精子洗滌液及其制備方法
【專利摘要】本發明公開了一種精子洗滌液及其制備方法，解決精子清洗時維持精子的活力，降低精子的死亡率等技術問題。它是通過多種溶質溶于超純凈水中進行調配而成的清洗培養液，該溶質包括基礎液溶質、殺菌劑和原液溶質；該基礎液溶質包括氯化鈉、氯化鉀、碳酸氫鈉、4-羥乙基哌嗪乙磺酸、牛磺酸、非必需氨基酸和殺菌劑等；該原液溶質為人血清白蛋白。本發明包含有多種適合精子生存和生長的有機或無機成份，在精子清洗過程中，能維持精子原有活力，并有效地去除精液中的雜物，為試管嬰兒的培育或精子的冷凍貯藏提供了保證。
【專利說明】精子洗滌液及其制備方法

【技術領域】
[0001]本發明屬于人工輔助生殖【技術領域】，涉及一種用于精子清洗的化學劑，尤其是一種精子洗滌液及其制備方法。

【背景技術】
[0002]目前人類不孕率提高促使試管嬰兒技術的發展。在試管嬰兒技術中首先需采集良好的精子，精子的優劣決定試管嬰兒的成敗。在試管嬰兒技術中其精子來源主要有兩方面:直接采集人體精子，或從精子貯藏庫中提取。無論精子來源如何都必須使用清洗液對精子進行科學地洗滌，以收集活動能力較強、質量良好的精子，使精子獲得足夠的能量，同時除去精液中有害成份及死精子、炎細胞等。一方面保證冷凍貯藏的精液不變質、質量優良，另一方面在實施試管嬰兒時對精液進行洗滌處理和篩選，保證培育優越的嬰兒。
[0003]目前使用的清洗液(或洗滌液等)品種不統一，效果不明顯，且價格昂貴。有些洗滌液中調配的營養不全，在清洗過程中容易造成精子的死亡或清子獲能不足活力較低，如在精子活力實驗中，精子保持活力的比率較低(同樣的實驗過程、同批次精液，下同)，其比率接近或低于合格標準(保持活力率> 75% )。有些洗滌液的稠度較高，在精洗過程難以一次性將精液中的有害成份、死精子和炎細胞去除，造成冷凍貯藏的精液質量不能得到保證。
[0004]另外，一般精子洗滌液在使用前不能直觀地判斷有效性的好壞，如果在洗滌液變質后仍繼續使用將對實驗或臨床操作造成不可逆轉的結果。


【發明內容】

[0005]本發明主要是解決精子清洗時更好地維持精子的活力、降低精子的死亡率等技術問題，以便更好的冷凍冷藏或為輔助生殖技術提供有力保證，避免風險發生。進而提供一種各項指標均達到體外清洗培養液的標準、有利精子生存、使用安全且易于判斷該清洗培養液是否變質的精子洗滌液。
[0006]本發明的精子洗滌液，它是對多種溶質溶于超純凈水所配制的清洗培養液進行除菌而成；該多種溶質包括基礎液溶質、殺菌劑和原液溶質；該基礎液溶質包括氯化鈉、氯化鉀、硫酸鎂、磷酸二氫鉀、氯化鈣、碳酸氫鈉、4-羥乙基哌嗪乙磺酸、葡萄糖、丙酮酸鈉、乳酸鈉、丙氨酰谷氨酰胺、牛磺酸及非必需氨基酸；該原液溶質為人血清白蛋白；該殺菌劑為慶大霉素；該除菌是清洗培養液在超凈工作臺下利用0.2 μ m的濾膜進行過濾的過程。
[0007]進一步，該基礎液溶質在清洗培養液中的含量如下:氯化鈉92.815~102.585mmol/L,氣化鐘 4.465 ~4.935mmol/L,硫酸續 0.19 ~0.21 mmol /I,,葡萄糖 2.66 ~
2.94mmol/L,磷酸二氫鉀 0.3515 ~0.3885mmol/L,氯化鈣 1.9 ~2.lmmol/L,乳酸鈉12.18 ~13.48mmol/L、丙麗酸納 0.3135 ~0.3465mmol/L、碳酸氧納 3.8 ~4.2mmol/L、丙氨酰谷氨酰胺0.95~1.05mmol/L、牛磺酸0.095~0.105mmol/L、4_輕乙基哌嗪乙磺酸(HEPES) 19.95~22.05mmol/L及非必需氨基酸9.5~10.5ml/L ;該人血清白蛋白在清洗培養液中的含量為4.75~5.25g/L。
[0008]更進一步，該殺菌劑為慶大霉素，其在清洗培養液中的含量為9.5~10.5mg/L.
[0009]再進一步，該清洗培養液中還具有用以判斷該清洗培養液pH值的指示劑；該指示劑為酚紅，在清洗培養液中的含量為9.5~10.5mg/L。
[0010]進一步，該清洗培養液的pH值為7.20~7.40 ;該清洗培養液的滲透壓為260~290m0sm/Kg。
[0011]更進一步，該非必需氨基酸為L-丙氨酸、L-天冬酰胺、L-天冬氨酸、L-谷氨酸、甘氨酸、L-脯氨酸、L-絲氨酸中的一種或者幾種。
[0012]本發明的一種如上所述的清子洗滌液的制備方法，它包括以下步驟:
[0013](I)、清洗培養液的配制:
[0014]a、先按照各溶質的含量和配制容量要求稱取或量取各溶質，并分開放置；同時準備好帶刻度調制容器和超純凈水，并將稱量好的超純凈水加入調制容器中；
[0015]b、將除碳酸氫鈉外的各基礎液溶質按先固體后液體的順序溶于調制容器內的超純凈水中；
[0016]C、向上述步驟b所得溶液中加入所量取的殺菌劑和所稱取的NaHCO3基礎液溶質，同時根據需要添加指示劑，得基礎液；
[0017]d、向上述步驟c所得基礎液中加入所稱取的人血清白蛋白，震蕩或攪拌混合均勻，得原液；
[0018]e、檢測上述步驟d所得的原液的滲透壓和pH值，通過滴加2M的HCl溶液或2M的NaOH溶液調整其pH值至7.20~7.40，并記錄最終滲透壓和pH值
[0019](2)、清洗培養液的處理:
[0020]a、除菌，將上述的所得清洗培養液在超凈工作臺下利用0.2μπι的濾膜過濾除菌；
[0021]b、分裝及冷存，在無菌環境下對上述過濾后的清洗培養液進行分裝、封口，并放置于冰箱或冷庫內在2~8 °C條件下保存，得精子洗滌液；
[0022]C、檢驗，取上述分裝好的精子洗滌液進行檢測；檢測項目包括pH值檢測、滲透壓檢測、細胞毒性檢測、皮內刺激反應檢測、致敏反應檢測、無菌檢測、熱原檢測、細菌內毒素檢測、體外鼠胚試驗和精子活力試驗，以判斷該精子洗滌液是否合格。
[0023]本發明的精子洗滌液可根據需要添加指示劑酚紅，酚紅在pH值變化時顏色變化明顯，PH值在7.0~7.5范圍內酚紅溶液為粉紅色到橙紅色，當pH值小于6.8時為黃色，當PH值大于8.4時為紅色，變色比較明顯，精子洗滌液的pH值在7.20~7.40范圍內溶液為粉紅色到橙紅色，當精子洗滌液顏色與此不符時，說明該精子洗滌液變質，不能用于實驗或臨床，從而避免了使用變質精子液而產生的風險。當不添加指示劑時，本發明的洗滌液呈透明、清澈，在有效期內使用能夠保證液體不變質。
[0024]本發明通過使用抗生素來抑制細菌的生長，如慶大霉素是一種光譜、熱穩定性好的抗生素，在精子洗滌液中添加慶大霉素可以有效抑制細菌的生長。
[0025]本發明包含有多種適合精子生存和生長的有機或無機成份，在對精子的清洗過程中，能創建適合于精子的生存環境，維持了精子原有活力，同時能有效地去除精液中的雜物，殺死有害細菌等，為試管嬰兒的培育或精子的冷凍貯藏提供了保證。
[0026]本發明精子洗滌液的原料均是已經證明其安全性的物質，在制備過程中其溶劑采用超純水，超純水的總有機碳(TOC)超低，避免了因雜質過多影響測定的結果。
[0027]本發明配制工藝操作簡單合理，檢測嚴密，能夠提供新鮮的培養液供生殖中心或科研院所使用。

【具體實施方式】
[0028]以下結合實施例對本發明做進一步的說明。
[0029]實施例一
[0030]本發明的精子洗滌液是對多種溶質溶于超純凈水所配制的清洗培養液進行除菌而成。該超純凈水的物理標準為:①流速為0.05Lpm-2.0Lpm、②在25°C時電阻率為18.2ΜΩ.cm、③在25°C時電導率為0.055 μ S/cm ;化學標準為:熱原質< 0.001Eu/ml，微粒(l/ml，T0C<5ppb。該超純凈水也可用注射用水替代。所述多種溶質包括基礎液溶質、殺菌劑和原液溶質。通過基礎液溶質調配創建適合于精子生存的環境。該基礎液溶質包括氯化鈉、氯化鉀、硫酸鎂、磷酸二氫鉀、氯化鈣、碳酸氫鈉、4-羥乙基哌嗪乙磺酸(HEPES)、葡萄糖、丙酮酸鈉、乳酸鈉、丙氨酰谷氨酰胺、牛磺酸及非必需氨基酸。該原液溶質為人血清白蛋白，用于提供精子生存的必要的培養物質。該殺菌劑為慶大霉素，用于殺滅溶液中的細菌。
[0031]該除菌是清洗培養液在超凈工作臺下利用0.2 μ m的濾膜過濾除菌過程。通過濾膜除去清洗培養液中有關細菌和雜物。
[0032]上述基礎液溶質在清洗培養液中的含量如下:氯化鈉92.815mmol/L(即配制后的清洗培養液中每升含有氯化鈉92.815mmol,下同)、氯化鉀4.465mmol/L、硫酸鎂0.19mmol/L、葡萄糖 2.66mmol/L、憐酸二氧鐘 0.3515mmol/L、氣化?丐 1.9mmol/L、乳酸納 12.18mmoI /L、丙酮酸鈉0.3135mmol/L、碳酸氫鈉3.8mmol/L、丙氨酰谷氨酰胺0.95mmol/L、牛磺酸0.095mmol/L、4-羥乙基哌嗪乙磺酸(HEPES) 19.95mmol/L及非必需氨基酸9.5ml/L ;該人血清白蛋白在清洗培養液中的含量為4.75g/L。具體參見表1的“配方I”一欄。
[0033]表1精子洗滌液中物質含量:
[0034]

【權利要求】
1.一種精子洗滌液，它是對多種溶質溶于超純凈水所配制的清洗培養液進行除菌而成，該多種溶質包括基礎液溶質、殺菌劑和原液溶質，其特征在于:該基礎液溶質包括氯化鈉、氯化鉀、硫酸鎂、磷酸二氫鉀、氯化鈣、碳酸氫鈉、4-羥乙基哌嗪乙磺酸、葡萄糖、丙酮酸鈉、乳酸鈉、丙氨酰谷氨酰胺、牛磺酸及非必需氨基酸；該原液溶質為人血清白蛋白；該殺菌劑為慶大霉素；該除菌是清洗培養液在超凈工作臺下利用0.2 μ m的濾膜進行過濾的過程。
2.根據權利要求1所述的精子洗滌液，其特征在于:該基礎溶質在清洗培養液中的含量如下:氯化鈉92.815~102.585mmol/L,氯化鉀4.465~4.935mmol/L,硫酸鎂0.19~0.21 mmol /I,,葡萄糖 2.66 ~2.94mmol/L,憐酸二氧鐘 0.3515 ~0.3885mmol/L,氣化?丐1.9 ~2.1 mmol/L,乳酸納 12.18 ~13.48mmol/L、丙麗酸納 0.3135 ~0.3465mmol/L、碳酸氫鈉3.8~4.2mmol/L、丙氛酸谷氛酸胺0.95~1.05mmol/L、牛橫酸0.095~0.10SmmoI /L、4-羥乙基哌嗪乙磺酸19.95~22.05mmol/L及非必需氨基酸9.5~10.5ml/L ;該人血清白蛋白在清洗培養液中的含量為4.75~5.25g/L。
3.根據權利要求2所述的精子洗滌液，其特征在于:該慶大霉素在清洗培養液中的含量為 9.5 ~10.5mg/L。
4.根據權利要求3所述的精子洗滌液，其特征在于:該清洗培養液中還具有用以判斷該清洗培養液pH值的指示劑；該指示劑為酚紅，在清洗培養液中的含量為9.5~10.5mg/L0
5.根據權利要求4所 述的精子洗滌液，其特征在于:該清洗培養液的pH值為7.20~7.40 ;該清洗培養液的滲透壓為260~290m0sm/Kg。
6.根據權利要求2或3或4或5所述的精子洗滌液，其特征在于:該非必需氨基酸為L-丙氨酸、L-天冬酰胺、L-天冬氨酸、L-谷氨酸、甘氨酸、L-脯氨酸、L-絲氨酸中的一種或者幾種。
7.根據權利要求6所述的精子洗滌液，其特征在于:該基礎液溶質在清洗培養液中的含量如下:氯化鈉92.815mmol/L、氯化鉀4.465mmol/L、硫酸鎂0.19mmol/L、葡萄糖2.66mmol/L、憐酸二氧鐘 0.3515mmol/L、氣化|丐 1.9mmol/L、乳酸納 12.18mmol/L、丙麗酸納0.3135mmol/L、碳酸氫鈉 3.8mmol/L、丙氨酰谷氨酰胺 0.95mmol/L、牛磺酸 0.095mmol/L>4-羥乙基哌嗪乙磺酸19.95mmol/L及非必需氨基酸9.5ml/L ;該人血清白蛋白在清洗培養液中的含量為4.75g/L。
8.根據權利要求6所述的精子洗滌液，其特征在于:該基礎液溶質在清洗培養液中的含量如下:氯化鈉97.7mmol/L、氯化鉀4.70mmol/L、硫酸鎂0.20mmol/L、葡萄糖2.80mmol/L、憐酸二氧鐘 0.37mmol/L、氣化?丐 2.0mmol/L、乳酸納 12.84mmol/L、丙麗酸納 .0.33mmol/L、碳酸氫鈉4.0mmol/L、丙氨酰谷氨酰胺1.0mmol/L、牛磺酸0.10mmol/L、4_輕乙基哌嗪乙磺酸21.0mmol/L及非必需氨基酸10ml/L ;該人血清白蛋白在清洗培養液中的含量為5g/L。
9.根據權利要求6所述的精子洗滌液，其特征在于:該基礎液溶質在清洗培養液中的含量如下:氯化鈉102.585mmol/L、氯化鉀4.935mmol/L、硫酸鎂0.21mmol/L、葡萄糖.2.94mmol/L、憐酸二氧鐘 0.3885mmol/L、氣化韓 2.lmmol/L、乳酸納 13.48mmol/L、丙麗酸納.0.3465mmol/L、碳酸氫鈉 4.2mmol/L、丙氨酰谷氨酰胺 1.05mmol/L> 牛磺酸 0.105mmol/L>.4-羥乙基哌嗪乙磺酸22.05mmol/L及非必需氨基酸10.5ml/L ;該人血清白蛋白在清洗培養液中的含量為5.25g/L。
10.一種如權利要求3~9任意項所述的清子洗滌液的制備方法，其特征在于:它包括以下步驟: (1)、清洗培養液的配制: a、先按照各溶質的含量和配制容量要求稱取或量取各溶質，并分開放置；同時準備好帶刻度調制容器和超純凈水，并將稱量好的超純凈水加入調制容器中； b、將除碳酸氫鈉外的各基礎液溶質按先固體后液體的順序溶于調制容器內的超純凈水中； C、向步驟b所得溶液中加入所量取的殺菌劑和所稱取的NaHC03溶質，同時根據需要添加指不劑，得基礎液； d、向步驟c所得基礎液中加入所稱取的人血清白蛋白，震蕩或攪拌混合均勻，得原液； e、檢測步驟d所得的原液的滲透壓和pH值，通過滴加2M的HCl溶液或2M的NaOH溶液調整其PH值至7.20~7.40，并記錄最終滲透壓和pH值。 (2)、清洗培養液的處理: a、除菌，將上述的所得清洗培養液在超凈工作臺下利用0.2μπι的濾膜過濾除菌； b、分裝及冷存，在無菌環境下對過濾后的清洗培養液進行分裝、封口，并放置于冰箱或冷庫內在2~8°C條件下保存，得精子洗滌液； c、檢驗，取分裝好的精子洗滌液進行檢測；檢測項目包括pH值檢測、滲透壓檢測、細胞毒性檢測、皮內刺激反應檢測、致敏反應檢測、無菌檢測、熱原檢測、內毒素檢測、體外鼠胚試驗和精子活力試驗，以判斷該精子洗滌液是否合格。
【文檔編號】C12N5/076GK104164401SQ201410396987
【公開日】2014年11月26日 申請日期:2014年8月12日 優先權日:2014年8月12日
【發明者】王維華, 周淑梅, 黃永軍 申請人:沈陽潔瑞生物技術有限公司