一種酶法生產(chǎn)α-酮戊二酸的方法
【專利摘要】一種酶法生產(chǎn)α-酮戊二酸的方法，分別合成glr基因和daao基因，構(gòu)建表達載體pET24a-glr的構(gòu)建和表達載體pET24a-daao；表達載體pET24a-glr和表達載體pET24a-daao分別雙酶切后連接，構(gòu)建雙表達載體pET24a-glr-daao轉(zhuǎn)入大腸桿菌，制備同時表達谷氨酸消旋酶和D-氨基酸氧化酶的基因工程菌；在發(fā)酵罐中加入該工程菌的濕菌體至水中，然后加入L-谷氨酸、過氧化氫酶，最后用氫氧化鈉調(diào)pH，制備出反應(yīng)體系進行反應(yīng)；將反應(yīng)結(jié)束的反后應(yīng)體系中轉(zhuǎn)化出的α-酮戊二酸進行分離純化；本發(fā)明成本低，轉(zhuǎn)化率和產(chǎn)物濃度高，轉(zhuǎn)化率達到84%以上，更適合工業(yè)應(yīng)用。
【專利說明】-種酶法生產(chǎn)α-酮戊二酸的方法

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及一種生產(chǎn)α-酮戊二酸的方法，具體的說是酶法生產(chǎn)α-酮戊二酸的 方法。

【背景技術(shù)】
[0002] α -酮戊二酸（a-Ketoglutaric acid)是細胞糖代謝的一種關(guān)鍵物質(zhì)，參與了很 多的細胞生化代謝途徑，包括三羧酸循環(huán)、氨基酸和蛋白質(zhì)代謝等。α -酮戊二酸在工業(yè)上 用途廣泛，可作為膳食補充劑、用于合成一些雜環(huán)化合物的組件，作為人類和動物氧化應(yīng)激 反應(yīng)的保護劑、與其他物質(zhì)配合能夠提高運動員成績和促進康復(fù)等。
[0003] α-酮戊二酸生產(chǎn)方法有多種，如化學(xué)合成法，微生物發(fā)酵法、酶促轉(zhuǎn)化法等。化 學(xué)合成法以琥珀酸和草酸二乙酯為原料經(jīng)化學(xué)反應(yīng)制備，由于成本過高、污染嚴重而被淘 汰。微生物發(fā)酵法主要以誘變育種獲得的熒光假單胞菌、解脂耶氏酵母等微生物以甘油、 礦物油或菜籽油等原料發(fā)酵獲得，該方法產(chǎn)量高、轉(zhuǎn)化率高，是目前國外用的較多的一種方 法，但該方法的缺陷在于發(fā)酵副產(chǎn)物較多，尤其是會有較多丙酮酸產(chǎn)生，而丙酮酸和α -酮 戊二酸性質(zhì)較為接近，給后續(xù)的分離純化工作帶來很大的困難，導(dǎo)致收率降低，純化成本過 高等問題。酶促轉(zhuǎn)化法主要目前報道的有以L-谷氨酸為底物，利用L-谷氨酸氧化酶催化 形成α-酮戊二酸，該反應(yīng)結(jié)束后，體系中主要產(chǎn)物為α-酮戊二酸，副產(chǎn)物氧氣和水易于 除去，分離純化工藝簡單，純化收率高。但L-谷氨酸氧化酶在常用的大腸桿菌宿主中表達 困難，活性不高，提高了發(fā)酵的成本。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 本發(fā)明目的是為解決上述技術(shù)問題的不足，提供一種酶法生產(chǎn)α -酮戊二酸的方 法，利用谷氨酸消旋酶將L-谷氨酸轉(zhuǎn)化為D-谷氨酸，然后利用高活性的D-氨基酸氧化酶 將生成的D-谷氨酸進一步轉(zhuǎn)化為α -酮戊二酸，從而有效的避免了 L-谷氨酸氧化酶發(fā)酵 成本過高的難題，同時也避免了發(fā)酵法產(chǎn)物分離純化困難的缺陷，有利于工業(yè)化生產(chǎn)。
[0005] -種酶法生產(chǎn)α -酮戊二酸的方法，以L-谷氨酸為底物，經(jīng)谷氨酸消旋酶催化， 將L-谷氨酸轉(zhuǎn)化為DL-谷氨酸混旋物；混旋物中的D-谷氨酸與反應(yīng)體系中的氧氣和水 在D-氨基酸氧化酶催化下生成α -酮戊二酸、氨和過氧化氫；隨著D-谷氨酸的被消耗， L-谷氨酸在消旋酶的作用下持續(xù)生成DL-谷氨酸，直至全部轉(zhuǎn)化為D-谷氨酸，并最終形成 α -酮戊二酸；反應(yīng)過程中生成的α-酮戊二酸在過氧化氫存在下易發(fā)生脫羧反應(yīng)生成丁 二酸，因此，反應(yīng)體系需加入過氧化氫酶，以便將反應(yīng)生成的過氧化氫水解成水和氧氣，避 免α-酮戊二酸被氧化。
[0006] -種酶法生產(chǎn)α-酮戊二酸的方法，其具體生產(chǎn)方法的步驟為： 步驟一、同時表達谷氨酸消旋酶和D-氨基酸氧化酶的基因工程菌的構(gòu)建 (1)、表達載體pET24a-glr的構(gòu)建 a、根據(jù)全球公共數(shù)據(jù)庫GenBank，登錄號AB003685. 1所述記載來自于枯草芽孢桿菌 IFO 3336編碼谷氨酸消旋酶的glr基因序列，兩端分別加上酶切位點Ndel和BamHI，起始 密碼子由TTG改為ATG后，進行全基因合成，合成的glr基因具體序列如SEQ ID NO :1 ; b、 將合成的glr基因用Ndel和BamHI雙酶切，純化備用； c、 抽提大腸桿菌表達載體pET24a，用Ndel和BamHI雙酶切，與上步純化的glr基因片 段連接，轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5 α感受態(tài)細胞； d、 挑取陽性轉(zhuǎn)化子并測序鑒定后，抽提質(zhì)粒獲得glr表達載體pET24a-glr ; (2) 、表達載體pET24a_daao的構(gòu)建 a、 根據(jù)全球公共數(shù)據(jù)庫GenBank，登錄號AB003685. 1所述記載來自于變異三角酵母 CBS4095菌株中編碼D-氨基酸氧化酶的基因 daao序列，兩端分別加上酶切位點Ndel和 BamHI后，進行全基因合成，合成的daao基因具體序列如SEQ ID NO :2 ; b、 將合成的daao基因用Ndel和BamHI雙酶切，純化備用； c、 抽提大腸桿菌表達載體pET24a，用Ndel和BamHI雙酶切，與上步純化的daao片段連 接，轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5 α感受態(tài)細胞； d、 挑取陽性轉(zhuǎn)化子并測序鑒定后，抽提質(zhì)粒獲得daao表達載體pET24a_daao ; (3) 、同時表達谷氨酸消旋酶和D-氨基酸氧化酶的基因工程菌的構(gòu)建 a、 將構(gòu)建好的表達載體pET24a- daao,用Bglll和Hindlll雙酶切，回收包含了 T7啟 動子、核糖體結(jié)合位點和daao基因編碼序列的片段，純化備用； b、 構(gòu)建好的表達載體pET24a-glr，用BamHI和Hindlll雙酶切，純化，利用Bglll和 BamHI同尾酶的特性與上述a中所準備好的基因片段連接，得到連接后基因片段，備用； c、 將上述連接后基因片段轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5 α感受態(tài)細胞，挑取陽性轉(zhuǎn)化子并測序鑒 定；抽提質(zhì)粒獲得glr和daao雙表達載體pET24a-glr_daao ; d、 將雙表達載體pET24a-glr-daao轉(zhuǎn)入大腸桿菌BL21 (DE3)菌株中，獲得可以誘導(dǎo)同 時表達谷氨酸消旋酶和D-氨基酸氧化酶的基因工程菌； 步驟二、D-氨基酸氧化酶的D-氨基酸氧化酶基因工程菌的培養(yǎng) 將上述步驟一所制備的同時表達谷氨酸消旋酶和D-氨基酸氧化酶的基因工程菌進行 培養(yǎng)，培養(yǎng)的過程中加入異丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷，最后收集菌體，得到同時表達 谷氨酸消旋酶和D-氨基酸氧化酶的基因工程菌，備用；所述同時表達谷氨酸消旋酶和D-氨 基酸氧化酶的基因工程菌培養(yǎng)方法為： (1) 、步驟一所述同時表達谷氨酸消旋酶和D-氨基酸氧化酶的基因工程菌單菌落接種 到LB液體培養(yǎng)基中，置于37°C過夜培養(yǎng)，得到基因工程菌種子培養(yǎng)液； (2) 、將所培養(yǎng)的基因工程菌種子培養(yǎng)液分別接種到TB培養(yǎng)基中，接種量為TB培養(yǎng)基 體積的2% ;然后置于37°C培養(yǎng)5小時左右，加入異丙基-β -D-硫代吡喃半乳糖苷至終濃度 0. 2mmol/L，降溫至25°C繼續(xù)培養(yǎng)20小時左右，培養(yǎng)結(jié)束，離心收集同時表達谷氨酸消旋酶 和D-氨基酸氧化酶的基因工程菌。
[0007] 步驟三、以L-谷氨酸為原料，轉(zhuǎn)化生產(chǎn)α -酮戊二酸 在發(fā)酵罐中加入同時表達谷氨酸消旋酶和D-氨基酸氧化酶的基因工程菌濕菌體至水 中，濕菌體的質(zhì)量為水質(zhì)量的3-5%，然后加入L-谷氨酸至終濃度90-100g/L，再加入過氧 化氫酶至濃度為100萬-400萬單位/升，最后用氫氧化鈉調(diào)pH至7. 5-8. 2,即制備出轉(zhuǎn)化 體系；水浴保持反應(yīng)體系在30-40°C，通氣攪拌反應(yīng)，即將反應(yīng)體系中的L-谷氨酸轉(zhuǎn)化為 α -酮戊二酸；檢測反應(yīng)體系中α -酮戊二酸的含量；色譜柱：HILIC色譜柱4. 6*250*5 ;流 動相：PH3. 3-3. 5的質(zhì)量濃度為3%磷酸二氫：水=1:3 ;流速：1. Oml/min ;柱溫：30°C;波長： 205。
[0008] 步驟四、α -酮戊二酸的分離純化 將反應(yīng)體系中轉(zhuǎn)化出的α-酮戊二酸進行分離純化即生產(chǎn)出α-酮戊二酸，具體操 作方法為：反應(yīng)結(jié)束后，將反應(yīng)液12000rpm離心lOmin ;取上清液，在上清液中加入其質(zhì)量 0. 5%的活性炭，攪拌脫色30分鐘，收集濾液進行減壓濃縮，加入上清液質(zhì)量2. 5%的晶種，緩 慢攪拌冷卻至室溫結(jié)晶4小時以上，抽濾收集晶體；抽濾得到的晶體，40°C真空干燥，得到 α-酮戊二酸。
[0009] 有益效果是： 1、本發(fā)明提供的酶法生產(chǎn)α-酮戊二酸的方法，初始原料為L-谷氨酸，價格便宜。反 應(yīng)結(jié)束后，生成的氨、水、氧氣易于除去，對產(chǎn)品的分離純化沒有干擾，水相體系中只剩下 α-酮戊二酸，易于分離，有助于提高產(chǎn)品純度和收率，降低分離成本。本發(fā)明的通過谷氨酸 消旋酶將廉價原料L-谷氨酸轉(zhuǎn)化為D-谷氨酸，利用高活性的D-氨基酸氧化酶將D-谷氨 酸轉(zhuǎn)化為α -酮戊二酸，避免了 L-谷氨酸氧化酶活性過低導(dǎo)致的轉(zhuǎn)化反應(yīng)慢的缺陷。
[0010] 2、本發(fā)明提供的酶法生產(chǎn)α -酮戊二酸的方法，所需的谷氨酸消旋酶和D-氨基酸 氧化酶均可通過構(gòu)建大腸桿菌基因工程菌，然后通過發(fā)酵大量制備，相對易得和廉價。所述 反應(yīng)為"一鍋煮"式，底物和所有酶同時加入開始反應(yīng)，直接得到終產(chǎn)物α -酮戊二酸，中間 無需分離提純。工藝成本低，轉(zhuǎn)化率和產(chǎn)物濃度高，轉(zhuǎn)化率達到84%以上，并且沒有副產(chǎn)物 影響，該工藝方法適合工業(yè)應(yīng)用。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0011] 圖1是本發(fā)明酶法生產(chǎn)α -酮戊二酸的方法的反應(yīng)原理圖。

【具體實施方式】
[0012] 一種酶法生產(chǎn)α -酮戊二酸的方法，以L-谷氨酸為底物，經(jīng)谷氨酸消旋酶催化， 將L-谷氨酸轉(zhuǎn)化為DL-谷氨酸混旋物；混旋物中的D-谷氨酸與反應(yīng)體系中的氧氣和水 在D-氨基酸氧化酶催化下生成α -酮戊二酸、氨和過氧化氫；隨著D-谷氨酸的被消耗， L-谷氨酸在消旋酶的作用下持續(xù)生成DL-谷氨酸，直至全部轉(zhuǎn)化為D-谷氨酸，并最終形成 α -酮戊二酸；反應(yīng)過程中生成的α-酮戊二酸在過氧化氫存在下易發(fā)生脫羧反應(yīng)生成丁 二酸，因此，反應(yīng)體系需加入過氧化氫酶，以便將反應(yīng)生成的過氧化氫水解成水和氧氣，避 免α-酮戊二酸被氧化。
[0013] 一種酶法生產(chǎn)α-酮戊二酸的方法，其具體生產(chǎn)方法的步驟為： 步驟一、同時表達谷氨酸消旋酶和D-氨基酸氧化酶的基因工程菌的構(gòu)建 (1)、表達載體pET24a-glr的構(gòu)建 a、根據(jù)GenBank: AB003685. 1所述的來自于枯草芽孢桿菌IFO 3336編碼谷氨酸消旋 酶的Wr基因序列，兩端分別加上酶切位點和及?HI，起始密碼子由TTG改為ATG，全 基因合成，其具體序列如SEQ ID NO :1，即： CATat^gaacaaccaataggagtcattgattccggggttggcggtttaaccgttgcgaaggaaatcatgaga cagctacctaaagaaaatattatctacgtcggggatacgaaacggtgtccttatggtccgcgccctgaagaagaggt gcttcaatatacgtgggagctgacgaattatttactcgaaaaccaccacatcaaaatgctcgtgatcgcctgtaata cagcaacagcgatcgctttggatgacatccagcgcagcgtcggcataccggtggtcggagtcatccagcctggtgcg agagcagcgataaaagtgacggataatcagcatatcggtgtcatcggcacagagaatacgattaagagcaatgcata cgaagaagcgcttttggcattaaaccctgatttgaaggttgaaaaccttgcctgcccgctgcttgtgccttttgtgg aaagcgggaagtttctcgacaaaacagcagacgagattgttaaaacctcgctgtatccgttaaaagacacatcaatt gattcgctgattttaggctgcacccattaccctattttaaaagaagccattcaaagatatatgggagagcacgtaaa cattatttcgtccggcgatgaaacagcccgggaagtcagcacaattctctcttataaagggctgctgaaccagtctc cgattgccccggatcatcagttcctgacaacaggggcgcgtgatcagtttgcaaaaatcgcagacgattggtttggc catgaagtcgggcatgtggaatgtatctcactgcaagaaccgattaaaagatagGGATCC b、 將合成的基因用#也1和feMlI雙酶切，純化備用； c、 抽提大腸桿菌表達載體pET24a，用#也1和AaMlI雙酶切，與上步純化的基因片 段連接，轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5 α感受態(tài)細胞； d、 挑取陽性轉(zhuǎn)化子并測序鑒定后，抽提質(zhì)粒獲得^/r表達載體pET24a-glr ; (2) 、表達載pET24a-daao的構(gòu)建 a、 根據(jù)全球公共數(shù)據(jù)庫GenBank，登錄號AB003685. 1所述記載來自于變異三角酵母 CBS4095菌株中編碼D-氨基酸氧化酶的基因 ?如序列，兩端分別加上酶切位點Ndel和 BamHI，全基因合成，其具體序列如 SEQ ID NO :2,即 CATatggctaaaatcgttgttattggtgccggt gttgccggtttaactacagctcttcaacttcttcgtaaaggacatgaggttacaattgtgtccgagtttacgcccgg tgatcttagtatcggatatacctcgccttgggcaggtgccaactggctcacattttacgatggaggcaagttagccg actacgatgccgtctcttatcctatcttgcgagagctggctcgaagcagccccgaggctggaattcgactcatcagc caacgctcccatgttctcaagcgtgatcttcctaaactggaagttgccatgtcggccatctgtcaacgcaatccctg gttcaaaaacacagtcgattctttcgagattatcgaggacaggtccaggattgtccacgatgatgtggcttatctag tcgaatttcgttccgtttgtatccacaccggagtctacttgaactggctgatgtcccaatgcttatcgctcggcgcc acggtggttaaacgtcgagtgaaccatatcaaggatgccaatttactacactcctcaggatcacgccccgacgtgat tgtcaactgtagtggtctctttgcccggttcttgggaggcgtcgaggacaagaagatgtaccctattcgaggacaag tcgtccttgttcgaaactctcttccttttatggcctccttttccagcactcctgaaaaagaaaatgaagacgaagct ctatatatcatgacccgattcgatggtacttctatcattggcggttgtttccaacccaacaactggtcatccgaacc cgatccttctctcacccatcgaatcctgtctagagccctcgaccgattcccggaactgaccaaagatggccctcttg acattgtgcgcgaatgcgttggccaccgtcctggtagagagggcggtccccgagtagaattagagaagatccccggc gttggctttgttgtccataactatggtgccgccggtgctggttaccaatcctcttacggcatggctgatgaagctgt ttcttacgtcgaaagagctcttactcgtccaaacctttagGGATCC b、 將合成的?/aao基因用Mfcl和feMlI雙酶切，純化備用； c、 抽提大腸桿菌表達載體pET24a，用和漢3?HI雙酶切，與上步純化的ifeao片段連 接，轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5 α感受態(tài)細胞； d、 挑取陽性轉(zhuǎn)化子并測序鑒定后，抽提質(zhì)粒獲得t/aao表達載體pET24a_daao ; (3) 、同時表達谷氨酸消旋酶和D-氨基酸氧化酶的基因工程菌的構(gòu)建 a、將構(gòu)建好的表達載體pET24a- daao,用Bglll和Hindlll雙酶切，回收包含了 T7啟 動子、核糖體結(jié)合位點和daao基因編碼序列的片段，純化備用； b、 構(gòu)建好的表達載體pET24a-glr，用BamHI和Hindlll雙酶切，純化，利用Bglll和 BamHI同尾酶的特性與上述a中所準備好的基因片段連接，得到連接后基因片段，備用； c、 將上述連接后基因片段轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5 α感受態(tài)細胞，挑取陽性轉(zhuǎn)化子并測序鑒 定；抽提質(zhì)粒獲得glr和daao雙表達載體pET24a-glr_daao ; d、 將雙表達載體pET24a-glr-daao轉(zhuǎn)入大腸桿菌BL21 (DE3)菌株中，獲得可以誘導(dǎo)同 時表達谷氨酸消旋酶和D-氨基酸氧化酶的基因工程菌； 步驟三、D-氨基酸氧化酶的D-氨基酸氧化酶基因工程菌的培養(yǎng) 將上述步驟一所制備的同時表達谷氨酸消旋酶和D-氨基酸氧化酶的基因工程菌進行 培養(yǎng)，培養(yǎng)的過程中加入異丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷，最后收集菌體，得到同時表達 谷氨酸消旋酶和D-氨基酸氧化酶的基因工程菌，備用；所述同時表達谷氨酸消旋酶和D-氨 基酸氧化酶的基因工程菌培養(yǎng)方法為： (1) 、步驟一所述同時表達谷氨酸消旋酶和D-氨基酸氧化酶的基因工程菌單菌落接種 到LB液體培養(yǎng)基中，置于37°C過夜培養(yǎng)，得到基因工程菌種子培養(yǎng)液； (2) 、將所培養(yǎng)的基因工程菌種子培養(yǎng)液分別接種到TB培養(yǎng)基中，接種量為TB培養(yǎng)基 體積的2% ;然后置于37°C培養(yǎng)5小時左右，加入異丙基-β -D-硫代吡喃半乳糖苷至終濃度 0. 2mmol/L，降溫至25°C繼續(xù)培養(yǎng)20小時左右，培養(yǎng)結(jié)束，離心收集同時表達谷氨酸消旋酶 和D-氨基酸氧化酶的基因工程菌。
[0014] 步驟四、以L-谷氨酸為原料，轉(zhuǎn)化生產(chǎn)α-酮戊二酸 在發(fā)酵罐中加入同時表達谷氨酸消旋酶和D-氨基酸氧化酶的基因工程菌濕菌體至水 中，濕菌體的質(zhì)量為水質(zhì)量的3-5%，然后加入L-谷氨酸至終濃度90-100g/L，再加入過氧 化氫酶至濃度為100萬-400萬單位/升，最后用氫氧化鈉調(diào)pH至7. 5-8. 2,即制備出轉(zhuǎn)化 體系；水浴保持反應(yīng)體系在30-40°C，通氣攪拌反應(yīng)，即將反應(yīng)體系中的L-谷氨酸轉(zhuǎn)化為 α -酮戊二酸；檢測反應(yīng)體系中α -酮戊二酸的含量；色譜柱：HILIC色譜柱4. 6*250*5 ;流 動相：PH3. 3-3. 5的質(zhì)量濃度為3%磷酸二氫：水=1:3 ;流速：1. Oml/min ;柱溫：30°C;波長： 205。
[0015] 步驟五、α-酮戊二酸的分離純化 將反應(yīng)體系中轉(zhuǎn)化出的α-酮戊二酸進行分離純化即生產(chǎn)出α-酮戊二酸，具體操 作方法為：反應(yīng)結(jié)束后，將反應(yīng)液12000rpm離心lOmin ;取上清液，在上清液中加入其質(zhì)量 0. 5%的活性炭，攪拌脫色30分鐘，收集濾液進行減壓濃縮，加入上清液質(zhì)量2. 5%的晶種，緩 慢攪拌冷卻至室溫結(jié)晶4小時以上，抽濾收集晶體；抽濾得到的晶體，40°C真空干燥，得到 α-酮戊二酸。
[0016] 所述的LB液體培養(yǎng)基的組成成份：按重量百分比LB液體培養(yǎng)基中含有1%的胰蛋 白胨、0. 5%的酵母提取物、3%的氯化鈉，余量為水。
[0017] 所述ΤΒ培養(yǎng)基的組成成份：蛋白胨12g/L，酵母粉24g/L，甘油4g/L，磷酸二氫鉀 17mmol/L，憐酸氧二鐘 72mmol/L。
[0018] 以下實施例中的試劑均為常用試劑，可從市場購買得到，所述的過氧化氫酶購買 自生工生物（上海）股份有限公司。
[0019] 實施例1 步驟一、同時表達谷氨酸消旋酶和D-氨基酸氧化酶的基因工程菌的構(gòu)建 (1) 、表達載體pET24a-glr的構(gòu)建 a、 根據(jù)全球公共數(shù)據(jù)庫GenBank，登錄號AB003685. 1所述記載來自于枯草芽孢桿菌 IFO 3336編碼谷氨酸消旋酶的Wr基因序列，兩端分別加上酶切位點和及?HI，起始 密碼子由TTG改為ATG后，進行全基因合成，合成的Wr基因具體序列如SEQ ID NO :1 ; b、 將合成的Wr基因用Mfcl和feMlI雙酶切，純化備用； c、 抽提大腸桿菌表達載體pET24a，用和漢3?HI雙酶切，與上步純化的Wr基因片 段連接，轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5 α感受態(tài)細胞； d、 挑取陽性轉(zhuǎn)化子并測序鑒定后，抽提質(zhì)粒獲得^/r表達載體pET24a-glr ; (2) 、表達載體pET24a_daao的構(gòu)建 a、 根據(jù)全球公共數(shù)據(jù)庫GenBank，登錄號AB003685. 1所述記載來自于變異三角酵母 CBS4095菌株中編碼D-氨基酸氧化酶的基因 ifeao序列，兩端分別加上酶切位點Ndel和 BamHI后，進行全基因合成，合成的ifeao基因具體序列如SEQ ID NO :2 ; b、 將合成的i/aao基因用Mfcl和feMlI雙酶切，純化備用； c、 抽提大腸桿菌表達載體pET24a，用和漢3?HI雙酶切，與上步純化的ifeao片段連 接，轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5 α感受態(tài)細胞； d、 挑取陽性轉(zhuǎn)化子并測序鑒定后，抽提質(zhì)粒獲得t/aao表達載體pET24a_daao ; (3) 、同時表達谷氨酸消旋酶和D-氨基酸氧化酶的基因工程菌的構(gòu)建 a、 將構(gòu)建好的表達載體pET24a- daao,用Bglll和Hindlll雙酶切，回收包含了 T7啟 動子、核糖體結(jié)合位點和daao基因編碼序列的片段，純化備用； b、 構(gòu)建好的表達載體pET24a-glr，用BamHI和Hindlll雙酶切，純化，利用Bglll和 BamHI同尾酶的特性與上述a中所準備好的基因片段連接，得到連接后基因片段，備用； c、 將上述連接后基因片段轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5 α感受態(tài)細胞，挑取陽性轉(zhuǎn)化子并測序鑒 定；抽提質(zhì)粒獲得glr和daao雙表達載體pET24a-glr_daao ; d、 將雙表達載體pET24a-glr-daao轉(zhuǎn)入大腸桿菌BL21 (DE3)菌株中，獲得可以誘導(dǎo)同 時表達谷氨酸消旋酶和D-氨基酸氧化酶的基因工程菌； 步驟二、D-氨基酸氧化酶的D-氨基酸氧化酶基因工程菌的培養(yǎng) 將上述步驟一所制備的同時表達谷氨酸消旋酶和D-氨基酸氧化酶的基因工程菌進行 培養(yǎng)，培養(yǎng)的過程中加入異丙基-β -D-硫代吡喃半乳糖苷，最后收集菌體，得到同時表達 谷氨酸消旋酶和D-氨基酸氧化酶的基因工程菌，備用； 步驟三、以L-谷氨酸為原料，轉(zhuǎn)化生產(chǎn)α-酮戊二酸 在發(fā)酵罐中加入同時表達谷氨酸消旋酶和D-氨基酸氧化酶的基因工程菌濕菌體至水 中，濕菌體的質(zhì)量為水質(zhì)量的4%，然后加入L-谷氨酸至終濃度95g/L，再加入過氧化氫酶至 濃度為150萬單位/升，最后用氫氧化鈉調(diào)pH至8. 0,即制備出轉(zhuǎn)化體系；水浴保持反應(yīng)體 系在35°C，通氣攪拌反應(yīng)，即將反應(yīng)體系中的L-谷氨酸轉(zhuǎn)化為α -酮戊二酸；利用高效液 相色譜檢測反應(yīng)體系中α -酮戊二酸含量為84. 5g/L，轉(zhuǎn)化率達到84. 5% ; 步驟四、α-酮戊二酸的分離純化 將反應(yīng)體系中轉(zhuǎn)化出的α-酮戊二酸進行分離純化即生產(chǎn)出α-酮戊二酸。最后得到 產(chǎn)品純度為99%，純化收率80%。
[0020] 實施例2 步驟一、同時表達谷氨酸消旋酶和D-氨基酸氧化酶的基因工程菌的構(gòu)建 (1) 、表達載體pET24a-glr的構(gòu)建 a、 根據(jù)全球公共數(shù)據(jù)庫GenBank，登錄號AB003685. 1所述記載來自于枯草芽孢桿菌 IFO 3336編碼谷氨酸消旋酶的Wr基因序列，兩端分別加上酶切位點和及?HI，起始 密碼子由TTG改為ATG后，進行全基因合成，合成的Wr基因具體序列如SEQ ID NO :1 ; b、 將合成的Wr基因用Mfcl和feMlI雙酶切，純化備用； c、 抽提大腸桿菌表達載體pET24a，用和漢3?HI雙酶切，與上步純化的Wr基因片 段連接，轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5 α感受態(tài)細胞； d、 挑取陽性轉(zhuǎn)化子并測序鑒定后，抽提質(zhì)粒獲得^/r表達載體pET24a-glr ; (2) 、表達載體pET24a_daao的構(gòu)建 a、 根據(jù)全球公共數(shù)據(jù)庫GenBank，登錄號AB003685. 1所述記載來自于變異三角酵母 CBS4095菌株中編碼D-氨基酸氧化酶的基因 ifeao序列，兩端分別加上酶切位點Ndel和 BamHI后，進行全基因合成，合成的ifeao基因具體序列如SEQ ID NO :2 ; b、 將合成的i/aao基因用Mfcl和feMlI雙酶切，純化備用； c、 抽提大腸桿菌表達載體pET24a，用和漢3?HI雙酶切，與上步純化的ifeao片段連 接，轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5 α感受態(tài)細胞； d、 挑取陽性轉(zhuǎn)化子并測序鑒定后，抽提質(zhì)粒獲得t/aao表達載體pET24a_daao ; (3) 、同時表達谷氨酸消旋酶和D-氨基酸氧化酶的基因工程菌的構(gòu)建 a、 將構(gòu)建好的表達載體pET24a- daao,用Bglll和Hindlll雙酶切，回收包含了 T7啟 動子、核糖體結(jié)合位點和daao基因編碼序列的片段，純化備用； b、 構(gòu)建好的表達載體pET24a-glr，用BamHI和Hindlll雙酶切，純化，利用Bglll和 BamHI同尾酶的特性與上述a中所準備好的基因片段連接，得到連接后基因片段，備用； c、 將上述連接后基因片段轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5 α感受態(tài)細胞，挑取陽性轉(zhuǎn)化子并測序鑒 定；抽提質(zhì)粒獲得glr和daao雙表達載體pET24a-glr_daao ; d、 將雙表達載體pET24a-glr-daao轉(zhuǎn)入大腸桿菌BL21 (DE3)菌株中，獲得可以誘導(dǎo)同 時表達谷氨酸消旋酶和D-氨基酸氧化酶的基因工程菌； 步驟二、D-氨基酸氧化酶的D-氨基酸氧化酶基因工程菌的培養(yǎng) 將上述步驟一所制備的同時表達谷氨酸消旋酶和D-氨基酸氧化酶的基因工程菌進行 培養(yǎng)，培養(yǎng)的過程中加入異丙基-β -D-硫代吡喃半乳糖苷，最后收集菌體，得到同時表達 谷氨酸消旋酶和D-氨基酸氧化酶的基因工程菌，備用； 步驟三、以L-谷氨酸為原料，轉(zhuǎn)化生產(chǎn)α-酮戊二酸 在發(fā)酵罐中加入同時表達谷氨酸消旋酶和D-氨基酸氧化酶的基因工程菌濕菌體至水 中，濕菌體的質(zhì)量為水質(zhì)量的3%，然后加入L-谷氨酸至終濃度90g/L，再加入過氧化氫酶至 濃度為400萬單位/升，最后用氫氧化鈉調(diào)pH至7. 5,即制備出轉(zhuǎn)化體系；水浴保持反應(yīng)體 系在30°C，通氣攪拌反應(yīng)，即將反應(yīng)體系中的L-谷氨酸轉(zhuǎn)化為α -酮戊二酸；利用高效液 相色譜檢測反應(yīng)體系中α -酮戊二酸含量為128. 5g/L，轉(zhuǎn)化率達到85. 6%。
[0021] 步驟四、α-酮戊二酸的分離純化 將反應(yīng)體系中轉(zhuǎn)化出的α-酮戊二酸進行分離純化即生產(chǎn)出α-酮戊二酸；最后得到 產(chǎn)品純度為98%，純化收率72%。
[0022] 實施例3 步驟一、同時表達谷氨酸消旋酶和D-氨基酸氧化酶的基因工程菌的構(gòu)建 (1) 、表達載體pET24a-glr的構(gòu)建 a、 根據(jù)全球公共數(shù)據(jù)庫GenBank，登錄號AB003685. 1所述記載來自于枯草芽孢桿菌 IF0 3336編碼谷氨酸消旋酶的Wr基因序列，兩端分別加上酶切位點和及?HI，起始 密碼子由TTG改為ATG后，進行全基因合成，合成的Wr基因具體序列如SEQ ID N0 :1 ; b、 將合成的Wr基因用Mfcl和feMlI雙酶切，純化備用； c、 抽提大腸桿菌表達載體pET24a，用和漢3?HI雙酶切，與上步純化的Wr基因片 段連接，轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5 α感受態(tài)細胞； d、 挑取陽性轉(zhuǎn)化子并測序鑒定后，抽提質(zhì)粒獲得^/r表達載體pET24a-glr ; (2) 、表達載體pET24a_daao的構(gòu)建 a、 根據(jù)全球公共數(shù)據(jù)庫GenBank，登錄號AB003685. 1所述記載來自于變異三角酵母 CBS4095菌株中編碼D-氨基酸氧化酶的基因 ifeao序列，兩端分別加上酶切位點Ndel和 BamHI后，進行全基因合成，合成的ifeao基因具體序列如SEQ ID N0 :2 ; b、 將合成的i/aao基因用Mfcl和feMlI雙酶切，純化備用； c、 抽提大腸桿菌表達載體pET24a，用和漢3?HI雙酶切，與上步純化的ifeao片段連 接，轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5 α感受態(tài)細胞； d、 挑取陽性轉(zhuǎn)化子并測序鑒定后，抽提質(zhì)粒獲得t/aao表達載體pET24a_daao ; (3) 、同時表達谷氨酸消旋酶和D-氨基酸氧化酶的基因工程菌的構(gòu)建 a、 將構(gòu)建好的表達載體pET24a- daao,用Bglll和Hindlll雙酶切，回收包含了 T7啟 動子、核糖體結(jié)合位點和daao基因編碼序列的片段，純化備用； b、 構(gòu)建好的表達載體pET24a-glr，用BamHI和Hindlll雙酶切，純化，利用Bglll和 BamHI同尾酶的特性與上述a中所準備好的基因片段連接，得到連接后基因片段，備用； c、 將上述連接后基因片段轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5 α感受態(tài)細胞，挑取陽性轉(zhuǎn)化子并測序鑒 定；抽提質(zhì)粒獲得glr和daao雙表達載體pET24a-glr_daao ; d、 將雙表達載體pET24a-glr-daao轉(zhuǎn)入大腸桿菌BL21 (DE3)菌株中，獲得可以誘導(dǎo)同 時表達谷氨酸消旋酶和D-氨基酸氧化酶的基因工程菌； 步驟二、D-氨基酸氧化酶的D-氨基酸氧化酶基因工程菌的培養(yǎng) 將上述步驟一所制備的同時表達谷氨酸消旋酶和D-氨基酸氧化酶的基因工程菌進行 培養(yǎng)，培養(yǎng)的過程中加入異丙基-β -D-硫代吡喃半乳糖苷，最后收集菌體，得到同時表達 谷氨酸消旋酶和D-氨基酸氧化酶的基因工程菌，備用； 步驟三、以L-谷氨酸為原料，轉(zhuǎn)化生產(chǎn)α-酮戊二酸 在發(fā)酵罐中加入同時表達谷氨酸消旋酶和D-氨基酸氧化酶的基因工程菌濕菌體至水 中，濕菌體的質(zhì)量為水質(zhì)量的5%，然后加入L-谷氨酸至終濃度100g/L，再加入過氧化氫酶 至濃度為100萬單位/升，最后用氫氧化鈉調(diào)pH至8. 2,即制備出轉(zhuǎn)化體系；水浴保持反應(yīng) 體系在40°C，通氣攪拌反應(yīng)，即將反應(yīng)體系中的L-谷氨酸轉(zhuǎn)化為α -酮戊二酸；利用高效 液相色譜檢測反應(yīng)體系中α -酮戊二酸含量為85. 2g/L，轉(zhuǎn)化率達到85. 5% ; 步驟四、α-酮戊二酸的分離純化 將反應(yīng)體系中轉(zhuǎn)化出的α-酮戊二酸進行分離純化即生產(chǎn)出α-酮戊二酸；最后得到 產(chǎn)品純度為98%，純化收率75%。
[0023] 本發(fā)明所用的大腸桿菌BL21 (DE3)菌株為常用菌種，可通過市場購買得到。
[0024] 本發(fā)明提供的酶法生產(chǎn)α-酮戊二酸的方法，所述谷氨酸消旋酶選自，但不限于： 地衣芽孢桿菌（Bacillus licheniformis)來源的谷氨酸消旋酶、短小芽孢桿菌（Bacillus pumilus)來源的谷氨酸消旋酶、枯草芽孢桿菌（Bacillus subtil is)來源的谷氨酸消旋酶、 大腸桿菌（Escherichia coli)來源的谷氨酸消旋酶、乳酸菌（Lactobacillus)來源的谷氨 酸消旋酶、溶血葡萄球菌（Staphylococcus haemolyticus)來源的谷氨酸消旋酶、結(jié)核分枝 桿菌（Mycobacterium tuberculosis)來源的谷氨酸消旋酶。
[0025] 所述D-氨基酸氧化酶選自，但不限于：變異三角酵母（Trigonopsis variabilis) 來源的D-氨基酸氧化酶、輪枝菌（Verticillium luteoalbum)來源的D-氨基酸氧化酶、 尖孢鐮刀菌（Fusarium oxysporum)來源的D-氨基酸氧化酶、近平滑假絲酵母菌（Candida parapsilosis)來源的D-氨基酸氧化酶、紅冬孢酵母（Rhodotorula gracilis)來源的 D_氨基酸氧化酶或豬腎來源的D-氨基酸氧化酶。
[0026] 所述過氧化氫酶為宿主大腸桿菌自身的過氧化氫酶或額外添加市售工業(yè)級的過 氧化氫酶。
【權(quán)利要求】
1. 一種酶法生產(chǎn)α-酮戊二酸的方法，其特征在于：其生產(chǎn)方法包括以下步驟： 步驟一、同時表達谷氨酸消旋酶和D-氨基酸氧化酶的基因工程菌的構(gòu)建 (1) 、表達載體pET24a-glr的構(gòu)建 a、 根據(jù)全球公共數(shù)據(jù)庫GenBank，登錄號AB003685. 1所述記載來自于枯草芽孢桿菌 IFO 3336編碼谷氨酸消旋酶的Wr基因序列，兩端分別加上酶切位點和及?HI，起始 密碼子由TTG改為ATG后，進行全基因合成，合成的Wr基因具體序列如SEQ ID NO :1 ; b、 將合成的Wr基因用Mfcl和feMlI雙酶切，純化備用； c、 抽提大腸桿菌表達載體pET24a，用和漢3?HI雙酶切，與上步純化的Wr基因片 段連接，轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5 α感受態(tài)細胞； d、 挑取陽性轉(zhuǎn)化子并測序鑒定后，抽提質(zhì)粒獲得^/r表達載體pET24a-glr ; (2) 、表達載體pET24a_daao的構(gòu)建 a、 根據(jù)全球公共數(shù)據(jù)庫GenBank，登錄號AB003685. 1所述記載來自于變異三角酵母 CBS4095菌株中編碼D-氨基酸氧化酶的基因 ifeao序列，兩端分別加上酶切位點Ndel和 BamHI后，進行全基因合成，合成的ifeao基因具體序列如SEQ ID NO :2 ; b、 將合成的i/aao基因用Mfcl和feMlI雙酶切，純化備用； c、 抽提大腸桿菌表達載體pET24a，用和漢3?HI雙酶切，與上步純化的ifeao片段連 接，轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5 α感受態(tài)細胞； d、 挑取陽性轉(zhuǎn)化子并測序鑒定后，抽提質(zhì)粒獲得t/aao表達載體pET24a_daao ; (3) 、同時表達谷氨酸消旋酶和D-氨基酸氧化酶的基因工程菌的構(gòu)建 a、 將構(gòu)建好的表達載體pET24a- daao,用Bglll和Hindlll雙酶切，回收包含了 T7啟 動子、核糖體結(jié)合位點和daao基因編碼序列的片段，純化備用； b、 構(gòu)建好的表達載體pET24a-glr，用BamHI和Hindlll雙酶切，純化，利用Bglll和 BamHI同尾酶的特性與上述a中所準備好的基因片段連接，得到連接后基因片段，備用； c、 將上述連接后基因片段轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5 α感受態(tài)細胞，挑取陽性轉(zhuǎn)化子并測序鑒 定；抽提質(zhì)粒獲得glr和daao雙表達載體pET24a-glr_daao ; d、 將雙表達載體pET24a-glr-daao轉(zhuǎn)入大腸桿菌BL21 (DE3)菌株中，獲得可以誘導(dǎo)同 時表達谷氨酸消旋酶和D-氨基酸氧化酶的基因工程菌； 步驟二、基因工程菌的培養(yǎng) 將上述步驟一所制備的同時表達谷氨酸消旋酶和D-氨基酸氧化酶的基因工程菌進行 培養(yǎng)，培養(yǎng)的過程中加入異丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷，最后收集菌體，得到同時表達 谷氨酸消旋酶和D-氨基酸氧化酶的基因工程菌，備用； 步驟三、以L-谷氨酸為原料，轉(zhuǎn)化生產(chǎn)α-酮戊二酸 在發(fā)酵罐中加入同時表達谷氨酸消旋酶和D-氨基酸氧化酶的基因工程菌濕菌體至水 中，濕菌體的質(zhì)量為水質(zhì)量的3-5%，然后加入L-谷氨酸至終濃度90-100g/L，再加入過氧 化氫酶至濃度為100萬-400萬單位/升，最后用氫氧化鈉調(diào)pH至7. 5-8. 2,即制備出反應(yīng) 體系；水浴保持反應(yīng)體系在30-40°C，通氣攪拌反應(yīng)，即將反應(yīng)體系中的L-谷氨酸轉(zhuǎn)化為 α -酮戊二酸；檢測反應(yīng)體系中α -酮戊二酸的含量； 步驟四、α-酮戊二酸的分離純化 將反應(yīng)體系中轉(zhuǎn)化出的α-酮戊二酸進行分離純化即生產(chǎn)出α-酮戊二酸。
2. 如權(quán)利要求1所述的酶法生產(chǎn)α-酮戊二酸的方法，其特征在于：所述同時表達谷 氨酸消旋酶和D-氨基酸氧化酶的基因工程菌培養(yǎng)方法為： (1) 、步驟一所述同時表達谷氨酸消旋酶和D-氨基酸氧化酶的基因工程菌單菌落接種 到LB液體培養(yǎng)基中，置于37°C過夜培養(yǎng)，得到基因工程菌種子培養(yǎng)液； (2) 、將所培養(yǎng)的基因工程菌種子培養(yǎng)液分別接種到TB培養(yǎng)基中，接種量為TB培養(yǎng)基 體積的2% ;然后置于37°C培養(yǎng)5小時左右，加入異丙基-β -D-硫代吡喃半乳糖苷至終濃度 0. 2mmol/L，降溫至25°C繼續(xù)培養(yǎng)20小時左右，培養(yǎng)結(jié)束，離心收集同時表達谷氨酸消旋酶 和D-氨基酸氧化酶的基因工程菌。
3. 如權(quán)利要求1所述的酶法生產(chǎn)α-酮戊二酸的方法，其特征在于：反應(yīng)體系中α-酮 戊二酸含量利用高效液相色譜進行檢測。
4. 如權(quán)利要求3所述的酶法生產(chǎn)α -酮戊二酸的方法，其特征在于：α -酮戊二酸的高 效液相色譜檢測條件為：色譜柱：HILIC色譜柱4. 6*250*5 ;流動相：ΡΗ3. 3?3. 5的質(zhì)量濃 度為3%磷酸二氫：水=1:3 ;流速：1. Oml/min ;柱溫：30°C ;波長：205。
5. 如權(quán)利要求1所述的酶法生產(chǎn)α -酮戊二酸的方法，其特征在于：α -酮戊二酸的具 體分離純化方法為：反應(yīng)結(jié)束后，將反應(yīng)液12000rpm離心lOmin ;取上清液，在上清液中加 入其質(zhì)量〇. 5%的活性炭，攪拌脫色30分鐘，收集濾液進行減壓濃縮，加入上清液質(zhì)量2. 5% 的晶種，緩慢攪拌冷卻至室溫結(jié)晶4小時以上，抽濾收集晶體；抽濾得到的晶體，40°C真空 干燥，得到α-酮戊二酸。
【文檔編號】C12N15/70GK104152498SQ201410372262
【公開日】2014年11月19日 申請日期:2014年7月31日 優(yōu)先權(quán)日:2014年7月31日
【發(fā)明者】范文超, 丁鵬, 化春光 申請人:洛陽華榮生物技術(shù)有限公司