密碼子優(yōu)化的谷氨酰胺合成酶序列CgglnA_Sy及其在大腸桿菌中的表達(dá)應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種密碼子優(yōu)化的CgglnA_Sy序列、合成該序列所需要的引物和該序列在大腸桿菌中的表達(dá)應(yīng)用。所述CgglnA_Sy序列如SEQIDNo1，引物序列如SEQIDNo2-37。通過將該序列構(gòu)建到大腸桿菌表達(dá)載體并轉(zhuǎn)化入大腸桿菌表達(dá)，可用于重組谷氨酰胺合成酶的生產(chǎn)。
【專利說明】密碼子優(yōu)化的谷氨酰胺合成酶序列CgglnA_Sy及其在大腸桿菌中的表達(dá)應(yīng)用

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬微生物【技術(shù)領(lǐng)域】，具體涉及一種按密碼子優(yōu)化的谷氨酸棒桿菌谷氨酰胺合成酶(CgglnA_Sy)基因序列合成方法及其在大腸桿菌中的表達(dá)，得到的重組谷氨酰胺合成酶可以用于催化生產(chǎn)谷氨酰胺。

【背景技術(shù)】
[0002]谷氨酰胺(glutamine，Gln)是生物體內(nèi)氮代謝中最重要的營養(yǎng)物質(zhì)，它不僅是蛋白質(zhì)的組成部分，而且是合成其它氨基酸、嘌呤、嘧啶、嘧啶輔酶和復(fù)雜碳水化合物的所必須的氨基供體。在人體內(nèi)，谷氨酰胺是含量最為豐富的非必需氨基酸，約占人體游離氨基酸總量的60%。近年來，越來越多的動物實(shí)驗(yàn)和臨床研究結(jié)果均證實(shí)，補(bǔ)充谷氨酰胺能夠改善機(jī)體代謝、氮平衡、促進(jìn)蛋白質(zhì)合成、增加淋巴細(xì)胞總數(shù)、改善機(jī)體免疫狀況、并能維持腸道功能。因此谷氨酰胺具有很高的藥用價值，可用于治療胃潰瘍和慢性胃炎、增進(jìn)腦神經(jīng)機(jī)能、恢復(fù)高強(qiáng)度勞動后的疲勞和治療免疫缺陷病等。目前，國內(nèi)外L-谷氨酰胺的市場年需求量已達(dá)5000噸，從今后的發(fā)展看，全球需求量將以較大幅度增長，所以，L-谷氨酰胺的市場前景非常好。
[0003]谷氨酰胺的生產(chǎn)方法主要有化學(xué)合成法、發(fā)酵法、酶促合成法。酶法是用谷氨酸和銨鹽作原料，經(jīng)谷氨酰胺合成酶(Glutamine Synthetase, GS)催化反應(yīng),直接生產(chǎn)L-谷氨酸胺。與其它兩種方法相比，酶促法具有反應(yīng)步驟簡單、副反應(yīng)少、易分離、容易實(shí)現(xiàn)自動化等諸多優(yōu)點(diǎn)。尤其Tochikura等提出將酵母發(fā)酵與純化酶結(jié)合生產(chǎn)谷氨酰胺的方法，解決了酶催化過程中的ATP再生的問題，大大降低了生產(chǎn)成本，酶法生產(chǎn)谷氨酰胺得到了人們的越來越多重視。利用大腸桿菌為宿主，獲得谷氨酰胺合成酶，可以用于谷氨酰胺的生產(chǎn)。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0004]本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題在于按照大腸桿菌的密碼子偏好對谷氨酸棒桿菌谷氨酰胺合成酶基因序列(CgglnA, GenBank Access1n N0.Y13221.1)進(jìn)行改造,并提供一組引物用于改造后基因CgglnA_Sy的合成。合成的序列可以在大腸桿菌中可溶性表達(dá)有功能的谷氨酰胺合成酶。
[0005]所述CgglnA_Sy基因序列如SEQ ID NO I所示,合成該序列所需的引物如SEQ IDNO 2?37所示。
[0006]本發(fā)明按照大腸桿菌的密碼子偏好對谷氨酸棒桿菌谷氨酰胺合成酶基因序列(CgglnA, GenBank Access1n N0.Y13221.1)進(jìn)行優(yōu)化，改造后的序列(CgglnA_Sy)與原序列同源性為86.05% (參見圖1)。設(shè)計了 37條引物，采用連續(xù)延伸PCR方法(熊愛生等，Asimple, rapid, high fidelity and cost-effective PCR—based two-step DNA synthesis(PTDS) method for long gene sequences，核酸研究，2004，32: e98)合成了 CgglnA—Sy 基因序列。該序列構(gòu)建到表達(dá)載體PYM4807載體并轉(zhuǎn)化大腸桿菌后，產(chǎn)生了可溶性的重組谷氨酰胺合成酶。經(jīng)測定，改酶的最適PH值為7.5，最適溫度為42°C，酶比活為250 U/mg。
[0007]有益效果:
本發(fā)明提供的引物通過兩步法合成按大腸桿菌偏愛密碼子優(yōu)化的CgglnA_Sy基因序列，通過該序列在大腸桿菌中高效可溶性表達(dá)，表達(dá)產(chǎn)物重組谷氨酰胺合成酶在酶法生產(chǎn)谷氨酰胺方面具有應(yīng)用潛力。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0008]圖1野生型CgglnA和密碼子優(yōu)化的CgglnA_Sy序列比對。
[0009]圖2 CgglnA_Sy序列的合成方法。
[0010]圖3 YN4182表達(dá)載體圖譜。
[0011]圖4為CgglnA_Sy基因在大腸桿菌中表達(dá)產(chǎn)物的SDS-PAGE檢測。
[0012]

【具體實(shí)施方式】
下面結(jié)合實(shí)施例進(jìn)一步描述本發(fā)明，但所述實(shí)施例僅用于說明本發(fā)明而不是限制本發(fā)明。
[0013]本發(fā)明實(shí)施中未注明的實(shí)驗(yàn)方法，如連接、轉(zhuǎn)化、相關(guān)培養(yǎng)基的配制等參照分子克隆實(shí)驗(yàn)指南第三版(黃培堂等譯，中國，科學(xué)出版社，2002)中方法進(jìn)行。pYM4807載體由實(shí)驗(yàn)室自行構(gòu)建保存(徐虎等，Characterizat1n of a Glucose-, Xylose-, Sucrose-,and D-Galactose -Stimulated b-Glucosidase from the Alkalophilic BacteriumBacillus, Curr Microb1l, 2011, 62:833-839);擴(kuò)增使用的 KOD FX taq 酶購自日本Toyobo公司；所需引物均由南京金斯瑞生物科技有限公司合成；其它未注明的化學(xué)藥品為分析純級，購自上海國藥集團(tuán)有限公司。
[0014]實(shí)施例1 CgglnA基因的優(yōu)化
本發(fā)明按照大腸桿菌的密碼子偏好對谷氨酸棒桿菌谷氨酰胺合成酶基因序列(CgglnA, GenBank Access1n N0.Y13221.1)進(jìn)行優(yōu)化，改造后的序列(CgglnA_Sy)如 SEQID NO I所示。通過DNAMAN軟件比對后發(fā)現(xiàn)，改造后的序列與原序列同源性為86.05% (參見圖1)。
[0015]實(shí)施例2
CgglnA_Sy基因的合成
為了便于表達(dá)載體的構(gòu)建，合成時分別在CgglnA_Sy基因序列兩側(cè)加入漢3?HI和SacI酶切位點(diǎn)。綜合考慮引物長度(primer length)、產(chǎn)物長度(product length)、序列Tm值(melting temperature)、AG 值(internal stability)、引物二聚體及發(fā)夾結(jié)構(gòu)(duplexformat1n and hairpin)、錯誤引發(fā)位點(diǎn)(false priming site)、引物及產(chǎn)物 GC 含量(composit1n)等影響PCR擴(kuò)增的因素,設(shè)計引物用于CgglnA_Sy基因的合成。為了克服了擴(kuò)增過程中遇到的條帶模糊、無條帶等問題， 申請人:不斷對引物進(jìn)行了調(diào)整和篩選，最終確立了 36條引物用于CgglnA_Sy基因的合成，引物編號分別為Pf P36，對應(yīng)的寡核苷酸序列分別如SEQ ID NO 2?37所示。PCR反應(yīng)體系為:0.3μΜ內(nèi)側(cè)引物(Ρ2_11，Ρ13-23，Ρ52_35)，0.3μΜ 外側(cè)引物(Pl，P12, P13, P24, P25, P36), IXPCR buffer，0.4 μΜ dNTPs, I U KODFX taq。擴(kuò)增條件為:94°C預(yù)熱 2min ；94°C,30 s，54°C，30 s，72°C，40 s，30 個循環(huán)；最后72°C延伸10 min。合成分為兩步進(jìn)行(圖2)，第一步，分別以P1、P12，P13、P24，P25、P36為兩側(cè)引物合成片段1、片段2、片段3 ;第二步，各取WL片段1、片段2、片段3為模板，用引物Pl、P36擴(kuò)增得到目的基因。
[0016]實(shí)施例3
CgglnA_Sy基因在大腸桿菌中的表達(dá)和純化
實(shí)例2中的得到的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)及聖奴和feeJ雙酶切后，以正確的閱讀框插入到大腸桿菌表達(dá)載體PYM4807，經(jīng)測序驗(yàn)證后得到含有CgglnA_Sy基因的重組質(zhì)粒，編號定義為YN4182。該質(zhì)粒轉(zhuǎn)入大腸桿菌表達(dá)宿主菌BL21(DE3)中，涂布于含有Ap (氨芐青霉素，100Pg/ml)的2YT固體培養(yǎng)基中，37 1:培養(yǎng)過夜至長出菌落。挑取新鮮轉(zhuǎn)化的的3_4個克隆，接入100 ml含有Ap (100 Pg/ml)抗生素的LB液體培養(yǎng)基中，用250ml搖瓶，37°C震搖培養(yǎng)至0D600值達(dá)到1.0。將搖瓶置于冰上5分鐘，5000g 4°C離心5分鐘收集菌體。重懸細(xì)胞于5ml預(yù)冷的破碎緩沖液(100 mM This-鹽酸緩沖液，0.5M NaCl, 0.5mg/ml溶菌酶，ImMPMSF, ImM MgC12)中。把混合菌體在冰水中用超聲破碎儀破碎。破碎好的菌液經(jīng)12000rpm，4°C離心30分鐘后，收集上清。用0.45 μ m的濾膜過濾后，濾液用N1-NTA柱進(jìn)行親和層析純化。
[0017]具體純化過程為:用1.5 mL平衡緩沖液(50 mM Tris-HCl, pH 7.5，300mM NaCl,and 10 mM imidazole)平衡N1-NTA柱5次；吸取1.5 mL濾液上樣，待完全流出N1-NTA柱后，1.5 mL 清洗緩沖液(50 mM Tris-HCl, pH 7.5，300mM NaCl, and 20 mM imidazole)清洗五遍；最后用 I mL 洗脫緩沖液(50 mM Tris-HCl, pH 7.5，300mM NaCl, and 250 mMimidazole)洗脫2次。含有目的蛋白的洗脫液置于透析液(50 mM Tris-HCl, pH 7.5，0.1mM EDTA, and 10% glycerol)透析12 h后，用于SDS-PAGE電泳和測定酶活。檢測結(jié)果表明表達(dá)產(chǎn)物的分子量約為56 kDa。
實(shí)施例4 酶活測定
谷氨酰胺合成酶酶活測定反應(yīng)液組分為:100 mM Tris-HCl (pH 7.5)，20 mM ATP, 10mM L-glutamate, 30 mM hydroxylamine, 20 mM MgCl20 190 Μ.1 反應(yīng)液 35。C 預(yù)熱分鐘后，加入10 μ?酶液開始反應(yīng)，反應(yīng)30 min后，加入200 μ?顯色液(55 g/L FeCl3.6H20,20 g/L三氯乙酸，2.1%濃鹽酸)終止反應(yīng)。測定在540nM的光吸收值。酶活定義為每分鐘釋放出I Mmol Y-谷氨酰羥肟酸所需要的酶量。
[0018]相關(guān)培養(yǎng)基的配制:
2YT固體培養(yǎng)基:胰化蛋白胨8g ;酵母提取物5g ；Nacl 2.5g ;瓊脂粉12g，定容至1L。
[0019]LB液體培養(yǎng)基:胰化蛋白胨5g ;酵母提取物1g ;Nacl 10g,定容至1L。
【權(quán)利要求】
1.密碼子優(yōu)化的CgglnA_Sy序列，其特征在于，采用連續(xù)延伸PCR方法合成，序列兩側(cè)包含及和feci酶切位點(diǎn)，其核苷酸序列如SEQ ID N0.1。
2.合成權(quán)利要求1所述的序列所需要的引物，其特征在于，其序列如SEQID No 2-370
3.包括權(quán)利要求1所述的序列的表達(dá)載體YN4182。
4.權(quán)利要求3所述載體在大腸桿菌表達(dá)及其表達(dá)產(chǎn)物的應(yīng)用。
【文檔編號】C12N15/52GK104372014SQ201410659366
【公開日】2015年2月25日 申請日期:2014年11月19日 優(yōu)先權(quán)日:2014年11月19日
【發(fā)明者】趙偉, 姚泉洪, 彭日荷 申請人:上海市農(nóng)業(yè)科學(xué)院