用于人類(lèi)dermokine基因亞型mRNA表達(dá)量檢測(cè)的擴(kuò)增引物及其試劑盒的制作方法
【專(zhuān)利摘要】本發(fā)明公開(kāi)了一種用于人類(lèi)dermokine基因亞型mRNA表達(dá)量檢測(cè)的擴(kuò)增引物及其試劑盒。引物根據(jù)dermokine亞型mRNA的特異性性設(shè)計(jì)。試劑盒包括：10條8聯(lián)PCR反應(yīng)管，分別包被有2×10-3nmol針對(duì)dermokine-α、dermokine-β/γ、dermokine-γ和GAPDH的特異性引物；試劑A：5U/μLTaqDNA聚合酶，20μL；試劑B：2×PCR緩沖液組成，包含600nMROX，1×SYBR?GreenIdye，2mMdNTPs（包括dATP、dCTP、dGTP、dTTP）、80mMTris-HCl、80mMKCl、40mM(NH4)2SO4、6mMMgSO4。本發(fā)明所提供的整套試劑盒可對(duì)人類(lèi)dermokine不同亞型mRNA表達(dá)量進(jìn)行相對(duì)定量分析，檢測(cè)胰腺癌、大腸癌、皮膚鱗狀細(xì)胞癌等腫瘤的dermokine表達(dá)，為臨床診斷及治療提供依據(jù)。
【專(zhuān)利說(shuō)明】用于人類(lèi)dermokine基因亞型mRNA表達(dá)量檢測(cè)的擴(kuò)增引物 及其試劑盒

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及一種基于聚合酶鏈反應(yīng)（PCR)的分子生物學(xué)方法，尤其涉及一種用于 人類(lèi)dermokine基因亞型mRNA表達(dá)量檢測(cè)的擴(kuò)增引物及其試劑盒。

【背景技術(shù)】
[0002] Dermokine是最初在小鼠皮膚棘層中發(fā)現(xiàn)的一個(gè)特異性基因。近年來(lái)對(duì) dermokine基因的深入研究發(fā)現(xiàn)人類(lèi)的動(dòng)dermokine (sk89/30)基因在染色體19ql3. 12上， 位于SBSN和KDAP基因的兩側(cè)，由27個(gè)外顯子編碼，全長(zhǎng)約17kb。作為一種新型的角質(zhì)形 成細(xì)胞分泌的肽，dermokine與另外兩種角質(zhì)形成細(xì)胞分泌的肽SBSN和KDAP組成復(fù)層上 皮細(xì)胞基因分泌的復(fù)合體（SCC)。Dermokine基因有許多的亞型，除α、β亞型外，還包括 Y 1、Y 2, ε 1-3, ζ 1-6。Dermokine基因各種亞型的表達(dá)均有差異，其中α、β、Υ在復(fù)層 上皮細(xì)胞差異分化中高表達(dá)，而Υ、ξ在正常的上皮細(xì)胞中表達(dá)外還在EST中發(fā)現(xiàn)在癌基 因中有表達(dá)。Dermokine基因轉(zhuǎn)錄時(shí)進(jìn)行復(fù)雜的選擇性剪接，如α、β、 Υ編碼分泌性蛋白， ξ編碼細(xì)胞內(nèi)蛋白。這種差異性表達(dá)模式也表明其生物學(xué)效應(yīng)的不同。
[0003] Dermokine基因在多種腫瘤如胰腺癌，大腸癌，皮膚鱗狀細(xì)胞癌等的發(fā)生與發(fā)展有 著密切的關(guān)系。Tomoyuki等人的研究表明Dermokine-β / γ在結(jié)腸癌和結(jié)腸腺瘤當(dāng)中異常 高表達(dá)，KENJI等人的研究發(fā)現(xiàn)Dermokine- γ的mRNA在體外培養(yǎng)的六種胰腺癌細(xì)胞株中有 五種（PK-59，N0R-P1，PK-45H，PK-Iand KP4)中高表達(dá)，并且還在胰腺導(dǎo)管腺癌的癌組織和 導(dǎo)管內(nèi)乳頭狀黏液性腫瘤（IPMN)的樣本中異常高表達(dá)。更是將其與CEA、CA199等腫瘤標(biāo) 志物用酶聯(lián)免疫法聯(lián)合檢測(cè)作為胰腺癌的早期診斷指標(biāo)。另外，胰腺癌細(xì)胞株P(guān)anc-I和胰 腺癌耐藥細(xì)胞株比較，選取基因芯片研究發(fā)現(xiàn)Dermokine基因在耐藥細(xì)胞中表達(dá)增加，熒 光指數(shù)從4000,升高到27000。從而為dermokine基因與胰腺癌的發(fā)病機(jī)制的研究提供了 新的表達(dá)分型技術(shù)。實(shí)驗(yàn)操作中快速分離目的細(xì)胞并完成總RNA的提取，并于熒光PCR儀 器上進(jìn)行檢測(cè)。一次性完成對(duì)dermokine-α、β、Y的分型及相對(duì)定量，可以有效的縮短實(shí) 驗(yàn)時(shí)間、減少經(jīng)濟(jì)費(fèi)用，試劑和儀器可開(kāi)放使用。對(duì)人類(lèi)dermokine基因亞型的表達(dá)量水平 研究依賴(lài)快速、準(zhǔn)確、簡(jiǎn)單的篩選技術(shù)和定量檢測(cè)技術(shù)。熒光定量的聚合酶鏈反應(yīng)（Q-PCR) 技術(shù)可以定量檢測(cè)低拷貝的核酸片段，首先通過(guò)對(duì)提取的人總RNA進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄成cDNA，再 通過(guò)Q-PCR進(jìn)行相對(duì)定量的分析。
[0004] 檢測(cè)人dermokine基因亞型mRNA的表達(dá)水平，對(duì)胰腺癌、大腸癌，皮膚鱗狀細(xì)胞癌 等的發(fā)生與發(fā)展的監(jiān)測(cè)有重要意義。通過(guò)對(duì)提取組織總RNA并逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，然后設(shè)計(jì)特 定引物進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR擴(kuò)增。此建立的Q-PCR技術(shù)，靈敏度高，特異性強(qiáng)，能精確、 簡(jiǎn)便地對(duì)人dermokine基因亞型的表達(dá)水平進(jìn)行定量，從而有助于對(duì)胰腺癌和結(jié)直腸癌等 疾病的診斷、治療和發(fā)病機(jī)理進(jìn)行研究。
[0005] 目前，還未開(kāi)發(fā)出檢測(cè)全面、結(jié)果準(zhǔn)確的人類(lèi)dermokine基因亞型表達(dá)量水平檢 測(cè)的試劑盒，用于臨床診斷。本發(fā)明基于聚合酶鏈反應(yīng)（PCR)，特別是涉及熒光定量的聚合 酶鏈反應(yīng)（Q-PCR)，通過(guò)設(shè)計(jì)、篩選得到一套理想的對(duì)人dermokine基因各亞型編碼區(qū)進(jìn)行 擴(kuò)增的引物進(jìn)行Q-CR分析，達(dá)到全面檢測(cè)人類(lèi)dermokine亞型表達(dá)量的高低，解決目前各 型dermokine基因表達(dá)的相對(duì)定量技術(shù)。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0006] 本發(fā)明的目的是克服現(xiàn)有診斷技術(shù)中難以對(duì)人類(lèi)dermokine亞型進(jìn)行定量分 析，在一些癌癥（如胰腺癌、結(jié)直腸癌、皮膚鱗狀細(xì)胞癌）中分離到有利于早期診斷的 dermokine亞型，并分析各亞型在治療和耐藥形成的各型dermokine表達(dá)情況，用于評(píng)估耐 藥形成。并提供一種檢測(cè)人類(lèi)dermokine基因亞型相對(duì)表達(dá)量的技術(shù)。設(shè)計(jì)一套優(yōu)化引物 進(jìn)行Q-PCR分析，對(duì)dermokine亞型在癌癥細(xì)胞中的差異表達(dá)進(jìn)行相對(duì)定量的檢測(cè)。
[0007] 本發(fā)明第二個(gè)目的是提供一種配套人類(lèi)dermokine亞型α、β、Y定量檢測(cè)的 三對(duì)引物，此套引物進(jìn)行人dermokine基因表達(dá)量檢測(cè)的特定Q-PCR反應(yīng)程序，以達(dá)到對(duì) dermokine亞型表達(dá)更準(zhǔn)確的評(píng)估。
[0008] 本發(fā)明的第三個(gè)目的是提供一種對(duì)臨床標(biāo)本進(jìn)行人類(lèi)dermokine亞型相對(duì)定量 檢測(cè)的試劑盒。
[0009] 本發(fā)明的技術(shù)方案如下：
[0010] 用于人類(lèi)dermokine基因亞型mRNA表達(dá)量檢測(cè)的擴(kuò)增引物包括一對(duì)擴(kuò)增 dermokine α 的引物 SEQ ID NO. 1、SEQ ID NO. 2, 一對(duì)擴(kuò)增 dermokine^/γ 的引物 SEQ ID NO. 3、SEQ ID NO. 4, 一對(duì)擴(kuò)增 γ 的引物 SEQ ID NO. 5、SEQ ID NO. 6。
[0011] 用于檢測(cè)人dermokine基因3種亞型mRNA的表達(dá)水平的的試劑盒由下列試劑組 成：
[0012] 試劑 A :5U/ μ L Taq DNA 聚合酶，20 μ L ;
[0013] 試劑 B :2XPCR 緩沖液組成，包含 600nM R0X、1X SYBR? Green I dye、2mM dNTPs、 80mM Tris-HCl、80mM KCl、40mM(NH4)2S04、6mM MgSO4;
[0014] 包被引物的PCR反應(yīng)管：
[0015] 一號(hào)反應(yīng)管：含有針對(duì)dermokine-α的引物SEQ ID NO. 1、SEQ ID NO. 2,含量為 2Xl(T3nmol SEQ ID NO. 1 和 2Xl(T3nmol SEQ ID NO. 2 ;
[0016] 二號(hào)反應(yīng)管：含有針對(duì) dermokine^/γ 的引物 SEQ ID NO. 3、SEQ ID NO. 4,含量 為 2Xl(T3nmol SEQ ID N0.3 和 2Xl(T3nmol SEQ ID N0.4;
[0017] 三號(hào)反應(yīng)管：含有針對(duì)dermokine γ的引物SEQ ID NO. 5、SEQ ID NO. 6,含量為 2X l(T3nmol SEQ ID NO. 5 和 2X l(T3nmol SEQ ID NO. 6 ;
[0018] 四號(hào)反應(yīng)管：含有針對(duì)GAPDH的引物，含量為2Xl(T3nmol。
[0019] 本發(fā)明與現(xiàn)有技術(shù)相比具有的有益效果是：設(shè)計(jì)的引物特異性結(jié)合 dermokine-α、dermokine_i3/Y、dermokine_Y 的 mRNA 片段，通過(guò) PCR 技術(shù)能特異性區(qū)分 dermokine各型的表達(dá)量。通過(guò)試劑盒檢測(cè)人類(lèi)dermokine亞型表達(dá)量的高低，對(duì)腫瘤的早 期診斷與治療有重要作用。并可用于腫瘤形成，耐藥進(jìn)化的研究。此試劑盒可以有效的縮 短實(shí)驗(yàn)時(shí)間、減少經(jīng)濟(jì)費(fèi)用，試劑和儀器可開(kāi)放使用。通過(guò)優(yōu)化實(shí)驗(yàn)反應(yīng)體系和反應(yīng)條件， 組成檢測(cè)靈敏、方便的試劑盒，為腫瘤的早期診斷及治療效果評(píng)估提供可靠的檢測(cè)技術(shù)。

【專(zhuān)利附圖】

【附圖說(shuō)明】
[0020] 圖I dermokine陽(yáng)性擴(kuò)增曲線(xiàn)圖；
[0021] 從左到右分別為 dermokine-a、dermokine-β / Y 和 dermokine-Y 的結(jié)果；
[0022] 圖2 dermokine陰性擴(kuò)增曲線(xiàn)圖；
[0023] 從左到右分別為 dermokine-a、dermokine-β / Y 和 dermokine-Y 的結(jié)果；
[0024] 圖3 dermokine擴(kuò)增的溶接曲線(xiàn)圖；
[0025] 從左到右分別為 dermokine-a、dermokine-β / Y 和 dermokine-Y 的結(jié)果。

【具體實(shí)施方式】
[0026] 本發(fā)明的擴(kuò)增和測(cè)序引物核苷酸序列為：
[0027] SEQ ID NO. 1 5，-ccactgcctctgctctgc-3'
[0028] SEQ ID NO. 2 5，-gttgtaattgtagttctgatcggct-3，
[0029] SEQ ID NO. 3 5，-ggcacgagattggcagacag-3，
[0030] SEQ ID NO. 4 5，-ccagaagtttcccaagcacc-3，
[0031] SEQ ID NO. 5 5' -ccaaatcattgcgtagttcc-3'
[0032] SEQ ID NO. 6 5，-gggcttcattccctggctt-3，
[0033] 用于檢測(cè)人dermokine基因亞型mRNA的表達(dá)水平的擴(kuò)增引物包括一對(duì)擴(kuò)增 dermokine α 的引物 SEQ ID NO. 1、SEQ ID NO. 2, 一對(duì)擴(kuò)增 dermokine^/γ 的引物 SEQ ID NO. 3、SEQ ID NO. 4, 一對(duì)擴(kuò)增 γ 的引物 SEQ ID NO. 5、SEQ ID NO. 6。
[0034] 用于檢測(cè)人dermokine基因3種亞型mRNA的表達(dá)水平的的試劑盒由下列試劑組 成：
[0035] 試劑 A :5U/ μ L Taq DNA 聚合酶，20 μ L ;
[0036] 試劑 B :2XPCR 緩沖液組成，包含 600nM R0X、1X SYBR? Green I dye、2mM dNTPs、 80mM Tris-HCl、80mM KCl、40mM(NH4)2S04、6mM MgSO4;
[0037] 包被引物的PCR反應(yīng)管：
[0038] 一號(hào)反應(yīng)管：含有針對(duì)dermokine-α的引物SEQ ID NO. 1、SEQ ID NO. 2,含量為 2Xl(T3nmol SEQ ID NO. 1 和 2Xl(T3nmol SEQ ID NO. 2 ;
[0039] 二號(hào)反應(yīng)管：含有針對(duì) dermokine β / γ 的引物 SEQ ID NO. 3、SEQ ID NO. 4,含量 為 2Xl(T3nmol SEQ ID N0.3 和 2Xl(T3nmol SEQ ID N0.4;
[0040] 三號(hào)反應(yīng)管：含有針對(duì)dermokine γ的引物SEQ ID NO. 5、SEQ ID NO. 6,含量為 2X l(T3nmol SEQ ID NO. 5 和 2X l(T3nmol SEQ ID NO. 6 ;
[0041] 四號(hào)反應(yīng)管：含有針對(duì)GAPDH的引物，含量為2Xl(T3nmol。
[0042] 下述實(shí)施例中所用方法如無(wú)特別說(shuō)明均為常規(guī)方法。
[0043] 實(shí)施例1
[0044] ①取新鮮組織放于玻璃研磨器內(nèi)，先加0. 2ml的Trizol溶液，研磨組織后，倒入 I. 5mlEP管中，再在研磨器內(nèi)加入0. 8ml的Trizol溶液洗，后全部再倒入EP管中。顛倒混勻 10下，室溫靜置5分鐘；培養(yǎng)細(xì)胞總RNA提取可直接加入Iml的Trizol。②·每ImlTrizol 中加0. 2ml氯仿。蓋緊樣品管蓋，用手用力搖晃試管15秒，使其充分混勻，室溫靜置5分 鐘。后12000rmp離心15分鐘。③.將上層水相轉(zhuǎn)入新的I. 5mlEP管中（約400-500ul)， 加入0. 5ml異丙醇，混勻后放于-20°c中1小時(shí)，后12000rmp離心10分鐘。④.RNA的洗脫 小心倒掉上清，留取沉淀。加 Iml現(xiàn)配的75%的乙醇（預(yù)冷）振蕩洗滌RNA沉淀一次，后 7500rmp離心5分鐘。⑤.小心倒掉上清，取沉淀置超凈工作臺(tái)開(kāi)風(fēng)機(jī)吹干（約30分鐘，此 時(shí)RNA沉淀變透明）。注意不能讓RNA沉淀完全干燥（會(huì)極大地降低它地可溶性）。再在管 中加20ul的DEPC水溶解，在55-60°C下孵育10分鐘助溶。⑥.提取的RNA保存于-70°C 超低溫冰箱中，或立即用于逆轉(zhuǎn)錄。
[0045] 實(shí)施例2
[0046] -種配套此方法檢測(cè)目的mRNA的逆轉(zhuǎn)錄操作程序。ΙΟμΜ本系中含IyL mRNA(0. 5pg_l μ g), polyA逆轉(zhuǎn)錄引物1 μ L，逆轉(zhuǎn)錄酶試劑1 μ L和逆轉(zhuǎn)錄緩沖液2 μ L，加 水5 μ L(終濃度dNTP為ImM，引物為500nM，M-MuLV逆轉(zhuǎn)錄酶濃度為40U，Tris-HCl濃度 為50mM，KCl濃度為50mM，MgCl 2濃度為4mM)。逆轉(zhuǎn)錄程序?yàn)楸戏胖?min，30°C 30min， 95°C 5min。逆轉(zhuǎn)錄完成后，試管內(nèi)加入90 μ L水，進(jìn)行10倍的稀釋。
[0047] 實(shí)施例3
[0048] 通過(guò)常規(guī)方法對(duì)各PCR管的Ct值進(jìn)行分析，經(jīng)與GAPD內(nèi)對(duì)照進(jìn)行比較后得出結(jié) 果。
[0049] 實(shí)施例3
[0050] 用本發(fā)明試劑盒檢測(cè)dermokine基因表達(dá)量的Q-PCR方法，及操作過(guò)程和反應(yīng)程 序。每個(gè)項(xiàng)目需要進(jìn)行2個(gè)重復(fù)管的檢測(cè),每反應(yīng)管反應(yīng)系為20 μ L。首先,按實(shí)驗(yàn)的標(biāo)本 個(gè)數(shù)計(jì)算各試劑的需要量，實(shí)驗(yàn)步驟如下：
[0051] 1.擴(kuò)增反應(yīng)液配置：按順序配置反應(yīng)液（1個(gè)檢測(cè)標(biāo)本），首先取18 μ L稀釋后的 cDNA加入空白的管中，加90 μ L的試劑Β，加水70 μ L，加2 μ L試劑Α，共180 μ L ;混勻。
[0052] 2.各管按順序加入20 μ L的擴(kuò)增反應(yīng)液，蓋好蓋子。
[0053] 3.按實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)的PCR程序進(jìn)行擴(kuò)增：為95°C預(yù)變性3分鐘后，94°C變性5秒，61°C 退火延伸30秒，延伸期獲取熒光值，進(jìn)行40個(gè)循環(huán)，最后保存在25°C ;及時(shí)取出進(jìn)行測(cè)序。
[0054] 4.通過(guò)常規(guī)方法對(duì)各PCR管的Ct值進(jìn)行分析，經(jīng)與GAPD內(nèi)對(duì)照進(jìn)行比較后得出 結(jié)果。
[0055]

【權(quán)利要求】
1. 一種用于人類(lèi)dermokine基因亞型mRNA表達(dá)量檢測(cè)的擴(kuò)增引物，其特征在于包括一 對(duì)擴(kuò)增dermokineα的引物SEQIDN0·l、SEQIDN0·2，一對(duì)擴(kuò)增dermokineβ/γ的引 物SEQIDN(λ3、SEQIDN(λ4，一對(duì)擴(kuò)增γ的引物SEQIDN(λ5、SEQIDN0·6。
2. -種用于檢測(cè)人dermokine基因3種亞型mRNA的表達(dá)水平的的試劑盒，其特征在于 由下列試劑組成： 試劑 A :5U/ μ L Taq DNA 聚合酶，20 μ L ; 試劑 B:2XPCR 緩沖液組成，包含 600nM R0X、1XSYBR? Green I dye、2mM dNTPs、80mM Tris-HCl、80mM KCl、40mM (NH4)2S04、6mM MgS04; 包被引物的PCR反應(yīng)管： 一號(hào)反應(yīng)管：含有針對(duì)dermokine-α的引物SEQ ID NO. 1、SEQ ID NO. 2,含量為 2Xl(T3nmol SEQ ID NO. 1 和 2Xl(T3nmol SEQ ID NO. 2 ; 二號(hào)反應(yīng)管：含有針對(duì)dermokine β/γ的引物SEQ ID NO. 3、SEQ ID NO. 4,含量為 2X l(T3nmol SEQ ID NO. 3 和 2X l(T3nmol SEQ ID NO. 4 ; 三號(hào)反應(yīng)管：含有針對(duì)dermokine γ的引物SEQ ID NO. 5、SEQ ID NO. 6,含量為 2X l(T3nmol SEQ ID NO. 5 和 2X l(T3nmol SEQ ID NO. 6 ; 四號(hào)反應(yīng)管：含有針對(duì)GAPDH的引物，含量為2X10_3nmol。
【文檔編號(hào)】C12Q1/68GK104263722SQ201410383828
【公開(kāi)日】2015年1月7日 申請(qǐng)日期:2014年8月6日 優(yōu)先權(quán)日:2014年8月6日
【發(fā)明者】周蒙滔, 陳必成, 莊成樂(lè), 張行 申請(qǐng)人:溫州醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院