一種小鼠核糖體基因區打靶載體及其構建方法
【專利摘要】本發明公開了提供一種小鼠核糖體基因區打靶載體及其構建方法。所述小鼠核糖體基因區打靶載體中含有如SEQ ID NO.1所示的同源臂序列。本發明在核糖體基因區較高的同源重組效率基礎上，旨在針對核糖體基因區位點，利用本發明有效地將目的基因打靶到小鼠不同類型細胞的核糖體基因區，再通過啟動子陷阱策略富集基因打靶陽性克隆，此外Loxp序列的引入可以實現之后不同基因在打靶位置高效替換。本發明后續主要應用小鼠胚胎干細胞的核糖體基因區打靶，再最終建立核糖體基因區打靶的小鼠模型，為驗證以核糖體基因區基因打靶的有效性、生物安全性提供基礎。
【專利說明】-種小鼠核糖體基因區打靶載體及其構建方法

【技術領域】
[0001] 本發明屬于生物【技術領域】，具體涉及一種小鼠核糖體基因區打靶載體及其構建方 法。

【背景技術】
[0002] 2007年獲得諾貝爾醫學獎的基因打靶技術本身是生物醫學研究領域具有開創性 的方法，該方法通過構建同源重組引導的打靶載體，將其導入細胞后，利用細胞內靶向的基 因組位點與載體間自發同源重組，再最終篩選出攜帶重組子的細胞，從而可在活細胞中精 確穩定的引入基因組修飾，例如可定向敲除（knock-out)特定的內源基因，也能定點將外 源基因靶入（knock-in)至基因組。打靶載體的構建是后續實驗的基礎，決定了同源重組的 位點及重組效率，因此打靶載體的選擇與構建就顯得尤為關鍵。
[0003] 自1987年Thomas和Capecchi完成了世界第一例小鼠胚胎干細胞（mESC)基因打 靶實驗以來，基因打靶技術就給應用小鼠進行的生物醫學研究帶來了革命，并為基因治療 引入了新的手段。隨著近30年的發展，科學家們利用基因打靶技術與mESCs的結合，針對 不同的基因，設計打靶載體，對小鼠近1萬個基因進行了基因操作，并建立了 500多種人類 疾病的小鼠模型，其中包括心血管疾病，神經退行性疾病，糖尿病和癌癥等。
[0004] 雖然基因打靶技術已經廣泛應用于對mESC的基因操作中，但是最終獲得穩定基 因修飾細胞的效率卻不勝人意。基因打靶技術的關鍵是根據合適靶位點設計和構建打靶載 體。靶位點的選擇可能直接影響到同源重組的效率，同時也涉及到外源基因靶入細胞后安 全性和有效性的問題。目前文獻報道已經實現基因打靶的位點基本上都是具有特定生理功 能的結構基因，這類等位基因在基因組上大部分僅有兩個拷貝，而基因打靶的成功將導致 其中一個拷貝甚至兩個拷貝的失活，極大可能影響或改變打靶后細胞的生物學特性。因此 目前針對不同疾病所進行的基因打靶大多是利用其進行機制相關的研究，尚未能將基因打 靶載體介導的基因打靶技術直接進行疾病診療的臨床轉化。
[0005] 現有通過基因打靶載體介導的基因打靶技術主要缺點在于打靶效率低下，而制約 因素主要有幾個方面，包括基因組打靶位點的選擇，打靶載體的設計策略，載體導入細胞的 效率。其中靶位點的選擇是基因打靶至關重要的一步，因為此因素可能直接影響到同源重 組的效率，同時也涉及到外源基因靶入細胞后安全性和有效性的問題。此外，目前文獻報道 已經實現基因打靶的位點基本上都是具有特定生理功能的結構基因，這類等位基因在基因 組上大部分僅有兩個拷貝，而基因打靶的成功將導致其中一個拷貝甚至兩個拷貝的失活， 極大可能影響或改變打靶后細胞的生物學特性。因此如何在細胞中實現安全穩定的基因打 靶是能否將其應用于臨床轉化的關鍵問題。


【發明內容】

[0006] 本發明旨在克服現有技術的不足，提供一種小鼠核糖體基因區打靶載體及其構建 方法。
[0007] 為了達到上述目的，本發明提供的技術方案為：
[0008] 所述小鼠核糖體基因區打靶載體中含有如SEQ ID NO. 1所示的同源臂序列。
[0009] 優選地，所述打靶載體的空載體為T載體，pEGFP載體或pcDNA3. 1載體等。
[0010] 優選地，所述打祀載體的序列如SEQ ID N0. 2所示。
[0011] 上述打靶載體的制備方法包括如下步驟：
[0012] (1)以小鼠胚胎干細胞的gDNA作為模板，將SEQ ID NO. 1所示的同源臂序列擴增 為AR1和AR2兩段序列，AR1序列如SEQ ID N0. 3所示；AR2序列如SEQ ID N0. 4所示；
[0013] (2)將AR1序列連接至打靶載體的空載體，得載體AR1 ;將AR2序列連接至打靶載 體的空載體，得載體AR2 ;
[0014] (3)待載體AR1和載體AR2測序正確后，通過Not I和BamH I將AR1序列從載體 AR1上酶切下來；通過Not I和BamH I將AR2序列從載體AR2上酶切下來；將酶切下來的 AR1和AR2連接，構建成含有SEQ ID NO. 1所示同源臂序列的載體pMr ;
[0015] (4)在載體pMr中SEQ ID Ν0· 1所示同源臂序列的EcoR I酶切位點出連入正選擇 篩選基因 Neo,構建成小鼠核糖體基因區打靶載體pMrn。
[0016] 下面結合原理對本發明作進一步說明：
[0017] 針對現有技術的缺點，本發明選擇核糖體基因區作為基因打靶的靶位點并設計構 建相應的基因打靶載體。通過早期的實驗結果及生物信息學分析得知，核糖體基因區可能 是高效的基因打靶位點。一方面，在小鼠基因組中有50-100個拷貝的核糖體基因。如此 龐大的拷貝數為同源重組提供大量的重組位點，可能增加打靶的效率。另一方面，據報道， 在酵母和擬芥南細胞中，已經發現核糖體基因區有一段有刺激同源重組事件發生功能的序 列，由于真核細胞的核糖體基因區相當保守，這段序列很可能鼠細胞的核糖體基因區，從而 使之成為一個同源重組熱點。此外，在細胞增殖快，細胞生命活動旺盛的干細胞中，rDNA區 的轉錄活躍，染色質松散，可能更易于同源重組的發生。
[0018] 其次，核糖體基因區是安全的基因打靶位點。由于小鼠與人核糖體基因區序列的 同源性高達95%以上，而人核糖體基因區拷貝數的變化是常見的多態現象，增加或減少對 人體無危害。另一方面小鼠每個細胞中都有許多拷貝的核糖體基因，破壞少數拷貝對細胞 維持正常的功能應該沒有影響。
[0019] 基于上述分析和實驗，本發明首先通過生物信息學方式查找到小鼠 rDNA單個拷 貝的全序列，選取其轉錄區下游+2506至+6875全長4370bp的一段序列作為同源臂序列。 抽提小鼠胚胎干細胞的gDNA作為模板，通過設計引物將該同源序列分為兩段（AR1，AR2)進 行擴增，其中AR1長2428bp，AR2長2421bp。擴增后的DNA片段分別連接至T載體上。再 通過Not I和BamH I酶切AR2的一段序列連接到AR1之后，構建成包含4370bp全長同源 臂的載體pMr。在同源臂上的EcoR I酶切位點處（rDNA轉錄取下游+5646位點）連入正選 擇篩選基因 Neo。Neo采用啟動子陷阱策略，即上游未帶啟動子，而是利用EMCV-IRES (腦心 肌炎病毒內部核糖體進入位點序列）的作用依靠核糖體基因自身的啟動子來驅動其表達， 以富集基因打靶陽性克隆。EMCV-IRES及Neo基因將全長同源臂分隔為1229bp的短同源臂 (SH)和3140bp的長同源臂（LH)，通過兩個同源臂與基因組發生同源重組將Neo打靶至細 胞基因組rDNA中。EMCV-IRES-Neo序列的兩端加上了 LoxP序列便于后續工作中去除篩選 基因或進行基因交換。
[0020] 本發明的目的在于證實該載體能高效介導外源基因靶入到小鼠胚胎干細胞的核 糖體基因區，并能穩定遺傳，且該載體介導的基因打靶不影響小鼠胚胎干細胞的生物學特 性，初步證實具備安全性。
[0021] 與現有技術相比，本發明的有益效果為：
[0022] 1)通過測序證實構建好的小鼠核糖體基因區打靶載體pMrn的同源臂及其他序列 元件均無突變，將pMrn通過核轉染的方式導入小鼠胚胎干細胞后，經G418藥物篩選，能獲 得大量抗性克隆，通過定點PCR，Southern blot的檢測，確定pMrn能將外源基因定點靶入 到小鼠 rDNA區。
[0023] 2)通過計算，pMrn所獲的打靶效率高于之前報道其他位點的打靶效率，具有高效 的優點。
[0024] 3)將打靶后的小鼠胚胎干細胞多次傳代，并經核型檢測和干細胞標志物的檢測， 表明rDNA區打靶不僅能穩定遺傳，而且不會改變干細胞的生物學特性。具有穩定安全的優 點。
[0025] 總之，本發明所述的小鼠核糖體基因區打靶載體pMrn包括5'同源臂和3'同源臂， 以小鼠 rDNA轉錄區下游+2506至+6875全長4370bp的一段序列作為同源臂序列，在同源臂 上的Xbal酶切位點的位置上連入正選擇篩選基因 Neo。Neo基因采用啟動子陷阱策略，艮P， 上游未帶啟動子，而是利用EMCV-IRES(腦心肌炎病毒內部核糖體進入位點序列）的作用依 靠核糖體基因自身的啟動子來驅動其表達EMCV-IRES-Neo篩選基因的兩端加上了 Loxp序 列，便于后續工作中去除篩選基因或進行基因交換。本發明在核糖體基因區較高的同源重 組效率基礎上，旨在針對核糖體基因區位點，利用本發明有效地將目的基因打靶到小鼠不 同類型細胞的核糖體基因區，再通過啟動子陷阱策略富集基因打靶陽性克隆，此外Loxp序 列的引入可以實現之后不同基因在打靶位置高效替換。本發明后續主要應用小鼠胚胎干細 胞的核糖體基因區打靶，再最終建立核糖體基因區打靶的小鼠模型，為驗證以核糖體基因 區基因打靶的有效性、生物安全性提供基礎。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0026] 圖1AR1，AR2PCR凝膠電泳結果圖；
[0027] 圖2為pMr酶切鑒定結果圖；
[0028] 圖3為pMrn酶切鑒定結果；
[0029] 圖4為pMrn測序鑒定圖；
[0030] 圖5為核轉獲得高效的轉染率及藥物篩選后的抗性mESCs克隆結果圖；
[0031] 圖6為Southern Blot鑒定定點整合克隆以及所獲得的定點整合克隆數分析圖；
[0032] 圖7為定點整合克隆堿性磷酸酶呈陽性且核型正常的結果圖； 圖8為實施例1中2. 1第一次PCR循環條件； 圖9為實施例1中2. 1第二次PCR循環條件； 圖10為實施例1中3. 1的PCR循環條件； 圖11為實施例1中4. 3的PCR循環條件。

【具體實施方式】
[0033] 實施例1
[0034] 1小鼠胚胎干細胞全基因組DNA的抽提
[0035] (1)小鼠胚胎干細胞的培養3天，保證其未分化。
[0036] (2)棄去培養皿的培養基，加5ml DPBS洗滌2次。
[0037] (3)棄盡 DPBS,加 1ml 0.05% trypsin/EDTA 37°C培養箱消化 2-3min。
[0038] (4) 3min后加5ml培養基終止消化，用大tip把細胞吹洗下來，并將懸液轉移至 15ml離心管。
[0039] (5) 1000rpm，室溫離心5min，收集細胞。
[0040] (6)棄培養基后加3ml DPBS洗一次，lOOOrpm，室溫離心5min。
[0041] (7)小心倒掉DPBS，加入含有200ug/ml RNA酶的0· 5ml lx細胞裂解液，劇烈振蕩 重懸細胞
[0042] (8)每管加入20%的SDS 35ul，上下顛倒混勻，直至出現黏稠透明裝。
[0043] (9)加入終濃度200ug/ml蛋白酶K并且顛倒混勻，于恒溫床上lOOrpm，37°C消化 6小時以上（過夜）
[0044] (10)將溶液轉移至EP管中，加入相同體積飽和酚，輕輕搖勻，直至乳濁液形成，然 后 13000rpm，4 度離心 lOmin.
[0045] (11)將上層水相轉移至另一新的EP管中，加入相同體積的酚和氯仿（酚：氯仿= 1:1)搖勻后，13000rpm，4 度離心 lOmin。
[0046] (12)將上層液移至另一 EP管，加2倍體積預冷的乙醇，顛倒混勻，有少量的絮狀 DNA沉淀.
[0047] (13)4 度 13000rpm 離心 lOmin,收集 DNA 沉淀。
[0048] (14)棄上清，加入500ul 70%乙醇洗0嫩一遍。
[0049] (15) 13000rpm 4 度離心 5min。
[0050] (16)棄上清，點離，用小tip吸盡殘留的清洗液，室溫下干燥，加入20ul ddH20，充 分溶解。
[0051] (17)取 2ul 測 0D 值，并稀釋成 100ng/ul。
[0052] 2同源臂（pMr)載體的構建
[0053] 小鼠 rDNA區靶向載體（pMrn，pMr-GFP)同源臂總長度有4269sbp，為減少突變的可 能性，我們設計了利用BamH I和T-vector載體上Not I酶切位點分別把同源臂分成兩段 (AR1、AR2)，然后利用酶切位點將它們拼接成pMr同源臂載體，所有PCR過程均用phusion 高保真酶來擴增。
[0054] 2. 1 PCR擴增小鼠 rDNA區同源序列AR1、AR2
[0055] 以上述抽的小鼠 gDNA為模板，利用下列引物擴增同源臂AR1
[0056] 由于rDNA區同源序列要求較高的保真性，擴增利用了 NEB公司的高保真DNA聚合 酶-Phusion酶，擴征片段2428bp
[0057] 其PCR擴增體系為：
[0058] SxPhusion HF Buffer 4ui Mouse gDNA (lOOn^til) 2ul Primer F ( lOuM ) ( SEQ ID ().5ul N0.5) Primer R ( lOuM ) ( SEQ ID 〇.5ul N0.6)
[0059] dNTP(IOmM) 0.5 ul DMSO O.611I Phusion 0,2ui ddH^O 】1.7ui total 20ul
[0060] PCR循環條件如圖8所示。
[0061]
[0062] 以上述抽的小鼠 gDNA為模板，利用下列引物擴增同源臂AR2 ;
[0063] 由于rDNA區同源序列要求較高的保真性，擴增利用了 NEB公司的高保真DNA聚合 酶--Phusion酶，擴增片段為2321bp。
[0064] 其PCR擴增體系為：
[0065] SxPhusion HF Buffer 4ul Mouse gDNA (1 OOng/ut) 2ui Primer F ( lOuM ) ( SEQ ID 〇.5ul N0.7) Primer R ( lOuM ) ( SEQ ID 〇.5ui NO.8) dNTP(lOmM) 0.5ul DMSO 0/ml Phasion 0,2ul ddH20 11.7ul total 20ul
[0066] PCR循環條件如圖9所示。
[0067]
[0068] 2. 2 PCR產物的純化
[0069] 2· 2· 1膠純化PCR產物
[0070] 實驗采用試劑盒對膠中的目的片段進行回收（我室通常使用QIAGEN GEL extraction Kit)：
[0071 ] 1)制備0. 8 %的瓊脂糖凝膠
[0072] 2)用0. 5 X TBE緩沖液中電泳上述的PCR產物；
[0073] 3)電泳結束后，取出凝膠在加有溴化乙錠（EB)染液中染色10?15min ;
[0074] 4)在長波長紫外燈照射下進行切膠回收目的條帶，切膠時在保證條帶完整的前 下，并且盡可能地減少瓊脂糖的體積；
[0075] 5)稱量切膠的質量，加入相當于膠質量3倍體積的buffer QG(lOOmg-lOOul)， 50°C水浴箱10min，每隔3min上下顛倒直至凝膠全部溶解。
[0076] 6)加1倍體積的異丙醇，混勻后，把液體移至純化柱，室溫13000rpm離心lmin。
[0077] 7)棄上清，加 500ul buffer QG，13000rpm 離心 lmin。
[0078] 8)棄上清，加 750ul buffer PE，13000rpm 離心 lmin。
[0079] 9)棄上清，13000rpm重新離心2min，保證無乙醇殘留。
[0080] 10)將柱子轉移至一新的EP管中，將15ul的滅菌水加于柱膜正中，溶解DNA2min， 室溫 13000rpm 離心 lmin，
[0081] 11)測量 0D 值。
[0082] 2. 2. 2 PCR 產物加 A 尾：
[0083] Phusion酶擴增后的PCR產物其末端是平端，所以在T連之前需先在其3'端加 A 尾
[0084] 其體系如下：
[0085] 膠純化產物 12ui dNTP(lOmM) 2ui 4χ Buffer 5 ui LATaq 1 ul Total 20 72°C 30ηι?η,37Γ 30mm,
[0086] 2. 2. 3酒精純化加 A尾產物
[0087] 1)加入三倍體積的事先預冷的無水乙醇，放置_20°C 10min。
[0088] 2) 4°C 13000rpm 離心 10min，小心棄置懸液。
[0089] 3)力口 100ul 預冷的 75% 乙醇，放置-20°C 10min。
[0090] 4)4°C 13000rpm 離心 lOmin,小心棄置懸液。
[0091] 5)4°C 13000rpm離心lmin,用小槍吸盡上清液然后室溫干燥。
[0092] 6)加入5ul滅菌水溶解DNA。
[0093] 2. 3 PCR產物連接、轉化以及鑒定
[0094] 2. 3. 1 PCR 產物連接
[0095] PCR產物連接到T-vector上然后進行轉化，抽提質粒酶切鑒定測序等步驟。
[0096] 連接體系
[0097] 2xbulTer 5ul DNA (ARL AR2) 3ml T4連接W lul T-vector lul Total lOul 16度水浴過夜
[0098] 2.3.2大量感受態的制備以及凍存。
[0099] 1)從JM109菌種懸液劃線的培養皿中挑取一個單菌落，擴大培養，于37 °C， 280rpm，搖振培養約8個小時。
[0100] 2)把上述搖振的菌液接種于500ml的LB培養液中，37°C，280rpm搖振培養2個小 時。
[0101] 3)把上述搖振的菌液分裝成10管50ml菌液，然后4°C，3000rpm離心lOmin。
[0102] 4)棄去上清液，用3ml的0· lmol/L CaC12，10%甘油重懸，冰置12小時，然后按照 每管100ul分裝，凍存在-70°C。
[0103] 2. 2. 2. 3. 3 質粒轉化
[0104] 1)取上述_70°C凍存的JM109感受態細胞置冰上溶解。
[0105] 2)取5ul連接產物或lul質粒（50-100ng)加到100ul感受態細胞中，輕輕混勻， 冰置30min。
[0106] 3)42°〇水浴9〇8，并迅速放到冰上2!1^11。
[0107] 4)加200ul液體LB，于搖床上37°C、180rpm搖振培養45min。
[0108] 5)4500rpm離心5min，倒掉上清，留100ul菌液，吹打混勻，在超凈工作臺鋪皿。
[0109] 6)37°C 培養箱培養 12_16h。
[0110] 7)出現克隆后，挑取小的邊緣不規整的克隆于含有氨芐青霉素抗性LB擴大培養。
[0111] 2. 3. 4質粒的小量制備
[0112] 質粒DNA小量制備用的是OMEGA公司的Plasmid mini kit I抽提，具體抽提按照 試劑盒protocol操作。
[0113] 1)將 1. 5ml 菌液加到 EP 管中，13000rpm 離心 lmin。
[0114] 2)倒掉上清，加250ul的Solution I溶液，劇烈振蕩，使細菌重懸于其中（確保細 菌全部重懸）。
[0115] 3)加入250ul Solution II溶液（注意觀察Solution II是否有絮狀沉淀，若有 37°C水浴至絮狀沉淀溶解），輕輕顛倒4-5次混勻（避免劇烈的振蕩，以防染色體DNA斷裂， 質粒溶度過低），室溫孵育2-3min。
[0116] 4)加入350ul預冷的Solution III溶液，混勻，可見白色絮狀沉淀生成，室溫下 13000rpm 離心 10min。
[0117] 5)平衡 HiBind Miniprep Column I 柱子：往柱子加入 200ul GPS buffer，室溫靜 置 2_5min，室溫下 13000rpm 離心 10min。
[0118] 6)小心地將上清轉移到步驟（5)平衡好的柱子，13000rpm、室溫離心lmin。
[0119] 7)棄去收集管的廢液，再加入 500ul 的Buffer HB來洗HiBind Miniprep Column, 13000rpm、室溫離心lmin(這步主要是將殘余的蛋白質除去干凈）
[0120] 8)棄去收集管的廢液，再加入750ul的DNA Wash Buffer來洗HiBind Minipr印 Column，13000rpm、室溫離心 lmin
[0121] 9)棄去收集管的廢液，再13000rpm、室溫離心2min以除凈殘留的乙醇（不要省略 這一步，對能否提出質粒這步很重要。）
[0122] 10)把收集柱子放置于新的1.5ml EP管用于收集質粒DNA。加入20ul ddH20與 柱子中間，室溫放置2min溶解DNA。
[0123] 11) 13000rpm、室溫離心2min，離心液即所抽提的質粒DNA。再測量0D值。
[0124] 2. 3. 5質粒的酶切鑒定：
[0125] 先用1 %的瓊脂糖膠跑個質粒電泳，觀察電泳條帶，把疑似有插入片段的質粒進行 酶切鑒定。
[0126] 所用限制性內切酶均為NEB公司的酶，酶切體系如下：
[0127] lO^Buffer 2 Plasmid 5 ill Not I 0.5 ul BaniH I §,5ul iOOxBSA 0,2ul ddH：〇 11,8 ul Total 20 ul
[0128] 7°C反應2_3h，取10ul點樣進行瓊脂糖凝膠電泳檢測。
[0129] 2. 3. 6同源臂的連接
[0130] 把酶切鑒定是陽性的質粒送到博尚公司測序。然后把經過測序鑒定沒有突變的 AR1，AR2經過Not I、BamH I酶切，膠純化以及連接構造 pMr同源臂空載體。酶切體系、膠 純化步驟如上述相同。
[0131] 1)T-AR1質粒大小為5428bp，用Not I和BamH I酶切，可以得到2096bp和3332bp 片段的兩條片段，其中2096bp片段是目的片段，稱為片段1。
[0132] 2)T-AR2質粒大小為5421bp，用Not I和BamH I酶切，可以得到147bp和5273bp 片段的兩條片段，其中5274bp片段是目的片段，稱為片段2。
[0133] 3)用膠純化回收片段1、片段2,并測0D值，記下其濃度。
[0134] 4)用以下體系把片段1、片段2連接。
[0135] 10^T4 Ligasc BulTcr 2ul
[0136] Μ'段 2 100 ng j',段 I variaWc (片段丨；片段2摩爾數比 ….…、 i ul 3:1-10:1) T4 DNA Ligase(5U/ul) To 20 ul ddH20 2〇 Ul Total volume
[0137] 16度水浴過夜。轉化以及pMr載體質粒小量制備跟上述相同。
[0138] 2. 3. 7 pMr載體酶切鑒定
[0139] 取所制備的載體用Not I和EcoR I酶切，酶切體系跟上述相同。可以得到兩個片 段，片段大小分別為3108bp，4232bp。
[0140] 3 pMrn載體的構建
[0141] 3. 1 Τ-Neo 載體構建
[0142] PCR擴增Neo基因，其中包括腦心肌炎病毒內部核糖體進入位點序列 (EMCV-IRES)、新霉素磷酸轉移酶基因開放閱讀框和SV40polyA序列，簡稱Neo。并且在擴增 中利用上游引物依次加入了 EcoR I位點、野生型ΙοχΡ位點，下游引物依次加入了 EcoR I 位點、突變型l〇xP2272位點。
[0143] 在擴增之前由于上游引物和下游引物loxp之間的回文序列互補，不易擴增，所以 得對上下游引物預處理。99攝氏度5min后馬上放置冰上3min。然后再按照以下體系擴增。 擴增利用了 NEB公司的Phusion酶，擴增出1904bp片段。其PCR擴增體系為：
[0144] 5X Phusion HF Buffer 4ul pHrNco (lOOng/ul) 2ui Primer F (lOuM ) (SEQ ID NO.9) ().5ul Primer R (lOuM) (SEQIDNO.10) 〇.5ul dKTP( H)mM) 0.5ul Phusion D.2ul dd H20 12,3ul total 20ul
[0145] PCR循環條件如圖10所示。
[0146]
[0147] 3.2pMrn 構建完成
[0148] 1)將上述T-Neo用Ecorl酶切，然后在經過膠回收分別得到Neo基因。
[0149] 2)用EcoR I單酶切pMr，得到線性化pMr片段，為防止自連，對其骨架去磷酸化處 理。其體系為：
[0150] 1〇χ AP Buffer 2ul 線件.DMA l?ul ΠΑΡ lul Total 20 ul 37Γ 30min
[0151] 3)然后再膠純化處理得到骨架去磷酸化的pMr線性化載體。
[0152] 4)分別將Neo和pMr連接，構建成pMrn載體。
[0153] 中間過程涉及到的膠純化、連接、轉化、質粒抽提以及鑒定過程同前述。
[0154] 小結：
[0155] pMrn載體構建結果：
[0156] 抽提小鼠胚胎干細胞gDNA，并以此作為模板，通過調整PCR體系以及溫度條件，擴 增AR1，AR2,結果顯示均能特異性擴增出片段。再按設計的流程相互連接，最終將4370bp的 HS連接至T載體上，構建成pMr。通過Not I和Nhe I對pMr進行酶切鑒定，結果顯示酶切 后的條帶符合預期大小，表明載體構建成功。最后通過EcoR I將EMCV - IRES連接至pMr 中，通過酶切及測序鑒定表明最終構建成pMrn載體（圖1、2、3和4)。
[0157] 4 pMrn載體介導在小鼠胚胎干細胞內的基因打靶
[0158] 4. 1細胞準備
[0159] (1)在細胞傳代培養中，把細胞接種在預先包被的matri膠中，每天換液觀察細胞 生長狀態。
[0160] (2)待培養3d左右，加入1ml 0· 05% trypsin/EDTA，放置于培養箱消化3-5min。
[0161] (3)用大槍吹打細胞，把mESCs細胞吹打成單細胞，然后轉移置15ml離心管，混勻， 取100ul細胞懸液用計數板計數，取2xl0 7個細胞，以lOOOrpm離心5min。
[0162] (4)棄上清，再加入5ml D-PBS重懸細胞，以lOOOrpm離心5min。
[0163] (5)棄盡上清，用中槍小心的把上清吸干凈，然后再加入800ul D-PBS重懸細胞， 并在冰上孵育10min，然后加20ug事先處理過的線性化打靶載體與之混勻。
[0164] (6)用移液槍把步驟（5)的細胞懸液轉移置電轉杯中。
[0165] (7)把電轉杯置于電轉儀中，以500V，250uF用電穿孔方法打靶小鼠胚胎干細胞， 使其利用同源重組方式定點整合到小鼠 rDNA區。
[0166] (8)將電轉的細胞馬上置于冰上孵育10min。
[0167] (9)把經電轉并且孵育的細胞轉移到事先準備好的MEF飼養層培養皿中培養，6h 后換液，去除死細胞。
[0168] 4.2細胞篩選
[0169] (1)電轉的mESCs細胞，第二天換液用加有50ug/ml G418篩選，其他培養跟正常小 鼠胚胎干細胞一樣。
[0170] (2)培養5-6天后可以看到有小克隆形成繼續篩選培養，每天觀察期狀態，并且拍 照記下細胞生長狀態
[0171] 4. 3定點PCR鑒定及Southern鑒定
[0172] 4. 3. 1 PCR鑒定定點整合克隆
[0173] 以抽提的細胞克隆gDNA為模板，用定點整合引物screen-rc/screen-dn進行擴 增，若為定點整合陽性，則擴增后PCR產物片段為1. 4kb。
[0174] PCR反應體系為：
[0175] 2x〇C Buffer I: ΙΟ.ΟμΙ dNTP: 1 ,ΟμΙ LA-Taq DNA polymerase: 0.2μ 1 scrccn-rc: 1,0 μ 1 sc rccn-dn: 1 .0 μ 1 gDNA: 2.0μΙ
[0176] ddH2〇： 4,8μΙ Total: 20,0μ1
[0177] PCR循環條件如圖11所示。
[0178]
[0179] 反應結束后，取5 μ 1 PCR產物以0. 8 %瓊脂糖凝膠電泳進行檢測。
[0180] 4. 3. 2 Southern blot 鑒定（參照 DIG HIGH PRME DNA LABELING試劑盒，Roche)
[0181] 小結：
[0182] pMrn打靶小鼠胚胎干細胞rDNA區的驗證：
[0183] 采用電轉或核轉的方式將pMrn導入到mESCs中，經G418藥物篩選出抗性的mESCs 克隆（圖5)。再通過定點整合PCR以及Southern Blot鑒定，能檢測到與整合基因組rDNA 后一致的片段大小（圖6)。經打靶后的mESCs仍然保持細胞核型正常，且多能性標志物堿 性磷酸酶成強陽性，初步表明小鼠 rDNA區基因打靶的安全性（圖7)。
【權利要求】
1. 一種小鼠核糖體基因區打靶載體，其特征在于，所述打靶載體中含有如SEQ ID NO. 1 所示的同源臂序列。
2. 如權利要求1所述的打靶載體，其特征在于，所述打靶載體的空載體為T載體，pEGFP 載體或pcDNA3. 1載體。
3. 如權利要求2所述的打靶載體，其特征在于，所述打靶載體的序列如SEQ ID NO. 2所 /_J、1 ο
4. 如權利要求1至3任一項所述打靶載體的制備方法，其特征在于，所述方法包括如下 步驟： (1) 以小鼠胚胎干細胞的gDNA作為模板，將SEQ ID NO. 1所示的同源臂序列擴增為AR1 和AR2兩段序列，AR1序列如SEQ ID NO. 3所示；AR2序列如SEQ ID NO. 4所示； (2) 將AR1序列連接至打靶載體的空載體，得載體AR1 ;將AR2序列連接至打靶載體的 空載體，得載體AR2 ; (3) 待載體AR1和載體AR2測序正確后，通過Not I和BamH I將AR1序列從載體AR1 上酶切下來；通過Not I和BamH I將AR2序列從載體AR2上酶切下來；將酶切下來的AR1 和AR2連接，構建成含有SEQ ID NO. 1所示同源臂序列的載體pMr ; (4) 在載體pMr中SEQ ID NO. 1所示同源臂序列的EcoR I酶切位點出連入正選擇篩選 基因 Neo,構建成小鼠核糖體基因區打靶載體pMrn。
【文檔編號】C12N15/66GK104232684SQ201410442448
【公開日】2014年12月24日 申請日期:2014年9月2日 優先權日:2014年9月2日
【發明者】梁德生, 李卓, 鄔玲仟 申請人:中南大學, 湖南家輝生物技術有限公司家輝遺傳專科醫院