微衛星不穩定性多重檢測體系及試劑盒的制作方法【專利摘要】本發明涉及一種微衛星不穩定性多重檢測體系及試劑盒，本發明的檢測體系包括通用—特異嵌合引物對和通用引物的混合物。通用—特異嵌合引物對分別針對單核苷酸微衛星位點BAT-26、BAT-25、NR22、NR24及NR21；通用引物是Flu-UP，通用—特異嵌合引物對中的各個上游引物5’端設有Flu-UP的序列；所述通用引物Flu-UP為熒光標記引物。本發明的微衛星不穩定性多重檢測體系及其檢測試劑盒克服了不同引物需多種熒光標記的不足，在同一個PCR反應體系中檢測5個微衛星基因位點，結果直觀可靠，省時高效，節省成本，可有效的對MSI基因位點進行檢測分析。【專利說明】【
技術領域：
】[0001]本發明涉及一種多重檢測體系及其檢測產品，尤其是一種微衛星不穩定性多重檢測體系以及應用該體系的檢測產品，屬于生物【
技術領域：
】。微衛星不穩定性多重檢測體系及試劑盒【
背景技術：
】[0002]微衛星不穩定（MicrosatalliteInstability，MSI)指DNA甲基化或基因突變致錯配修復基因缺失，從而導致微衛星重復序列長度的改變，表現為同一微衛星位點在不同個體之間以及同一個體的正常組織與某些異常組織之間，微衛星位點的重復單位的數目不同，從而使其不能正常地發揮調控作用，導致細胞增殖及分化異常，促發惡性腫瘤形成。大量研究表明，MSI與結直腸癌、胃癌、子宮內膜癌等發生密切相關。[0003]MSI的檢測具有多重臨床病理意義。大約15%的結直腸癌中存在MSI現象，其中典型的遺傳性非息肉病性結直腸癌（hereditarynon-polyposiscolorectalcancer，HNPCC)患者90%以上為MSI瘤。與無MSI的結直腸癌相比，攜帶有MSI的結直腸癌其預后較好，并且二者藥物反應也不一樣。[0004]1997年美國國家腫瘤研究所（NationalCancerInstitute,NCI)舉辦會議頒布了Bethesda指導綱要，確定了用來檢測MSI的參考panel(NCIpanel)，推薦應用5個微衛星位點來進行結直腸癌的檢測，即單堿基重復序列BAT-25和BAT-26、雙堿基重復序列D2S123、D5S346和D17S250,并對MSI作出了定義。比較腫瘤和匹配的正常DNA，5個位點中有2個或2個以上位點有重復序列長度變化者為高度MSI(highfrequencyMSI，MSI-H)，若只有1個位點有長度變化者為低度MSKlowfrequencyMSI，MSI_L)，無任何位點的變化稱為微衛星穩定（microsatellitestable,MSS)。2002年NCI會議對其中3個雙堿基重復位點用來評估微衛星不穩定狀態的局限性提出爭議。同期SuraweeraN等人的研究指出對于MSI-H患者，5個準單態性單核苷酸重復位點的panel組（BAT-25、BAT-26、NR21、NR22及NR24)比其它微衛星標記更敏感。2007年RosaM.xicola等比較出5個準單態性單核苷酸重復位點的panel組（841'-26、841'-25、順21、順22及順24)比從：1推薦組在檢測1058例腫瘤組織微衛星狀態時具有更高的敏感性和陽性預測值。[0005]在2011年關于結直腸癌篩查的國際腫瘤綜合網（NationalComprehensivecancerNetwork,NCCN)指南中，MSI已成為首要檢測項目。①MSI檢測可用于HNPCC的篩查。超過90%的HNPCC患者腫瘤組織表現MSI，MSI在HNPCC中已經成為的重要標志物；當高度懷疑HNPCC時，需檢測MSI。②MSI-H的結直腸癌患者預后良好的標志物。MSI-H結腸癌患者生存期更長，較少復發，被認為是預后好的標志之一。③MSI檢測可用于氟尿嘧啶類藥物的輔助療效預測。[0006]現有技術的微衛星不穩定性一般可通過如下2種方法檢測：1)PCR法：選定特異的引物，以自身正常組織作對照，在體外對微衛星位點進行PCR擴增，擴增后的產物經聚丙烯酰胺凝膠電泳，經各種顯示系統(放射自顯影、銀染等）分析有無遷移率的改變。[0007]2)基因檢測，即對相關的DNA直接進行測序。但因進行基因檢測價格昂貴，所需試驗條件較高，在臨床應用尚未普及。[0008]PCR法已成為目前常用檢測方法并已被證明是最有效的初篩手段。但普通PCR分管檢測五個微衛星基因，產物做凝膠電泳的方法，存在操作繁瑣、成本高等諸多缺陷。多重PCR檢測微衛星基因，引物間的競爭與干擾因素較為復雜，擴增產物不容易錯開，會直接導致檢測結果的不確定性，因此，多重PCR檢測產品對于反應體系中引物序列的特異性和引物的濃度都有很高的要求。目前只有8個準單態性單核苷酸重復位點采用3種熒光標記物的多重擴增檢測的方案公布。例如：中國專利201110152226.X公開了一種腫瘤細胞微衛星不穩定狀態的復合擴增體系及檢測試劑盒，選取了8個準單態性單核苷酸重復位點(NR-21、NR-22、NR-24、NR-27、BAT-25、BAT-26、M0N0-27、CAT-25)對MSI進行PCR多重擴增檢測，為有效區分采用了3種熒光標記物，相當于三組三重PCR反應。而進行多種熒光標記造成實驗成本高昂，且只能在多通道的熒光定量PCR儀上進行檢測；加入性別決定位點對于防止實驗操作員混淆樣本方面的作用也是非常的有限，對于來自同性別之間的標本的區分完全沒有幫助卻增加了不必要的實驗花費。而多重PCR實驗的主要目的之一就是出于成本的考慮，只是通過增加花費不菲的熒光標記引物進行三重PCR反應，并不能發揮多重PCR實驗在成本上優勢。并且8個準單態性單核苷酸重復位點在預測微衛星不穩定狀態方面的優勢也尚無足夠的臨床數據支持。[0009]鑒于上述情況，提供一種改良的、便捷的、高靈敏度、低成本的MSI多重檢測產品勢在必行。【
發明內容】[0010]本發明要解決的技術問題是提供一種包括特定核苷酸序列的通用一特異嵌合引物及通用引物組合，可以有效地減弱引物間的競爭與干擾因素，使得擴增產物大小錯開，只依靠一種熒光標記即可保證檢測結果準確、靈敏度高的微衛星不穩定性多重檢測體系及試劑盒。[0011]本發明為解決上述技術問題提出的一種技術方案是：提供一種微衛星不穩定性多重檢測體系，包括通用一特異嵌合引物對和通用引物的混合物，所述通用一特異嵌合引物對分別針對微衛星位點BAT-26、BAT-25、NR22、NR24和NR21;所述通用一特異嵌合引物對中，針對所述BAT-26的上游引物核苷酸序列如SEQIDNo.1所示，針對所述BAT-26的下游引物核苷酸序列如SEQIDNo.2所示；針對所述BAT-25的上游引物核苷酸序列如SEQIDNo.3所示，針對所述BAT-25的下游引物核苷酸序列如SEQIDNo.4所示；針對所述NR22的上游引物核苷酸序列如SEQIDNo.5所示，針對所述NR22的下游引物核苷酸序列如SEQIDNo.6所示；針對所述NR24的上游引物核苷酸序列如SEQIDNo.7所示，針對所述NR24的下游引物核苷酸序列如SEQIDNo.8所示；針對所述NR21的上游引物核苷酸序列如SEQID此.9所示，針對所述順21的下游引物核苷酸序列如SEQIDNo.10所示；所述通用引物是Flu-UP，所述通用一特異嵌合引物對的各上游引物的5'端設有所述Flu-UP的核苷酸序列，所述Flu-UP為5'端熒光標記引物。[0012]上述技術方案的一種優選是：上述Flu-UP的終濃度是0.8μΜ?1.2μΜ;針對所述BAT-26、BAT-25、NR22、NR24和NR21的下游引物的終濃度與所述Flu-UP的終濃度的比值為1:3至1:2;針對所述BAT-26的上游引物的終濃度與所述Flu-UP的終濃度的比值為1:85至1:65;針對所述BAT-25的上游引物的終濃度與所述Flu-UP的終濃度的比值為1:140至1:110;針對所述NR22的上游引物的終濃度與所述Flu-UP的終濃度的比值為1:220至1:180;針對所述NR24的上游引物的終濃度與所述Flu-UP的終濃度的比值為1:30至1:20;針對所述NR21的上游引物的終濃度與所述Flu-UP的終濃度的比值為1:6至1:4。[0013]上述技術方案的一種進一步的優選是：反應體系為10μ1或20μ1，所述Flu-UP的終濃度是1μΜ;針對所述BAT-26、BAT-25、NR22、NR24和NR21的下游引物的終濃度是0.4μΜ;針對所述BAT-26的上游引物的終濃度是0.013μΜ;針對所述BAT-25的上游引物的終濃度是〇.008μΜ;針對所述NR22的上游引物的終濃度是0.005μΜ;針對所述NR24的上游引物的終濃度是〇.04μΜ;針對所述NR21的上游引物的終濃度是0.2μΜ。[0014]上述技術方案的一種進一步的優選是：上述通用引物Flu-UP的核苷酸序列如SEQIDNo.11所示。[0015]上述通用引物Flu-UP的熒光標記為Cy5、Cy3或FAM。[0016]上述微衛星不穩定性多重檢測體系還包括陰性對照液和陽性對照液。[0017]上述微衛星不穩定性多重檢測體系還包括PCR反應液，所述PCR反應液包括PCR緩沖液、2.5mM的dNTPs和5U/μ1的TaqDNA聚合酶；所PCR緩沖液包括lOOmM的Tris-HCl、500mM的KC1和15mM的MgCl2，用于配置所述PCR緩沖液的Tris-HCl緩沖液的pH值為8.3;所述2.5mM的dNTPs包括2.5mM的dATP、2.5mM的dGTP、2.5mM的dCTP和2.5mM的dTTP。上述陽性對照液是含所述BAT-26、BAT-25、NR22、NR24和NR21位點靶序列的質粒混合水溶液。[0018]上述陰性對照液是純水。[0019]本發明為解決上述技術問題提出的另一種技術方案是：一種采用上述多重檢測體系的微衛星不穩定性檢測試劑盒。[0020]本發明的積極效果在于：1)本發明的微衛星不穩定性多重檢測體系和試劑盒將通用引物熒光標記、多重PCR及毛細管電泳技術融合于一體，可以實現在一個PCR體系內采用單熒光標記一次檢測5個準單態性單核苷酸微衛星位點。本發明包括具有特定核苷酸序列的通用一特異嵌合引物及通用引物組合的多重擴增體系，引物的巧妙設計，既減弱了引物間的競爭與干擾因素，又使擴增產物片段大小錯開，從而使得單色熒光標記成為可能，克服了現有技術普通PCR只能在一個反應體系內檢測一個微衛星基因位點的繁瑣費時及成本問題，檢測結果準確、靈敏度1?，并且大大節省了成本，提1?了效率。[0021]2)本發明的微衛星不穩定性多重檢測體系和試劑盒的片段分析應用的毛細管電泳片段分析技術不同于傳統凝膠電泳分析模式，使PCR結果分析更直觀、簡潔、可靠，易于識別判斷，更有利于標準化操作。[0022]3)本發明的微衛星不穩定性多重檢測試劑盒結構簡單、操作便捷、使用條件模式化，便于大規模推廣應用。【專利附圖】【附圖說明】[0023]圖1是本發明的檢測試劑盒的多重PCR反應原理示意圖；圖2是實施例1的檢測試劑盒檢測樣本1的血樣的分型圖譜；圖3是實施例1的檢測試劑盒檢測樣本1的腫瘤組織DNA的分型圖譜；圖4是實施例1的檢測試劑盒檢測樣本1的血樣和腫瘤組織DNA疊加的分型圖譜；圖5是實施例1的檢測試劑盒檢測樣本2的血樣的分型圖譜；圖6是實施例1的檢測試劑盒檢測樣本2的腫瘤組織DNA的分型圖譜；圖7是實施例1的檢測試劑盒檢測樣本2的血樣和腫瘤組織DNA疊加的分型圖譜。【具體實施方式】[0024]下面通過實施例對本發明進行具體的描述，有必要在此指出的是以下實施例只用于對本發明進行進一步說明，不能理解為對本發明保護范圍的限制，該領域的技術人員可以根據上述本【
發明內容】對本發明作出一些非本質的改進和調整。文中未注明具體條件的實驗方法，通常按照常規條件如J.薩姆布魯克等編著的科學出版社2002年出版的《分子克隆實驗指南》一書中所述的條件，或按照制造商所建議的條件。除非另行定義，文中所使用的所有專業與科學用語與本領域技術人員所熟悉的意義相同。此外，任何與所記載內容相似或均等的方法及材料皆可應用于本發明中。[0025]實施例1一、試劑盒的組成。[0026]本實施例的微衛星不穩定性檢測試劑盒包括PCR反應液、引物混合液、熱啟動酶、陽性對照液和陰性對照液，PCR反應液、引物混合液、熱啟動酶、陽性對照液和陰性對照液分別置于不同的試管中，如表1所示。[0027]表1試劑盒組成表【權利要求】1.一種微衛星不穩定性多重檢測體系，包括通用一特異嵌合引物對和通用引物的混合物，其特征在于：所述通用一特異嵌合引物對分別針對微衛星位點BAT-26、BAT-25、NR22、NR24和NR21;所述通用一特異嵌合引物對中，針對所述BAT-26的上游引物核苷酸序列如SEQIDNo.1所示，針對所述BAT-26的下游引物核苷酸序列如SEQIDNo.2所示；針對所述BAT-25的上游引物核苷酸序列如SEQIDNo.3所示，針對所述BAT-25的下游引物核苷酸序列如SEQIDNo.4所示；針對所述NR22的上游引物核苷酸序列如SEQIDNo.5所示，針對所述NR22的下游引物核苷酸序列如SEQIDNo.6所示；針對所述NR24的上游引物核苷酸序列如SEQIDNo.7所示，針對所述NR24的下游引物核苷酸序列如SEQIDNo.8所示；針對所述NR21的上游引物核苷酸序列如SEQID此.9所示，針對所述順21的下游引物核苷酸序列如SEQIDNo.10所示；所述通用引物是Flu-UP，所述通用一特異嵌合引物對的各上游引物的5'端設有所述Flu-UP的核苷酸序列，所述Flu-UP為5'端熒光標記引物。2.根據權利要求1所述的微衛星不穩定性多重檢測體系，其特征在于：所述Flu-UP的終濃度是〇.8μΜ?1.2μΜ;針對所述BAT-26、BAT-25、NR22、NR24和NR21的下游引物的終濃度與所述Flu-UP的終濃度的比值為1:3至1:2;針對所述BAT-26的上游引物的終濃度與所述Flu-UP的終濃度的比值為1:85至1:65;針對所述BAT-25的上游引物的終濃度與所述Flu-UP的終濃度的比值為1:140至1:110;針對所述NR22的上游引物的終濃度與所述Flu-UP的終濃度的比值為1:220至1:180;針對所述NR24的上游引物的終濃度與所述Flu-UP的終濃度的比值為1:30至1:20;針對所述NR21的上游引物的終濃度與所述Flu-UP的終濃度的比值為1:6至1:4。3.根據權利要求2所述的微衛星不穩定性多重檢測體系，其特征在于：反應體系為10μ1或20μ1，所述Flu-UP的終濃度是1μΜ;針對所述BAT-26、BAT-25、NR22、NR24和NR21的下游引物的終濃度是0.4μΜ;針對所述BAT-26的上游引物的終濃度是0.013μΜ;針對所述BAT-25的上游引物的終濃度是0.008μΜ;針對所述NR22的上游引物的終濃度是0.005μΜ;針對所述NR24的上游引物的終濃度是0.04μΜ;針對所述NR21的上游引物的終濃度是〇.2μΜ。4.根據權利要求1至3之一所述的微衛星不穩定性多重檢測體系，其特征在于：所述通用引物Flu-UP的核苷酸序列如SEQIDNo.11所示。5.根據權利要求4所述的微衛星不穩定性多重檢測體系，其特征在于：所述通用引物Flu-UP的熒光標記為Cy5、Cy3或FAM。6.根據權利要求5所述的微衛星不穩定性多重檢測體系，其特征在于：還包括陰性對照液和陽性對照液。7.根據權利要求6所述的微衛星不穩定性多重檢測體系，其特征在于：還包括PCR反應液，所述PCR反應液包括PCR緩沖液、2.5mM的dNTPs和5U/μ1的TaqDNA聚合酶；所述PCR緩沖液包括lOOmM的Tris-HCl、500mM的KC1和15mM的MgCl2，用于配置所述PCR緩沖液的Tris-HCl緩沖液的pH值為8.3;所述2.5mM的dNTPs包括2.5mM的dATP、2.5mM的dGTP、2.5mM的dCTP和2.5mM的dTTP。8.根據權利要求6所述的微衛星不穩定性多重檢測體系，其特征在于：所述陽性對照液是含所述BAT-26、BAT-25、NR22、NR24和NR21位點靶序列的質粒混合水溶液。9.根據權利要求6所述的微衛星不穩定性多重檢測體系，其特征在于：所述陰性對照液是純水。10.-種采用如權利要求1所述的檢測體系的微衛星不穩定性檢測試劑盒。【文檔編號】C12Q1/68GK104087683SQ201410377852【公開日】2014年10月8日申請日期:2014年8月1日優先權日:2014年8月1日【發明者】趙新泰,王明,李璐申請人:上海賽安生物醫藥科技有限公司