基于谷氨酰胺合成酶的工程菌及其實現方法
【專利摘要】一種基因工程【技術領域】的基于谷氨酰胺合成酶的工程菌及其實現方法，以灰略紅鏈霉菌基因組DNA為模板，與含有酶切位點的引物進行PCR擴增得到谷氨酰胺合成酶編碼基因；然后將該基因插入大腸桿菌表達載體pET‐22b(+)中得到含有谷氨酰胺合成酶編碼基因的重組表達載體；再將重組表達載體導入大腸桿菌表達菌株，篩選得到谷氨酰胺合成酶的工程菌。本發明針對現有技術存在的由于谷氨酰胺合成酶在生物體內多為胞內酶且表達量較低導致的應用范圍和效果嚴重受限等不足，應用基因工程手段實現其體外的大量表達合成。
【專利說明】基于谷氨酰胺合成酶的工程菌及其實現方法

【技術領域】
[0001] 本發明涉及的是一種生物基因工程【技術領域】的基因及其工程菌株，具體是一種灰 略紅鏈霉菌的基于谷氨酰胺合成酶的工程菌及其實現方法。

【背景技術】
[0002] 氮是植物生長發育過程中最重要的營養元素之一。目前，維持或提高作物產量的 主要方法是大量施肥，然而氮肥的大量施用，不僅增加了農民的生產成本，而且會加劇水體 的富營養化及溫室氣體的排放。
[0003] 對作物而言，能夠吸收同化N〇r、NH4+及氨態N等不同氮素形態，但是一般以 Ν0Γ為主要氮源。植物以Ν0Γ為氮源時，氮同化可以分為3個階段：（1)氮的無機同化 (Ν0Γ - N02 - NH4+) ; (2)氨的同化，即NH4+經過谷氨酰胺合成酶（GS)合成谷氨酰胺，再由谷 氨酰胺經谷氨酸合酶（G0GAT)合成谷氨酸；（3)氨的有機同化，即由谷氨酰胺和谷氨酸合成 其它氨基酸，進而合成蛋白質和其他物質。由此可見，谷氨酰胺合成酶在氮同化通路中起著 十分關鍵的作用。
[0004] 生物體對氮元素的同化是十分重要的生理過程，無機氮必須同化為谷氨酰胺形式 的有機氮才能被生物體吸收利用。谷氨酰胺合成酶（glutamine synthetase, GS)是氮同化 途徑的關鍵酶，它與谷氨酸合成酶共同作用，催化NH4+同化成谷氨酰胺，谷氨酰胺又在谷氨 酸合酶的催化下，將其酰胺轉移到α -酮戊二酸上，從而生成兩分子谷氨酸。谷氨酰胺在生 物體含氮有機物的生物合成中作為氮供體，而外界無機氮也必須通過這個途徑才能進入生 物體內的氮循環。因此谷氨酰胺合成酶在生物體氮同化過程中起到十分重要的作用。
[0005] 土壤中含有十分豐富的細菌群體。細菌谷氨酰胺合成酶涵蓋目前發現的三大類谷 氨酰胺合成酶GS I、GS II和GS III，且相比植物谷氨酰胺合成酶基因具有種類多、易克隆等 優勢。灰略紅鏈霉菌（Streptomyces griseorubens)是一種常見的土壤細菌，其谷氨酰胺 合成酶基因的克隆及功能鑒定對于鑒定氮高效基因并應用于逆境條件下土壤理化性質的 改善具有重要意義。


【發明內容】

[0006] 本發明針對現有技術存在的不足，提出一種基于谷氨酰胺合成酶的工程菌及其實 現方法，通過本發明所述的方法能夠高效表達一種克隆自灰略紅鏈霉菌谷氨酰胺合成酶， 可以克服谷氨酰胺合成酶在原始菌株內表達量較低等缺點，有助于解決肥料利用率較低等 問題，此外對于實現土壤中銨鹽的快速轉化進而培肥土壤，最終實現精準農業具有重大意 義。
[0007] 本發明是通過以下技術方案實現的：
[0008] 本發明涉及一種谷氨酰胺合成酶的工程菌，該工程菌為外源表達谷氨酰胺合成酶 的大腸桿菌。
[0009] 所述的胞內谷氨酰胺合成酶具體為灰略紅鏈霉菌（Streptomyces griseorubens) JSD - 1谷氨酰胺合成酶大亞基基因 SG - GE，其核苷酸序列如SEQ ID No. 1所示，其氨基酸 序列如SEQ ID No. 2所示；核苷酸序列為1377bp，編碼453個氨基酸。
[0010] 所述的谷氨酰胺合成酶編碼基因通過全基因組測序和PCR擴增的方式克隆獲得。
[0011] 所述的灰略紅鏈霉菌（Streptomyces griseorubens) JSD - 1，現保藏于中國普通 微生物菌種保藏管理中心（CGMCC)，保藏編號為CGMCC No. 5706,保藏日期為2012年1月9 日，保藏地址：北京市朝陽區北辰西路1號院3號中國科學院微生物研究所郵編100101。
[0012] 本發明涉及上述工程菌的實現方法，以灰略紅鏈霉菌基因組DNA為模板，與含有 酶切位點的引物進行PCR擴增得到谷氨酰胺合成酶編碼基因；然后將該基因插入大腸桿菌 表達載體PET - 22b (+)中得到含有谷氨酰胺合成酶編碼基因的重組表達載體；再將重組表 達載體導入大腸桿菌表達菌株，篩選得到谷氨酰胺合成酶的工程菌。
[0013] 所述的含有酶切位點的引物包括：
[0014] GE - Msc I - F:GATGGCCATGGGGAAGCGGAAGATGGACAAGCAGC
[0015] GE _ EcoR I _ R:GGAATTCTCAATGATGATGATGATGATGCAGCACCGGCAGCAGGTTC
[0016] 所述的PCR擴增的條件為：98°C預變性3min ;98°C變性10s，55°C退火15s，68°C延 伸2min ;30個循環后68°C終延伸5min。
[0017] 所述的大腸桿菌表達菌株為Transetta(DE3)大腸桿菌。
[0018] 本發明涉及一種谷氨酰胺合成酶的工程菌的應用，將其應用于谷氨酰胺合成酶的 體外高效表達，并最終實現谷氨酰胺的工業發酵生產。 技術效果
[0019] 現有谷氨酰胺合成酶在灰略紅鏈霉菌內為胞內酶且表達量很低，因此嚴重限制了 其使用范圍和效果；與現有技術相比，本發明提供了一種全新的谷氨酰胺合成酶基因序列； 在特殊條件下（如高溫以及堿性）具有更穩定的生物學活性；本發明通過構建外源表達載 體，實現了谷氨酰胺合成酶的體外過表達，并通過在表達重組蛋白C端添加聚組氨酸標簽 的方法，維持蛋白活性的同時也最大程度的保證了蛋白純度。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0020] 圖1為基于KEGG的灰略紅鏈霉菌硝酸鹽代謝通路預測圖；
[0021] 圖2為不同濃度硝酸鹽培養下谷氨酰胺酶合成酶表達量變化圖；
[0022] 圖3為灰略紅鏈霉菌谷氨酰胺合成酶信號肽預測圖；
[0023] 圖4為灰略紅鏈霉菌谷氨酰胺合成酶氨基酸序列對比圖；
[0024] 圖5為灰略紅鏈霉菌谷氨酰胺合成酶3D結構模型預測圖。

【具體實施方式】
[0025] 下面對本發明的實施例作詳細說明，本實施例在以本發明技術方案為前提下進行 實施，給出了詳細的實施方式和具體的操作過程，但本發明的保護范圍不限于下述的實施 例。 實施例1
[0026] 本實施例包括以下步驟：
[0027] 1)灰略紅鏈霉菌的分離及培養
[0028] 灰略紅鏈霉菌分離自上海市浦江鎮收集的腐爛秸桿，保藏編號為CGMCC No. 5706。 將該菌種接種于LB液體培養基，32 °C培養48h。
[0029] 上述LB液體培養基組分為：蛋白胨10. Og/L，酵母提取物5. Og/L，NaCllO. Og/L， pH6. 8 - 7. 2。在液體培養基中加入15. 0 - 20. 0g/L瓊脂即得LB固體培養基。
[0030] 2)基因組DNA提取
[0031] 收集2. OmL菌液，12000rpm離心2min。棄上清，收集菌體沉淀，加入180 μ L溶菌酶 (20mg/mL)和20μLEDTA溶液（0·5M，pH8·0)，37°C處理45min，加入4μLRNaseA(100mg/ mL)，震蕩混勻15s，室溫放置5min，隨后按照細菌DNA提取試劑盒（TIANGEN)操作說明完成 剩余操作，得到高純度基因組DNA。通過0. 8%瓊脂糖凝膠電泳確定基因組DNA質量，確保 無明顯RNA條帶，基因組條帶清洗、完整、無降解、無污染。
[0032] 3)基因組測序
[0033] 確定全基因組鳥槍法（WGS)策略，采用第二代測序技術，構建不同插入片段長度 的文庫，采用Illumina Miseq(2X250bp)平臺進行測序。收集測序的原始數據，對帶接頭、 低質量的數據進行過濾，隨后采用Newbler v2. 8對去除接頭的測序數據進行從頭拼接，構 建contig及scaffold,最后使用GapCloser程序進行缺口填補得到鏈霉菌基因組草圖。
[0034] 4)蛋白編碼基因功能預測
[0035] 采用Glimmerf. 0軟件對全基因組序列進行基因預測。基因預測模型選取自我訓 練基因預測模型，即提取拼裝序列中最長的序列，以該序列作為基因預測模型訓練的序列。 然后以該序列構建的基因預測模型，對所有序列進行基因預測，設定開放閱讀框的長度為 ll〇bp，其余參數為Glimmer3. 0的默認設置。
[0036] 基于 KEGG 的硝酸鹽代謝通路圖：KEGG (Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes)，是基因組破譯方面的數據庫。KEGG注釋的主要目的包括兩個：K0(KEGG Ortholog)注釋，即將分子網絡的相關信息進行跨物種注釋；KEGG Pathway注釋，即代謝通 路注釋，獲得物種內分子間相互作用和反應的網絡。
[0037] 蛋白編碼基因的K0及Pathway注釋主要采用KEGG的KAAS自動化注釋系統完 成，其中基因集選擇"For Prokaryote"，基因 K0的傳遞規則選取bi - directional best hit (BBH)。K0注釋完成后，將K0映射到相應的KEGG Pathway通路上，得到灰略紅鏈霉菌內 硝酸鹽代謝通路（圖1)。
[0038] 5)總RNA的提取
[0039] 將鏈霉菌接種于以KN03S唯一碳源的無機鹽培養基，32°C、150rpm條件下培養 72h。每ia取樣，離心收集菌體沉淀，并按細菌總RNA提取試劑盒要求（TIANGEN)提取高 純度的鏈霉菌總RNA。
[0040] 上述無機鹽培養基組分為：葡萄糖 20g/L，ΚΗ2Ρ041· 0g/L，NaClO. 5g/L，MgS040. 25g/ L，CaCl2 · 2H200. lg/L，FeS04 · 7H200. Olg/L 及 KN03(10mM, 30mM, 50mM，lOOmM)。
[0041] 6)谷氨酰胺合成酶表達水平測定
[0042] 根據谷氨酰胺合成酶基因序列，通過DNAMAN6.0軟件設計特異性PCR引物，引物序 列如下：
[0043] GE - F:GCTGAGCCTGATGGAACGCA
[0044] GE - R:GCCTCCCACTCCTGCTTCT
[0045] 同樣的，根據16S rRNA的特異性序列設計引物，并作為內參基因，引物序列如下：
[0046] 16S rRNA - F:CGTATTCACCGCAGCAATGC
[0047] 16S rRNA - R:GCGAGGTGGAGCGAATCTCA
[0048] 以鏈霉菌總RNA模板進行反轉錄獲得cDNA文庫，并按照熒光定量PCR試劑盒 (TaKaRa)要求進行相關操作。設置三個重復，待實驗完成收集處理數據，分析在不同濃度 ΚΝ03作用下，谷氨酰胺合成酶的表達量（如圖2)。結果表明，在以硝酸鹽為唯一碳源的培 養基中，谷氨酰胺合成酶的表達量顯著上調，證明該基因參與硝酸鹽的代謝過程。
[0049] 上述熒光定量PCR反應條件為：95°C預變性30s ;95°C變性10s，60°C退火30s， 72°C延伸15s，共40個循環。
[0050] 7)序列檢測：
[0051] 谷氨酰胺合成酶膜定位預測：采用SignalP4. 1分別對谷氨酰胺合成酶進行信號 肽模擬預測，如圖3所示。結果表明谷氨酰胺合成酶不存在明顯的信號肽序列，推測該酶為 胞內酶。
[0052] 谷氨酰胺合成酶氨基酸序列對比圖：在NCBI數據庫中進行blastp搜索，獲取3條 與灰略紅鏈霉菌（Streptomyces griseorubens)JSD-l谷氨酰胺酶合成酶序列最為接近的 氨基酸序列，并通過ClustalX和BOXshade程序進行序列比對，結果如圖4所示。該谷氨酰 胺酶合成酶序列與已知的谷氨酰胺合成酶氨基酸序列具有較高的相似度，相似度最大可達 98%。
[0053] 硝酸鹽還原酶3D模型預測：運用PHYRE2在線程序對谷氨酰胺酶合成酶的3D空間 模型進行預測。結果表明谷氨酰胺酶合成酶與PDB數據庫中已有蛋白模型的最高相似度分 別可達35%，預測結果具有100%可信度。如圖5所示，谷氨酰胺合成酶的C端（已注明） 裸露在蛋白表達，因此將其設定為聚組氨酸標簽（His6 · Taq)的連接位點。 實施例2
[0054] 谷氨酰胺合成酶表達載體構建
[0055] 1)根據谷氨酰胺合成酶序列，設計含有酶切位點的引物，序列如下：
[0056] GE - Msc I - F:GATGGCCATGGGGAAGCGGAAGATGGACAAGCAGC
[0057] GE - EcoR I - R:GGAATTCTCAATGATGATGATGATGATGCAGCACCGGCAGCAGGTTC
[0058] 2)以灰略紅鏈霉菌（Streptomyces griseorubens)基因組DNA為模板，用含有Msc I和EcoR I酶切位點引物進行PCR擴增獲得谷氨酰胺合成酶基因序列，使用DNA A -Tailing Kit加 A后連接到T - Vector PMD?19 - T (TaKaRa)，并將連接產物轉入DH5 α大腸桿菌內。 在氨芐（50 μ g/mL)抗性平板上挑選陽性克隆，搖菌提取質粒測序。若無誤，Msc I和EcoR I進行雙酶切（37°C )，回收谷氨酰胺合成酶大亞基DNA片段GE。用相同內切酶酶切表達載 體pET - 22b (+)并回收載體DNA片段。將GE與載體片段混合，T4 DNA Ligase (TaKaRa)過 夜連接（16°C)，將連接產物轉入DH5a大腸桿菌感受態細胞內，通過抗性平板及菌落PCR 篩選含有質粒PET -22 -GE的陽性克隆。挑取陽性克隆接種于含有氨芐青霉素（50 μ g/mL) 的LB液體培養基中，180rpm、37°C培養16小時后提取質粒。
[0059] 上述PCR擴增條件為：98°C預變性3min ;98°C變性10s，68°C延伸lmin ;30個循環 后68°C終延伸5min。
[0060] 上述 PCR 反應使用的 DNA 聚合酶均為 PrimeSTAR? GXL Polymerase (TaKaRa)。
[0061] 3)谷氨酰胺合成酶過表達轉基因菌株的構建：將上述谷氨酰胺合成酶表達載體 pET - 22 - GE轉入Transetta (DE3)大腸桿菌，并在含有氨芐青霉素（50 μ g/mL)和氯霉素 (34 μ g/mL)的LB固體培養基上篩選，獲得谷氨酰胺合成酶過表達菌株。
[0062] 上述的Transetta (DE3)具有以下特征：該菌株具有氯霉素（Canf)，且含有大腸桿 菌缺乏的6種稀有密碼子（AGA，AGG，AGA，CUA，CCC，GGA)對應的tRNA，可有效提高外源基因， 尤其是真核生物及鏈霉菌等高GC含量生物基因在原核系統中的表達水平。
【權利要求】
1. 一種谷氨酰胺合成酶的工程菌，其特征在于，該工程菌為外源表達谷氨酰胺合成酶 的大腸桿菌； 所述的胞內谷氨酰胺合成酶具體為灰略紅鏈霉菌（Streptomyces griseorubens) JSD - 1谷氨酰胺合成酶大亞基基因 SG - GE，其核苷酸序列如SEQ ID No. 1所示，其氨基酸 序列如SEQ ID No. 2所示；核苷酸序列為1377bp，編碼453個氨基酸。
2. 根據權利要求1所述的工程菌，其特征是，所述的灰略紅鏈霉菌（Streptomyces griseorubens) JSD - 1，現保藏于中國普通微生物菌種保藏管理中心（CGMCC)，保藏編號為 CGMCC No. 5706,保藏日期為2012年1月9日。
3. -種根據權利要求1或2中所述的工程菌的實現方法，其特征在于，以灰略紅鏈霉 菌基因組DNA為模板，與含有酶切位點的引物進行PCR擴增得到谷氨酰胺合成酶編碼基因； 然后將該基因插入大腸桿菌表達載體PET -22b (+)中得到含有谷氨酰胺合成酶編碼基因的 重組表達載體；再將重組表達載體導入大腸桿菌表達菌株，篩選得到谷氨酰胺合成酶的工 程菌。
4. 根據權利要求3所述的方法，其特征是，所述的含有酶切位點的引物包括： GE - Msc I - F:GATGGCCATGGGGAAGCGGAAGATGGACAAGCAGC GE - EcoR I - R:GGAATTCTCAATGATGATGATGATGATGCAGCACCGGCAGCAGGTTC。
5. 根據權利要求3所述的方法，其特征是，所述的PCR擴增的條件為：98°C預變性 3min ;98°C變性 10s，55°C退火 15s，68°C延伸 2min ;30 個循環后 68°C終延伸 5min。
6. 根據權利要求3所述的方法，其特征是，所述的大腸桿菌表達菌株為 Transetta(DE3)大腸桿菌。
7. -種含有上述任一權利要求所述的谷氨酰胺合成酶的工程菌及其應用，其特征在 于，將其用于谷氨酰胺合成酶的體外高效表達，并最終實現谷氨酰胺的工業發酵生產。
【文檔編號】C12N1/21GK104140945SQ201410374683
【公開日】2014年11月12日 申請日期:2014年7月31日 優先權日:2014年7月31日
【發明者】周培, 馮海瑋, 孫玉靜, 毛亮, 支月娥, 唐冬, 衛星, 羅艷青 申請人:上海交通大學