一種乳腺癌體外三維細胞模型的建立及其在藥物耐藥機制、逆轉劑篩選研究中的應用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及一種乳腺癌體外三維細胞模型的建立及其在藥物耐藥機制、逆轉劑篩選研究中的應用。運用“3D no base and embedded”方法將一定量的人乳腺癌MCF-7細胞種植在Millicell細胞培養(yǎng)小室上，通過培養(yǎng)形成厚度約為40μm，層數(shù)達到10～12層的人乳腺癌MCF-7細胞的三維多層細胞模型。在MCF-7多層細胞模型上單用及聯(lián)用P-GP抑制劑LY335979對化療藥物阿霉素的轉運動力學及攝取行為考察證明其在培養(yǎng)過程中發(fā)生耐藥現(xiàn)象；并將其應用于阿霉素耐藥逆轉劑人參皂苷20(S)-Rh2的篩選。
【專利說明】一種乳腺癌體外三維細胞模型的建立及其在藥物耐藥機制、逆轉劑篩選研究中的應用

【技術領域】
[0001]本發(fā)明涉及腫瘤體外模型【技術領域】，具體涉及一種乳腺癌體外三維細胞模型的建立及其在藥物耐藥機制、逆轉劑篩選研究中的應用。

【背景技術】
[0002]單層細胞模型作為現(xiàn)今主流的體外研究模型，卻存在著與在體實體瘤很大的差異，直接導致了藥物篩選與預測的失敗。三維細胞培養(yǎng)技術是介于單層細胞培養(yǎng)與動物實驗之間的一種技術，可用于研究細胞與細胞之間、細胞與細胞基質之間的相互作用及腫瘤微環(huán)境對于細胞分化、增殖、凋亡及基因表達的影響。它與傳統(tǒng)的二維平面細胞培養(yǎng)相比，能夠更真實的模擬實體瘤的結構，彌補了體外細胞培養(yǎng)與在體研究的差異。
[0003]現(xiàn)有的三維細胞模型包括多層細胞模型(multicellular layers, MCL)及多球體細胞模型(multicellular spheroid, MCS)。常用的培養(yǎng)方法包括自發(fā)性細胞聚集、基質涂布培養(yǎng)、轉瓶法、支架輔助培養(yǎng)法、旋轉細胞生物反應器等。多層細胞模型與球體細胞模型相比，能夠直接定量的測定藥物的轉運動力學行為而不受藥物需要熒光標記的限制等優(yōu)點。運用三維多層細胞模型來研究藥物的轉運、分布特征，為新藥篩選、抗腫瘤藥物的新機制研究提供指導作用。
[0004]多藥耐藥(MDR)往往是導致臨床化療治療失敗的主要原因之一。MDR有兩種不同的表型，一種是對第一次化療就產生耐藥，稱天然性耐藥(Natural resistance)或稱內源性耐藥(Intrinsic resistance);另一種是在化療過程中產生耐藥,故稱獲得性耐藥(Aquired resistance)。與單層細胞相比,腫瘤細胞培養(yǎng)形成多細胞三維模型時,往往表現(xiàn)的更為耐藥，此現(xiàn)象又被稱為“多細胞耐藥(Mult1-cellular resistance)”。這一現(xiàn)象發(fā)生的機制是多方面的，包括藥物轉運外排泵的高表達而導致細胞動力學改變；細胞周期的改變；抗凋亡作用；一些生長因子及蛋白的高表達；缺氧或PH值低等腫瘤微環(huán)境的改變。
[0005]近年來國內外對天然藥物逆轉腫瘤耐藥的研究取得了一定的進展，一些植物多酚、黃酮、萜類等成分都具有逆轉腫瘤耐藥的功效。中藥逆轉腫瘤耐藥具有毒副作用小，作用靶點多，在逆轉腫瘤耐藥的同時，往往還具有直接抗腫瘤、調節(jié)免疫功能等多種活性，更能從多角度綜合治療腫瘤，提高化療的整體治療水平。因此，從傳統(tǒng)中藥中篩選出活性成分開發(fā)成腫瘤化療增敏劑，具有很好的臨床開發(fā)前景。人參皂苷20 (S)-Rh2是由日本學者Kitagawa在1983年首次從紅參中分離得到并確定分子式的，含量極低，提取率僅為
0.001%。20 (S)-Rh2具有達瑪烷結構，屬于原人參二醇型皂苷。前期實驗研究結果表明人參皂苷20(S)-Rh2為外排轉運體P-GP的非競爭性抑制劑。


【發(fā)明內容】

[0006]本發(fā)明的目的是建立一種人乳腺癌三維細胞模型，證明其在培養(yǎng)過程中發(fā)生耐藥，基于該模型對抗腫瘤藥物的轉運動力學進行研究，并將其應用于耐藥逆轉劑的篩選。運用“3D no base and embedded”方法將一定量的人乳腺癌MCF-7細胞種植在Millicell細胞培養(yǎng)小室上，通過培養(yǎng)形成厚度約為40 μ m，層數(shù)達到10?12層的人乳腺癌MCF-7細胞的三維多層細胞模型。在MCF-7單層細胞上，單用阿霉素組及聯(lián)用P-GP特異性抑制劑LY335979組的轉運動力學曲線及阿霉素的藥物攝取量并沒有差異。而在MCF-7多層細胞上，聯(lián)用P-GP特異性抑制劑LY335979組轉運曲線明顯低于單用阿霉素組，并且多層細胞對于阿霉素的攝取量顯著性減少并被LY335979有效逆轉。上述結果證明多層細胞培養(yǎng)過程中發(fā)生耐藥。進一步，將構建的MCF-7多層細胞運用于阿霉素耐藥逆轉劑人參皂苷20(S)-Rh2的篩選，聯(lián)用20(S)-Rh2組與單用阿霉素組相比，轉運曲線明顯降低且對阿霉素的攝取量顯著性增加。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0007]圖1 ;人參皂苷20(S)_Rh2的結構式。
[0008]圖2 ；A, MCF-7單層細胞HE染色形態(tài)圖。B，MCF-7多層細胞HE染色形態(tài)圖。
[0009]圖3 ;A，阿霉素聯(lián)用LY335979在MCF-7單層細胞轉運動力學曲線。B，阿霉素聯(lián)用LY335979在MCF-7多層細胞轉運動力學曲線。C，阿霉素聯(lián)用LY335979在MCF-7單層細胞及多層細胞上的攝取。
[0010]圖4 ;A，阿霉素聯(lián)用人參皂苷Rh2在MCF-7多層細胞轉運動力學曲線。B，阿霉素聯(lián)用人參皂苷20 (S)-Rh2在MCF-7多層細胞上的攝取。

【具體實施方式】
[0011]實施例1:構建乳腺癌MCF-7三維多層細胞轉運模型
[0012]實驗材料:
[0013]人乳腺癌細胞MCF-7細胞由天津血液病研究所提供，于37°C，5% CO2條件下常規(guī)培養(yǎng)，培養(yǎng)基為含10%小牛血清(PAA)的RPMI1640 (Gibeo)。胎牛血清(Fetal bovineserum)購于 Hyclone (Logan, Utah, USA);膜蛋白酶(Trypsin)購于 Amersco (Solon,Oh1, USA);青霉素、鏈霉素購于南京生興生物工程公司(江蘇)；Matrigel購于BDB1sciences (USA), Millicell 細胞培養(yǎng)小室購于 Millipore (Merck Millipore, USA).鹽酸阿霉素粉末(純度> 99% )購于南京盛林化工(江蘇)；LY335979購于SelleckChemicals(USA);人參皂苷20 (S)-Rh2 (純度> 98% )購自吉林大學藥學院有機化學教研室(吉林，中國)。
[0014]實驗方法:
[0015]MCF-7細胞消化、計數(shù)，用含6% Matrigel的預冷無血清RPMI1640培養(yǎng)基重懸細胞。以2*105 cells/孔的密度接種于24孔Millicell細胞培養(yǎng)小室中。冰上靜置30min后放入37°C ,5% CO2的孵箱中培養(yǎng)4h。待膠液凝固后，內外室分別補加400ul及600ul 10%含血清的RPMI1640培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)十天，并隔天換液。
[0016]實施例2:構建乳腺癌MCF-7單層細胞轉運模型
[0017]實驗材料:同實施例一
[0018]實驗方法:
[0019]MCF-7細胞消化、計數(shù)，用10 %含血清的RPMI1640培養(yǎng)基重懸細胞。以2*105cells/孔的密度、400ul的體積接種于24孔Millicell細胞培養(yǎng)小室內室中。外室補加600ull0%含血清的RPMI1640培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)至細胞形成致密單層，并隔天換液。
[0020]實施例3:轉運動力學及攝取實驗[0021 ] 實驗材料:同實施例一
[0022]實驗方法:
[0023]1.MCF-7多層細胞轉運模型及單層細胞轉運模型構建方法同實施例1及實施例2中的實驗方法
[0024]2.轉運動力學實驗
[0025]Millicell細胞培養(yǎng)小室輔助培養(yǎng)的MCF-7多層細胞及單層細胞培養(yǎng)成熟后，細胞培養(yǎng)小室用PBS液清洗兩次。上、下室分別加入400ul、600ul Hank’s平衡鹽溶液(HBSS) 37 °C平衡lOmin。分為三組進行預給藥:0.1 % DMSO組；LY335979 (I μ M)組及20(S)-Rh2(10yM)，37°C溫孵lh。撤去上室的預給液后，上室分三組進行給藥=ADR(1yM)單用組，ADR(1yM)與 LY335979 (I μ M)聯(lián)用組及 ADR (10 μ Μ)與 20 (S)-Rh2 (10 μ Μ)聯(lián)用組給藥體積均為400111。371:搖床溫孵不同時間(15，30，45，60，9011^11)，取下室耶55液100111，并及時補齊下室體積，保持轉運過程中下室體積不改變。采用直接沉淀蛋白法提取樣品，用LC-MS/MS(AB Science, USA)進行濃度測定。
[0026]3.攝取實驗
[0027]轉運終點(90min)時，取出Millicell細胞培養(yǎng)小室的中層插片，用Iml超純水刮取細胞，反復凍融三次，定量取出lOOul，采用直接沉淀蛋白法提取樣品，用LC-MS/MS(ABScience, USA)進行濃度測定。并用Bradford法定蛋白進行蛋白校準。
【權利要求】
1.一種體外人乳腺癌MCF-7三維多層細胞模型，其特征在于:運用“3D no base andembedded”方法將一定量的人乳腺癌MCF-7細胞種植在Millicell細胞培養(yǎng)小室上，通過十天的培養(yǎng)形成厚度約為40 μ m，層數(shù)達到10?12層的人乳腺癌MCF-7細胞的三維多層細胞模型。
2.如權利要求1所述的體外人乳腺癌MCF-7三維多層細胞模型對抗腫瘤藥物的轉運動力學及攝取行為的評價，其特征在于:多層細胞在培養(yǎng)過程中發(fā)生耐藥。
3.如權利要求2所述的體外人乳腺癌MCF-7三維多層細胞模型的轉運動力學及攝取研究在抗腫瘤藥物耐藥逆轉劑篩選的應用，其特征在于:聯(lián)用耐藥逆轉劑組與單用抗腫瘤藥物組相比，轉運曲線明顯降低且對抗腫瘤藥物的攝取量顯著性增加。
【文檔編號】C12Q1/02GK104232584SQ201410471270
【公開日】2014年12月24日 申請日期:2014年9月15日 優(yōu)先權日:2014年9月15日
【發(fā)明者】王廣基, 張經緯, 魯萌, 周芳 申請人:中國藥科大學