一種豬胃腸道內容物及糞便微生物總量的分離方法
【專利摘要】本發明公開了一種豬胃腸道內容物及糞便微生物總量梯度離心分離方法，其步驟，A、分離緩沖液的試劑配制；B、實驗方法：（1）選取豬腸道內容物和糞便，無菌收集胃、空、回、盲、結腸內容物和糞便；（2）分別稱取容物和糞便重量于無菌離心管中，離心，棄上清；（3）向離心管加入分離緩沖液，漩渦混勻儀上搖勻，離心；（4）將離心管取出，將上清液倒入離心管中，將裝有上清液的離心管，離心，棄上清；（5）量取分離緩沖液，加入離心管a中，漩渦混勻儀上搖勻，離心，棄上清；（6）重復步驟3、步驟4、步驟5各二次；（7）倒掉上清液，將菌體轉入2ml離心管中，－70℃保存，用于測定菌體干重和微生物區系。方法易行、操作簡便、成本低廉。
【專利說明】一種豬胃腸道內容物及糞便微生物總量的分離方法
【技術領域】
[0001]本發明涉及微生物分離【技術領域】，更具體涉及一種豬胃腸道內容物與糞便微生物總量梯度離心分離方法。
【背景技術】
[0002]豬胃腸道中的微生物菌群種類復雜、數量龐大。胃腸道微生物對氮營養素的代謝程度及代謝去向直接影響機體對日糧氮營養素利用和氮排放，同時微生物及其代謝產物通過模式識別受體的信號感應調節腸黏膜功能，進而影響氮營養素的吸收。研究微生物區系、內源氨基酸排出的微生物菌體氨基酸組成及微生物酶活對解析腸道微生物與氮營養素的代謝機理至關重要。豬胃腸道微生物總量的分離是研究微生物區系及胃腸道微生物酶活測定的先決條件。糞便微生物氮和氨基酸是組成內源氮和氨基酸的重要組成部分，糞便微生物總量分離對于了解糞便微生物氮和氨基酸排出情況十分重要，然而，目前國內外沒有統一的分離標準。因此本發明通過摸索豬胃腸道內容物及糞便與分離緩沖液的適宜比例，采用梯度離心法對豬胃腸道及糞便微生物總量進行分離。該分離方法具有成本低廉、重復性好、操作簡單等特點。
【發明內容】
[0003]本發明的目的是在于提供了一種豬胃腸道內容物及糞便微生物總量梯度離心分離方法，操作簡便，成本低廉，重復性好，所得微生物總量可供豬胃腸道微生物相關指標的測定，為研究微生物區系、內源氨基酸排出的微生物菌體氨基酸組成及微生物酶活和解析腸道微生物與氮營養素的代謝機理提供技術基礎。
[0004]為了達到上述的目的，本發明采用以下技術措施:
[0005]一種豬胃腸道內容物及糞便微生物總量梯度離心分離方法，其步驟如下:
[0006]1.分離緩沖液的試劑配制:
[0007]稱取氯化鈉(NaCl) 0.85溶于950_1050ml雙蒸水中，待溶解后再加于Iml吐溫-80，121。。高壓(10-1lOkPa)滅菌 18_22min。
[0008]2.實驗方法:豬胃腸道內容物及糞便微生物總量梯度離心分離的操作過程是:
[0009](I)選取豬腸道內容物和糞便(I頭30kg左右)，無菌收集胃、空、回、盲、結腸內容物和糞便，于4°C保存待用。取1g測定總菌含量。
[0010](2)根據樣品與分離緩沖液的稀釋比例:分離程度、菌體干重含量和微生物區系結果前腸(胃、空、回)的最佳稀釋比例范圍為8%~10%，后腸(盲、結、糞便)的最佳稀釋比例范圍為2%~4%。按表5分別稱取相應胃、空、回、盲、結腸內容物和糞便重量于無菌50ml離心管a中，10000rpm4°C離心4 一 6min,棄上清。每個樣做2 — 4個重復。
[0011]表5.不同腸段內容物與糞便稀釋比例
[0012]
【權利要求】
1.一種豬胃腸道內容物及糞便微生物總量梯度離心分離方法，其步驟是: A、分離緩沖液的試劑配制: 稱取氯化鈉0.85溶于950-1050 ml雙蒸水中，待溶解后再加于I ml吐溫-80，121 °C高壓:100-110 kPa 滅菌 18-22 min ； B、實驗方法:豬胃腸道內容物及糞便微生物總量梯度離心分離的操作過程是: (1)選取豬腸道內容物和糞便，無菌收集胃、空、回、盲、結腸內容物和糞便，于4°C保存待用； (2)根據樣品與分離緩沖液的稀釋比例:胃、空、回腸內容物為8~10%，盲、結腸內容物與糞便的稀釋比例為疒4%，分別稱取胃、空、回、盲、結腸內容物和糞便于無菌50 ml離心管a 中，10000 rpm 4°C 離心 4 — 6min,棄上清； (3)向離心管a加入40ml分離緩沖液，漩渦混勻儀上搖勻2-3 min, 1500 rpm 4°C離心 4 — 6 min ； (4)將離心管a取出，將上清液倒入離心管b中，將裝有上清液的離心管b10000 rpm4°C離心4 一 6 min,棄上清； (5)量取40ml分離緩沖液，加入離心管a中，漩渦混勻儀上搖勻2-3 min, 1500 rpm40C離心4 一 6 min，將提取上清液倒入離心管b，將裝有上清液的離心管b 10000 rpm 4°C離心4 一 6 min,棄上清； (6)重復步驟3、步驟4、步驟5各二次； (7)倒掉上清液，將菌體轉入2ml離心管中，一 70°C保存，用于測定菌體干重和微生物區系。
【文檔編號】C12Q1/02GK104178549SQ201410431318
【公開日】2014年12月3日 申請日期:2014年8月28日 優先權日:2014年8月28日
【發明者】鄧歡, 唐志如, 孫志洪, 賴星 申請人:西南大學