation for biomedical applications. Journal of Molecular Structure，994, 117-124。
【權(quán)利要求】
1. 一種酶溶性高純超螺旋結(jié)構(gòu)I型膠原蛋白的制備方法，其特征在于，其步驟如下： (1) 原料預(yù)處理 將魚鱗投入反應(yīng)荃中，加入魚鱗重量2?10倍的堿溶液，攪拌1?12小時(shí)，除掉魚鱗 包括脂肪和雜蛋白在內(nèi)的雜質(zhì)，用水洗凈，加入魚鱗重量2?10倍的酸溶液，攪拌1?12 小時(shí)，再用水洗凈，其中堿溶液的質(zhì)量體積濃度為1?4%，酸溶液的質(zhì)量體積濃度為3? 8%，預(yù)處理溫度控制在0?25°C之間； (2) I型膠原蛋白提取 向處理后的原料中添加0. 05?10m〇l/L的弱酸作為提取劑，浸提溫度為0?10°C，原 料與提取劑的重量比為1:10,同時(shí)加入原料重量〇. 05%?5%的胃蛋白酶進(jìn)行2?72小時(shí) 的攪拌浸提，提取步驟重復(fù)〇?5次，浸提液混合匯總，再進(jìn)行冷凍離心過濾，所得的離心上 清液為酶溶性I型膠原蛋白粗提液， (3) I型膠原蛋白分離純化 膜分離工藝技術(shù)純化酶溶性I型膠原蛋白粗提液，粗提液用孔徑為〇. 2?0. 1 μ m或相 對(duì)分子量為300KD?200KD的超濾膜，超濾膜流速為0. 91?1. 82立方米/小時(shí)，膜壓力為 0. 1?0. 4Mpa，溫度為0?10°C，去除殘余的胃蛋白酶、小分子雜質(zhì)和無機(jī)鹽，濃縮得到色譜 純度> 90%，具備三螺旋結(jié)構(gòu)的高純I型膠原蛋白溶液； (4) I型膠原蛋白冷凍干燥 冷凍干燥熱敏性的I型膠原蛋白溶液，得到酶溶性高純超螺旋結(jié)構(gòu)I型膠原蛋白成品。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述酶溶性高純超螺旋結(jié)構(gòu)I型膠原蛋白的制備方法，其特征在 于：所述步驟（1)原料預(yù)處理所使用的魚鱗為海洋魚類魚鱗或淡水魚類魚鱗。
3. 根據(jù)權(quán)利要求1所述酶溶性高純超螺旋結(jié)構(gòu)I型膠原蛋白的制備方法，其特征在 于：所述步驟（1)原料預(yù)處理所使用的堿為碳酸氫鈉、碳酸氫鉀、氫氧化鈉或氫氧化鉀；酸 為鹽酸或硝酸。
4. 根據(jù)權(quán)利要求1所述酶溶性高純超螺旋結(jié)構(gòu)I型膠原蛋白的制備方法，其特征在 于：所述步驟（2) I型膠原蛋白提取所使用的弱酸為醋酸、檸檬酸、草酸或蘋果酸。
5. 根據(jù)權(quán)利要求1所述酶溶性高純超螺旋結(jié)構(gòu)I型膠原蛋白的制備方法，其特征在 于：所述步驟（2)中所使用的離心機(jī)為8000?15000rpm的大型高速冷凍離心機(jī)。
6. 根據(jù)權(quán)利要求1所述酶溶性高純超螺旋結(jié)構(gòu)I型膠原蛋白的制備方法，其特征在 于：所述步驟（3)分離純化使用孔徑為0. 2?0. 1 μ m或相對(duì)分子量為300KD?200KD的超 濾膜時(shí)，流速為1.20?1.50立方米/小時(shí)，膜壓力為0.2?0.3Mpa，溫度為0?10°C。
7. 根據(jù)權(quán)利要求1所述酶溶性高純超螺旋結(jié)構(gòu)I型膠原蛋白的制備方法，其特征在 于：所述步驟（2)中離心過濾和步驟（3)分離純化的溫度為0?10°C。
8. 根據(jù)權(quán)利要求1所述酶溶性高純超螺旋結(jié)構(gòu)I型膠原蛋白的制備方法，其特征在 于：所述步驟（4)中所使用的冷凍干燥的隔板溫度為-10?_20°C、真空度為13. 33Pa、凍干 時(shí)間為12?36小時(shí)。
9. 根據(jù)權(quán)利要求1所述酶溶性高純超螺旋結(jié)構(gòu)I型膠原蛋白的制備方法，其特征 在于：所述的酶溶性高純超螺旋結(jié)構(gòu)I型膠原蛋白為低抗原性高純超螺旋結(jié)構(gòu)I型膠原 蛋白；通過HPLC檢測(cè)，純度> 90 %，通過MALDI-T0F-MS檢測(cè)，質(zhì)譜圖無雜峰，分子量為 288kDa，具備三螺旋結(jié)構(gòu)的高純I型膠原蛋白。
10.根據(jù)權(quán)利要求1?9任一項(xiàng)所述酶溶性高純超螺旋結(jié)構(gòu)I型膠原蛋白的制備方法， 其特征在于：所述步驟1)原料預(yù)處理之前，先對(duì)魚鱗進(jìn)行清洗以除去顆粒雜質(zhì)。
【文檔編號(hào)】C12P21/06GK104152519SQ201410341024
【公開日】2014年11月19日 申請(qǐng)日期:2014年7月17日 優(yōu)先權(quán)日:2013年11月26日
【發(fā)明者】陳思謹(jǐn), 易瑞灶, 陳暉 , 洪碧紅, 謝全靈 申請(qǐng)人:國(guó)家海洋局第三海洋研究所