本發明屬于生物工程
技術領域：
，涉及一種大菱鲆增食欲素Orexin基因、重組蛋白及其制備方法。
背景技術：
：Orexin（增食欲素）是一組近年來發現的新型下丘腦神經肽，最初是在研制能控制進食的新藥試驗中，在大鼠下丘腦腹外側核內發現的。Orexin主要由下丘腦神經元產生，通過其神經纖維的直接投射或釋放入腦脊髓液作用于靶位點，激活2種與G蛋白耦聯的細胞表面受體OX1R和OX2R，參與機體對攝食、能量代謝、睡眠覺醒循環等生理活動的調節。Orexin在魚類中的重要生理作用，近年來才被科學家認識并逐漸得到重視，針對Orexin的基因克隆、組織學分布、生理作用等相關研究隨之展開。近年來，隨著分子生物學特別是功能基因組學技術，被陸續應用于魚類重要下丘腦神經多肽的發掘和生理調控功能研究以來，人們對于魚類Orexin的結構、分布以及功能等領域的研究逐步得以深入。與此同時，隨著垂體促性腺激素釋放激素（GnRH）、生長激素（GH）等神經多肽在養殖生產中成熟地應用于調控魚類的生長和繁殖以來，如何借助Orexin來人為調控養殖魚類的攝食、營養代謝、能量平衡及其他生理活動也逐漸成為關注的重點。當前中國的海水魚類養殖業發展迅速，為了促進產業朝著規模化、集約化、環境友好型的新型養殖模式發展，對魚類攝食機理、營養吸收和能量轉換等方面的基礎研究顯得尤為重要，為此急需開展魚類Orexin等神經內分泌因子相關研究，開發魚類早期發育必需的營養飼料，特別是為研制可應用于生產的促進魚類攝食和生長的高新產品及技術打下基礎，以實現育苗早期成活率的大幅度提高，就必將有利于推動海水魚類養殖大產業向集約化、可持續、環境友好型的方向發展。技術實現要素：本發明的目的是提供了一種大菱鲆增食欲素Orexin基因、重組蛋白及其制備方法。本發明構建了含有大菱鲆增食欲素Orexin基因的重組表達載體，并將其轉入表達菌株進行表達，經純化獲得大菱鲆增食欲素重組蛋白。為實現上述發明目的，本發明采用以下技術方案予以實現：本發明提供了一種大菱鲆增食欲素Orexin，所述大菱鲆增食欲素Orexin的氨基酸序列如SEQIDNO:1所示。本發明提供了編碼所述的大菱鲆增食欲素Orexin的Orexin基因，所述Orexin基因的核苷酸序列如SEQIDNO:2所示。進一步的：克隆所述Orexin基因所需的引物F1和R1序列如下：F1:5′-TGGGCAAGCGGGAGGAGGATGAGYAT-3′；R1:5′-ATRCTCATCCTCCTCCCGCTTGCCCA-3′。本發明提供了含有所述的Orexin基因的重組表達載體。進一步的：所述重組表達載體為pET-24a-SL，其制備過程為：使用正向引物F和反向引物R，通過PCR擴增獲得所述Orexin基因，并在Orexin基因的兩端分別添加XhoI和EcoRI酶切位點，將該核苷酸序列經過限制性內切酶XhoI和EcoRI酶切后，插入pET-24a(+)表達載體XhoI和Eco4RI酶切位點之間，獲得重組表達載體pET-24a-orexin。進一步的：所述正向引物F和反向引物R序列如下：F:5′-CCGGAATTCATGACTCCCCTTCACAAAAAG-3′；R:5′-CCGCTCGAGCACAGGAAGGGGTGTTGTGATG-3′；PCR擴增的反應條件為：95℃5min；95℃35s，55℃退火35s，72℃延伸1min，35個循環。本發明提供了所述的大菱鲆增食欲素Orexin重組蛋白的制備方法，所述制備方法包括如下步驟：（1）將重組表達載體pET-24a-orexin轉化大腸桿菌，將挑取的陽性克隆菌株接種于含有卡那霉素的LB液體培養瓶中，37℃振蕩培養過夜，次日轉接到含有LB培養基的發酵罐中，37℃培養到OD600=0.5~1.0時，加入IPTG誘導重組蛋白表達，離心收集細菌培養物；（2）將誘導表達后的細菌培養物重懸于裂解液中，超聲破碎，將超聲破碎的細胞裂解液離心，收集沉淀即為包涵體，使用包涵體洗滌液洗滌包涵體；用溶解緩沖液溶解包涵體，4℃放置過夜；室溫下離心；將上述溶液滴加到緩沖液，將稀釋后的包涵體溶液裝入透析袋中，4℃透析過夜；（3）利用低壓層析系統，將透析后的包涵體溶液上樣至Ni柱；收集洗脫后的蛋白流出液；裝入透析袋中，放入緩沖液中，透析過夜；獲得純化后的增食欲素Orexin重組蛋白。進一步的：所述步驟（1）中IPTG的濃度為0.5~0.7mmol/L，誘導表達的時間為3~5h。進一步的：所述步驟（3）中透析后的包涵體溶液以0.5ml/min流速上樣至Ni-IDA-SepharoseCL-6B親和層析柱。本發明的優點和技術效果是：本發明利用分子生物學手段獲得大菱鲆增食欲素Orexin的成熟肽編碼序列，通過構建重組大菱鲆增食欲素Orexin的原核表達載體，轉化表達宿主菌，誘導菌體表達，收集菌體及純化獲得重組表達的大菱鲆增食欲素Orexin重組蛋白。本發明可用于制備ELISA試劑盒和飼料添加劑等產品，將為研究大菱鲆的食欲調控機理和開發可應用于生產的促進魚類攝食和生長的新產品打下良好基礎。附圖說明圖1：表達載體pET-24a-orexin示意圖。圖2：重組表達載體pET-24a-orexin的雙酶切核酸電泳圖；其中：LaneM：DL2,000DNAMarker；Lane1：重組表達載體雙酶切產物。圖3：SDS-PAGE分析重組大菱鲆增食欲素（Orexin）蛋白表達情況，其中：LaneM：蛋白分子質量標準。圖4：SDS-PAGE分析純化的大菱鲆增食欲素（Orexin）重組蛋白，其中：LaneM：蛋白分子質量標準；Lane1：經Ni柱純化后的大菱鲆Orexin重組蛋白。具體實施方式下面結合附圖和具體實施例對本發明的技術方案做進一步詳細的說明。1、大菱鲆下丘腦總RNA提取大菱鲆下丘腦總RNA提取采用的EasyPureTMRNAKit動物組織提取試劑盒(北京全式金生物技術有限公司提供)。具體操作方法如下：1）取20mg左右下丘腦組織，快速用液氮速凍組織，用研磨杵將組織研磨成粉未，將粉未轉移到1.5ml離心管中加入0.6mlBindingBuffer和15mlProteinaseK，混勻后56℃處理20分鐘。2）室溫12000r/min離心5分鐘吸上清于RNase-free的離心管中，向上清中加入等倍體積70%乙醇。3）徹底混勻，將得到的沉淀和溶液一起加入離心柱中，12000r/min離心30秒，棄掉流出液。4）向離心柱中加500mlCB4（CleanBuffer4），室溫12000r/min離心30秒，棄掉流出液。然后向離心柱中加入80ml的DNaseI工作液，室溫放置15分鐘.5）重復步驟2）一次。6）加500mlWB4（WashBuffer4）室溫12000r/min離心30秒，棄掉流出液。7）重復步驟4）一次。8）室溫12000r/min離心2分鐘，徹底去除殘留的乙醇，在室溫中靜置數分鐘徹底晾干離心柱。9）將離心柱放入一個新的1.5mlRNase-free的管中，并向離心柱中央加入50mlRNase-freeWater,,室溫靜置1分鐘。10）室溫12000r/min離心2分鐘，用45ml洗脫液洗脫RNA。11）取5mlRNA樣品在2.0%的瓊脂糖凝膠中電泳，EB染色觀察結果。再取2mlRNA樣品在NanoDrop2000c分光光度計檢測RNA的濃度和純度。2、大菱鲆增食欲素（Orexin基因全長序列RACE克隆1）3’RACE擴增大菱鲆增食欲素Orexin基因cDNA下游序列使用SMARTRACE試劑盒以及特異引物F1（SEQIDNO:3）和試劑盒中的3’CDS通用引物,進行3’RACE擴增。反應條件如下：95°C預變性5min：以下重復30個循環：95°C變性35s，54°C退火35s，72°C延伸50S；最后72°C延伸10min。3’RACE擴增PCR體系：反應體系反應體積（20μl）2×PCRMix10μlddH2O7μlF11μl3’CDS1μlcDNA1μl2）5’RACE擴增大菱鲆增食欲素Orexin基因cDNA上游序列使用SMARTRACE試劑盒以及特異引物R1（SEQIDNO:4）和試劑盒中的5’Oliogo通用引物,進行5’RACE擴增。反應條件如下：95°C預變性5min：以下重復35個循環：95°C變性35s，52°C退火35s，72°C延伸40min；最后72°C延伸10min。F1:5′-TGGGCAAGCGGGAGGAGGATGAGYAT-3′（SEQIDNO:3）；R1:5′-ATRCTCATCCTCCTCCCGCTTGCCCA-3′（SEQIDNO:4）。5’RACE擴增PCR體系：反應體系反應體積（20μl）2×PCRMix10μlddH2O7μlR11μl5’Oliogo1μlcDNA1μl3）用2.0%瓊脂糖凝分離PCR擴增得到DNA片段,并利用膠回收試劑盒（北京天根生化科技有限公司）純化分離得到目的DNA片段,然后亞克隆到pMD18-載體上，挑選陽性克隆委托上海生工進行測序，獲得核苷酸序列如SEQIDNO:2所示的Orexin基因，編碼產生的大菱鲆增食欲素Orexin的氨基酸序列如SEQIDNO:1所示。3、大菱鲆增食欲素Orexin的蛋白重組表達質粒構建1）以大菱鲆下丘腦總RNA反轉錄cDNA為模板，以帶有酶切位點和保護堿基的引物：正向引物F和反向引物R為引物進行PCR擴增。反應條件為：95℃5min；95℃35s，55℃退火35s，72℃延伸1min，35個循環。正向引物(F):Forward5’-CCGGAATTCATGACTCCCCTTCACAAAAAG-3’（SEQIDNO:5）；反向引物(R)：Forward5’-CCGCTCGAGCACAGGAAGGGGTGTTGTGATG-3’（斜體CCG為保護堿基；下劃線GAATTC為Xhol位點；下劃線CTCGAG為EcoR1位點）（SEQIDNO:6）。2）克隆得到編碼大菱鲆增食欲素（Orexin）基因蛋白的cDNA序列并且兩端分別帶有XhoI和EcoRI酶切位點，將該序列經過限制性內切酶XhoI和EcoRI酶切后，插入pET-24a(+)表達載體XhoI和EcoRI酶切位點之間，獲得重組表達載體pET-24a-orexin。表達載體示意圖如圖1所示，大菱鲆增食欲素Orexin基因的cDNA序列經XhoI和EcoRI雙酶切后的電泳結果如圖2所示。4、大菱鲆增食欲素（Orexin）重組蛋白在大腸桿菌中的表達將重組表達載體pET-24a-orexin轉化大腸桿菌BG21，挑選陽性克隆，測序正確后，將挑取的BG21菌株接種于含有卡那霉素的LB液體培養瓶中，37℃振蕩培養過夜，次日按1:100~1:500(V/V)轉接到含有10LLB培養基的15L的發酵罐中，37℃培養到OD600=0.5~1.0時，按濃度0.5~0.7mmol/L加入IPTG誘導3~5h，6000rpm離心10min，收集細菌培養物放到置于-20℃保存。采用SDS-PAGE分析重組大菱鲆Orexin蛋白表達情況，結果如圖3所示。5、大菱鲆增食欲素（Orexin）重組包涵體蛋白的變復性將誘導表達后的菌體沉淀重懸于裂解液Lysisbuffer(20mMTris-HClcontaining1mMPMSFandbacteriaproteaseinhibitorcocktail,pH8.0)中，超聲破碎，將超聲破碎的細胞裂解液4℃10000g離心20min，收集沉淀即為包涵體，使用包涵體洗滌液(20mMTris，1mMEDTA，2M尿素，1MNaCl，1％TritonX-100，pH8.0)洗滌包涵體3-5次；用溶解緩沖液(20mMTris，5mMDTT，8M尿素pH8.0)，按一定比例溶解包涵體，4度放置過夜；室溫，15000rpm離心15min；將上述溶液滴加20mMTris-HCL5mMEDTABufferPH7.8緩沖液中，逐步成倍梯度稀釋緩慢攪拌，剪取處理好適量長度的透析袋，在純水中沖洗，將蛋白溶液裝入透析袋中，放入1*PBS（PH7.4）緩沖液中，4℃透析過夜。6、大菱鲆增食欲素（Orexin）重組蛋白的Ni柱親和純化利用低壓層析系統，將透析后的包涵體溶液以0.5ml/min流速上樣至Ni-IDABinding-Buffer預平衡的Ni-IDA-SepharoseCL-6B親和層析柱；用Ni-IDABinding-Buffer以0.5ml/min流速沖洗，至流出液OD280值到達基線；用Ni-IDAWashing-Buffer(20mMTris-HCl，20mM咪唑，0.15MNaCl，pH8.0)以1ml/min流速沖洗，至流出液OD280值到達基線；用Ni-IDAElution-Buffer(20mMTris-HCl，250mM咪唑，0.15MNaCl，pH8.0)以1ml/min流速洗脫目的蛋白，收集蛋白流出液；剪取處理好適量長度的透析袋，在純水中沖洗，將上述收集的蛋白溶液裝入透析袋中，放入1*PBS（PH7.4）緩沖液中，4℃透析過夜；分步收集洗脫液，檢測純度和含量。分別取3μL未純化包涵體蛋白、3μL變復性的蛋白和1μL洗脫的純化產物與蛋白質分子量標準進行12％的聚丙烯酰胺凝膠電泳，經考馬斯藍染色后，于凝膠成像系統觀察重組蛋白純化效果，結果見圖4所示。經親和層析法純化后獲得純化的重組蛋白，收集后作為樣品備用。以上實施例僅用以說明本發明的技術方案，而非對其進行限制；盡管參照前述實施例對本發明進行了詳細的說明，對于本領域的普通技術人員來說，依然可以對前述實施例所記載的技術方案進行修改，或者對其中部分技術特征進行等同替換；而這些修改或替換，并不使相應技術方案的本質脫離本發明所要求保護的技術方案的精神和范圍。SEQUENCELISTING<110>中國水產科學研究院黃海水產研究所<120>一種大菱鲆增食欲素Orexin基因、重組蛋白及其制備方法<130><160>6<170>PatentInversion3.3<210>1<211>170<212>PRT<213>人工序列<400>1MetThrProLeuHisLysLysGlnLysMetMetMetTrpSerHisThr151015AsnLeuGlnArgMetThrProLeuHisLysLysGlnLysMetMetMet202530TrpSerHisThrAsnLeuGlnArgAlaAlaGlyMetAspProSerAsn354045LysLysValLeuValLeuValLeuThrLeuLeuLeuSerGlnLeuThr505560CysAspAlaHisSerLeuSerGluCysCysArgGlnThrSerArgSer65707580CysArgLeuTyrValLeuLeuCysArgSerGlyGlyLysAspThrGly859095GlyThrLeuAlaGlyAspAlaAlaAlaGlyIleLeuThrLeuGlyLys100105110ArgGluGluAspGluHisArgLeuHisSerArgLeuHisGlnLeuLeu115120125GlnValSerArgAsnGlnAlaAlaGlyIleLeuThrMetGlyLysArg130135140ThrGluGluSerAlaGlyGlyArgTyrMetAspTrpMetAlaArgSer145150155160GlyValThrIleThrThrProLeuProVal165170<210>2<211>453<212>DNA<213>人工序列<400>2atgactccccttcacaaaaagcagaagatgatgatgtggtcccacaccaacctccagaga60gctgctgggatggacccgtccaacaagaaagtcctggtgctcgtcttgacgttgctgctg120tcccagctgacctgcgacgctcacagcctgtctgagtgctgcagacaaacgtcccgctcc180tgtcgcctttacgtgttgctgtgtcgctccggcggaaaggacacgggggggacgctcgca240ggagacgccgccgctggcatcctcaccctgggcaagcgggaggaggatgagcatcgcctg300cacagccgactccaccagctcctgcaggtctccaggaaccaggcggccgggatcctgacg360atggggaagaggacagaggagagcgctggagggcggtacatggactggatggctcgatcg420ggggtcaccatcacaacaccccttcctgtgtga453<210>3<211>26<212>DNA<213>人工序列<400>3tgggcaagcgggaggaggatgagyat26<210>4<211>26<212>DNA<213>人工序列<400>4atrctcatcctcctcccgcttgccca26<210>5<211>30<212>DNA<213>人工序列<400>5ccggaattcatgactccccttcacaaaaag30<210>6<211>31<212>DNA<213>人工序列<400>6ccgctcgagcacaggaaggggtgttgtgatg31當前第1頁1 2 3