專利名稱：制備永久人細(xì)胞系的方法
制備永久人細(xì)胞系的方法本發(fā)明涉及一種制備永久人細(xì)胞系的方法，其中用允許至少 一種細(xì)胞 轉(zhuǎn)化因子表達(dá)的序列和允許至少一種重組多肽表達(dá)的序列同時(shí)轉(zhuǎn)染分離的 原代人細(xì)胞。用于治療、診斷或技術(shù)目的的重組多肽在細(xì)胞培養(yǎng)(體外)中的制備，通 常在穩(wěn)定、持久或永久性建立的、其中編碼所述多肽的核酸整合到細(xì)胞染色體DNA中的細(xì)胞系(所謂生產(chǎn)細(xì)胞系)中實(shí)施。這些生產(chǎn)細(xì)胞系尤其必須 展現(xiàn)兩種特征性質(zhì)首先，它們必須持久(永久性)地在細(xì)胞培養(yǎng)中生長并且 能夠增殖，其次，它們必須表達(dá)編碼期望多肽的基因，而該多肽隨后能夠 從細(xì)胞或者從培養(yǎng)上清液中分離。除了細(xì)菌之外，特別地，使用酵母和植 物細(xì)胞、動(dòng)物細(xì)胞來制備重組多肽。當(dāng)前全部治療用蛋白質(zhì)中大約60-70% 是在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中制備的(Wurm, Nat. Biotechnology 22, 1393-1398， 2004)。生產(chǎn)細(xì)胞的制備通常開始于已經(jīng)被永生化或轉(zhuǎn)化，在細(xì)胞培養(yǎng)中永 久生長和增殖的細(xì)胞系，例如來源于動(dòng)物的CHO (中國倉鼠卵巢細(xì)胞)、BHK (幼倉鼠腎)細(xì)胞、NS0 (小鼠骨髓瘤)細(xì)胞或人HEK293 (人胚胎腎)細(xì)胞或 PER,C6纟田月包。這些細(xì)胞系同時(shí)已經(jīng)商品化，它們是從原代細(xì)胞通過培養(yǎng)生 成的，實(shí)質(zhì)上是作為通過遺傳操作的生產(chǎn)細(xì)胞建立方法的第一步；或者是 從自然腫瘤分離的。在產(chǎn)生實(shí)際的生產(chǎn)細(xì)胞的情況下， 一方面，通過轉(zhuǎn)染將編碼重組多肽 的核酸(所謂轉(zhuǎn)基因)與必要的轉(zhuǎn)錄調(diào)控元件一同轉(zhuǎn)移到這些已經(jīng)建立的細(xì) 胞系中，另一方面，轉(zhuǎn)移第二表達(dá)盒，該表達(dá)盒具有編碼選擇標(biāo)記的基因， 其基因產(chǎn)物為細(xì)胞提供特定的選擇優(yōu)勢。基因轉(zhuǎn)移后在沒有選擇試劑的培 養(yǎng)基中培育細(xì)胞數(shù)天，然后給培養(yǎng)基提供合適的選擇試劑。在選擇試劑的 存在下，只有攝取了用于轉(zhuǎn)染的核酸并表達(dá)選擇標(biāo)記的細(xì)胞方可生存和生 長。常用的選擇標(biāo)記有新霉素抗性基因、潮霉素抗性基因和二氫葉酸還原 酶(DHFR) (Wurm, Nat Biotechnology 22:1393-1398, 2004; Wurm and Jordan, 309-333 in: Makrides (Eds.)， Gene Transfer and Expression in Mammalian Cells， Elsevier, Amsterdam, 2003)。
相應(yīng)地分別在含有選擇試劑，例如新霉素或潮霉素等抗生素，和含有合成糖皮質(zhì)素甲氨蝶呤的培養(yǎng)基中進(jìn)行選擇。對于 經(jīng)過選擇過程后存活并增殖的、具有選擇標(biāo)記和轉(zhuǎn)基因的細(xì)胞(即所謂轉(zhuǎn)化體)， 一般隨后加以個(gè)體化(individualised)(克隆)以保證培養(yǎng)物中所有的細(xì)胞 是遺傳上同 一的，并將具有最佳產(chǎn)率的期望生產(chǎn)細(xì)胞系與生產(chǎn)力較差的細(xì) 胞系分開。取決于制備過程，可能不但在選擇期中，而且在后來克隆細(xì)胞的生長 過程中均必須向培養(yǎng)基中加入選擇試劑，以保證生產(chǎn)細(xì)胞系的遺傳穩(wěn)定性。 期望多肽的基因(轉(zhuǎn)基因)和選擇標(biāo)記的基因通常整合到細(xì)胞基因組的相同 位點(diǎn)中。如果在隨后的細(xì)胞擴(kuò)增中或制備期中沒有選擇壓力，則會(huì)發(fā)生細(xì) 胞喪失選擇標(biāo)記一也隨之喪失期望多肽的轉(zhuǎn)基因一的危險(xiǎn)。通過持續(xù)添加 選擇試劑來防止這種危險(xiǎn)。從生物體或組織取出后投入細(xì)胞培養(yǎng)的原代動(dòng)物和人細(xì)胞通常只能短 期生長并經(jīng)過少數(shù)幾次傳代。人細(xì)胞特別適于制備人生物治療劑，因?yàn)榕c 其它生物哺乳動(dòng)物或動(dòng)物細(xì)胞相反，它們可表達(dá)具有真實(shí)的翻譯后修飾模 式的復(fù)雜多肽。與在非人生產(chǎn)系統(tǒng)中生產(chǎn)相比，在使用人細(xì)胞生產(chǎn)的情況 下，復(fù)雜的重組蛋白的糖基化模式(即分子內(nèi)糖殘基的結(jié)構(gòu)和構(gòu)象)會(huì)更好地 重現(xiàn)真實(shí)人多肽的模式。該糖基化模式在很多時(shí)候?qū)τ诙嚯牡闹匾再|(zhì)例 如生物學(xué)活性、穩(wěn)定性、溶解性和免疫原性而言具有決定性的重要性。從患者的腫瘤組織分離了可用于表達(dá)重組多肽的、持久建立的人細(xì)胞 系(永久人細(xì)胞系)(例如HeLa細(xì)胞)。但是，出于安全性相關(guān)的考慮，同時(shí) 由于它們的遺傳不穩(wěn)定性，這樣的細(xì)胞不適合應(yīng)用于人體的治療用多肽的 工業(yè)生產(chǎn)。除了極少的例夕卜(例如所謂HaCaT細(xì)胞)，自發(fā)永生化的人細(xì)胞 系事實(shí)上是不可得到的。相反，用特定病毒基因產(chǎn)物轉(zhuǎn)化原代組織而產(chǎn)生 的永久人細(xì)胞系則適用于生物技術(shù)生產(chǎn)的目的。通過表達(dá)DNA病毒的轉(zhuǎn)化 性多肽，可以將原代細(xì)胞轉(zhuǎn)化為永久生長的細(xì)胞。轉(zhuǎn)化的機(jī)制需要病毒編 碼的基因產(chǎn)物與在細(xì)胞分裂調(diào)控中起作用的細(xì)胞蛋白(所謂腫瘤抑制基因產(chǎn) 物)相互作用。由此，細(xì)胞周期的停滯(G0/G1期)被打斷，細(xì)胞進(jìn)入S期， 導(dǎo)致細(xì)胞的失控增殖(Helt & Falloway， Carcinogenesis 24:159-169, 2003)。此 類具轉(zhuǎn)化性的、由病毒編碼的基因產(chǎn)物的例子有猿猴病毒40 (SV40)的T抗 原、人乳頭瘤病毒(HPV)的E6/E7或者腺病毒的E1A/E1B。這些病毒蛋白質(zhì) 的轉(zhuǎn)化機(jī)制是類似的T抗原、E6和E1A使細(xì)胞視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤蛋白家族(pRb)的基因產(chǎn)物失活，T抗原、E7和ElB使細(xì)胞腫瘤抑制蛋白p53失活(zur Hausen, J. Natl. Cancer Inst, 92, 690-698, 2000; Ludlow, FASEB J. 7: 866-871， 1993; Moran， FASEB J. 7, 880-885， 1993的綜述)。如此轉(zhuǎn)化的這些細(xì)胞系變 得可以永久培養(yǎng)，特別適用于生物技術(shù)生產(chǎn)目的。迄今為止只有極少數(shù)人細(xì)胞類型已被腺病毒E1基因區(qū)域所轉(zhuǎn)化。其中 包括人胚胎腎組織的神經(jīng)元細(xì)胞(HEK293) (Graham et al.， J. Gen. Virol. 36:59-74, 1977)、人胚胎視網(wǎng)膜細(xì)胞(EP 833 934 Bl)和人羊水細(xì)胞(EP 1 230 354 Bl)。上述分別基于現(xiàn)有永生化細(xì)胞系和轉(zhuǎn)化細(xì)胞系的生產(chǎn)細(xì)胞系制備方法 從不同方面帶來了缺陷。在制備之前，在選擇期間，可能還在擴(kuò)增期間向 培養(yǎng)基添加抗生素、化療劑或其它選擇試劑，會(huì)增加制備方法的成本。除 此之外，還需要在分析制備過程中進(jìn)行繁重的分析工作，并對終產(chǎn)物進(jìn)行 分析，來確保和證實(shí)經(jīng)過純化和調(diào)制(confectioned)的終產(chǎn)物沒有保留任何殘 余的選擇試劑。這就對質(zhì)量控制提出了進(jìn)一步的要求，以保證治療用制劑 的安全性。另外， 一些已被應(yīng)用的選擇試劑分別對生產(chǎn)細(xì)胞的質(zhì)量和克隆 穩(wěn)定性顯示影響。例如，在一些生產(chǎn)細(xì)胞系中，向培養(yǎng)物中連續(xù)添加曱氨 蝶呤作為選擇試劑，可以使細(xì)胞在其生產(chǎn)能力上維持被施予的"穩(wěn)定，，表 型。但是，遺傳分析已經(jīng)顯示，這種試劑的存在可增加細(xì)胞的細(xì)胞遺傳異 質(zhì)性，這是人們所不希望的，尤其是對于認(rèn)證過程的監(jiān)管要求而言(Wurmet al" Dev. Biol. Stand. 76:69-82, 1992; Kim and Lee, Biotechnol. Bioeng. 64:741-749， 1999)。經(jīng)典的生產(chǎn)細(xì)胞系產(chǎn)生方法的另 一個(gè)缺陷體現(xiàn)在這一事 實(shí)，作為生成方法的基礎(chǔ)的現(xiàn)有永久性起始細(xì)胞系的選擇是極為有限的(例 如CHO， BHK， HEK293)。所有這些細(xì)胞在^皮開發(fā)成生產(chǎn)細(xì)胞系之前都已經(jīng) 歷多年培養(yǎng)和無數(shù)次傳代并被保存。這些操作總是帶有這樣的危險(xiǎn)，即除了最初永生化必需的遺傳改變之外還積累其它染色體異常和遺傳修飾，使 它們越來越不像各自的"天然"動(dòng)物和人起始細(xì)胞。這些變化對于重組蛋 白基因工程的安全性相關(guān)和/或生產(chǎn)技術(shù)方面可能造成的后果至今還沒有得 到詳細(xì)的分析。因此，作為本發(fā)明基礎(chǔ)的問題是提供一種更筒單、更劃算，并且在毒 性方面更為安全的方法，來制備用于生產(chǎn)重組多肽的永久人細(xì)胞系。 該問題通過專利權(quán)利要求中定義的主題來解決。下面的


了本發(fā)明。圖1示意性地顯示用于表達(dá)E1基因功能及腺病毒血清型5病毒結(jié)構(gòu)蛋 白pIX的質(zhì)粒pGSl 19之組成(assembly)。圖2示意性地顯示用于在巨細(xì)胞病毒(CMV)啟動(dòng)子控制下表達(dá)人a 1-抗胰蛋白酶(hAAT) cDNA的質(zhì)粒pGSl 16之組成。圖3顯示在7種不同的基于羊水細(xì)胞的人a 1-抗胰蛋白酶永久性生產(chǎn)細(xì) 胞系中針對Ad5 E1A和E1B蛋白表達(dá)的Western印跡結(jié)果。抗胰蛋白酶蛋白(hAAT)表達(dá)的Western印跡結(jié)果。A，從細(xì)胞分泌到培養(yǎng)上 清液中的hAAT; B,細(xì)胞內(nèi)的hAAT。圖5示意性地顯示培養(yǎng)上清液中由選定的生產(chǎn)細(xì)胞系所表達(dá)的人a 1-抗胰蛋白酶蛋白(hAAT)的量(ELISA，酶聯(lián)免疫吸附測定)。A，各個(gè)細(xì)胞克 隆第5代中的hAAT的量；B，選定的細(xì)胞克隆中經(jīng)過數(shù)次傳代的穩(wěn)定性。圖6顯示針對來自基于羊水細(xì)胞的生產(chǎn)細(xì)胞系的人a 1-抗胰蛋白酶蛋 白的糖基化的Western印跡分析結(jié)果。本文所用的術(shù)語"羊水細(xì)胞"以最廣泛的意義涉及存在于羊水(amniotic liquor)中，并可通過羊膜腔穿刺術(shù)(amniocentesis)獲得的所有細(xì)胞。它們或 者來源于羊膜，或者來自與羊水接觸的胎兒組織。已經(jīng)描述了可以根據(jù)形 態(tài)學(xué)標(biāo)準(zhǔn)加以區(qū)分的三類主要的羊水細(xì)胞成纖維細(xì)胞樣細(xì)胞(F細(xì)胞)、上 皮樣細(xì)胞(E細(xì)胞)和羊膜液細(xì)胞(AF細(xì)胞)(Hohn et al,, Pediat. Res. 8:746々54, 1974)。 AF細(xì)胞是主要的細(xì)胞類型。來自羊膜腔穿刺(例如為細(xì)胞遺傳學(xué)診 斷而進(jìn)行的)的細(xì)胞可充當(dāng)羊水細(xì)胞的來源。此外，對于妊娠中采耳又的羊膜 腔穿刺的細(xì)胞，如果羊水的量高于平均(羊水過多(polyhydramnion, hydramnios))，可以作為羊水細(xì)胞的來源。術(shù)語"表達(dá)盒"，具體地分別涉及這樣的核酸分子和核酸分子之區(qū)域， 其分別含有位于編碼區(qū)域之前的調(diào)控元件或者啟動(dòng)子、編碼區(qū)域和可讀 框、和位于編碼區(qū)域之后的轉(zhuǎn)錄終止元件。分別位于編碼區(qū)域之前的調(diào)控 元件和啟動(dòng)子可以是組成型的，即為永久性地活化轉(zhuǎn)錄的啟動(dòng)子(例如CMV 啟動(dòng)子)，或者為可調(diào)控的啟動(dòng)子，即可以被開啟和/或關(guān)閉的啟動(dòng)子(例如 四環(huán)素可調(diào)控的啟動(dòng)子)。表達(dá)盒的編碼序列可以是連續(xù)的可讀框，如同5， 端具有起始密碼子、3，端具有終止密碼子的cDNA那樣。編碼區(qū)域可以由編碼外顯子及間插的非編碼內(nèi)含子的基因組排列或者新組合的排列所構(gòu)成。但是，表達(dá)盒的編碼區(qū)域可以由數(shù)個(gè)可讀框構(gòu)成，它們之間由所謂IRE(內(nèi)部核糖體進(jìn)入位點(diǎn))隔開。術(shù)語"永久細(xì)胞系"(permanent cell lines),如本文所用的，涉及以這樣 的方式被遺傳修飾，使其可以在細(xì)胞培養(yǎng)中于穩(wěn)定的培養(yǎng)條件下永久持續(xù) 生長的細(xì)胞。這樣的細(xì)胞又稱為永生化(immotalized)細(xì)胞。術(shù)語"多肽，，或者"重組多肽"，如本文所用的，涉及由至少2個(gè)氨 基酸組成的肽。多肽可以受到共翻譯修飾和/或后翻i斧修飾，例如通過附接 糖殘基或通過修飾氨基酸殘基而修飾。多肽可以是線性、環(huán)狀或分枝的。 另外，多肽可由多于一條氨基酸鏈組成，其中這些鏈可以通過分子內(nèi)和/或 分子間4定而形成或多或少的復(fù)雜三維結(jié)構(gòu)(例如二級(jí)、三級(jí)、四級(jí)結(jié)構(gòu))。如 果多肽是由 一條氨基酸鏈構(gòu)成的，它也可以通過分子內(nèi)鍵形成或多或少的 復(fù)雜三維結(jié)構(gòu)。多肽可以是藥理學(xué)或免疫學(xué)活性的多肽，或者是用于診斷 目的的多肽。術(shù)語"原代細(xì)胞，，，如本文所用的，涉及通過直接從生物體或組織移 出并置于培養(yǎng)中而獲得的細(xì)胞。原代細(xì)胞僅顯示很有限的壽命。原代細(xì)胞 可以是例如羊水細(xì)胞、神經(jīng)元細(xì)胞或視網(wǎng)膜細(xì)胞。術(shù)語"生產(chǎn)細(xì)胞系"(production cell lines),如本文所用的，涉及通過導(dǎo) 入編碼待生產(chǎn)的期望多肽的轉(zhuǎn)基因而被遺傳修飾的永久細(xì)胞系。術(shù)語"選擇標(biāo)記，，(selection marker),如本文所用的，涉及為細(xì)胞提供 在選擇條件下生長的優(yōu)勢的遺傳標(biāo)記。所述的選擇條件可以是，例如，培 養(yǎng)基中化學(xué)治療劑或抗生素或者其它細(xì)胞毒性物質(zhì)或生長干擾物質(zhì)的存 在。常用的選擇標(biāo)記是新霉素抗性基因、潮霉素抗性基因和二氫葉酸還原 酵。術(shù)語"轉(zhuǎn)染，，(transfection),如本文所用的，涉及任何適于將述及的核 酸導(dǎo)入細(xì)胞中的方法。作為例子，包括經(jīng)典的磷酸鈣法、電穿孔、任何類 型的脂質(zhì)體系統(tǒng)，以及這些方法的組合。術(shù)語"轉(zhuǎn)基因"，如本文所用的，涉及編碼重組多肽的核酸序列。 本發(fā)明的一個(gè)方面涉及一種制備永久人細(xì)胞系的方法，其中用 一種核 酸分子或者至少兩種不同的核酸分子轉(zhuǎn)染分離的原代人細(xì)胞，并且在轉(zhuǎn)染 一種核酸分子的情況下，核酸分子顯示允許至少一種細(xì)胞轉(zhuǎn)化因子表達(dá)和重組多肽表達(dá)的序列；在轉(zhuǎn)染至少兩種不同核酸分子的情況下，第一種核 酸分子顯示允許至少一種細(xì)胞轉(zhuǎn)化因子表達(dá)的序列，第二種核酸分子顯示 允許至少一種重組多肽表達(dá)的序列。通過直接從生物體或者分離自生物體的組織移出而獲得用于本發(fā)明方 法的原代人細(xì)胞，并投入培養(yǎng)。優(yōu)選的是可通過細(xì)胞轉(zhuǎn)化因子的表達(dá)而良 好地轉(zhuǎn)化為永久人細(xì)胞系的原代人細(xì)胞，尤其是羊水細(xì)胞、胚胎視網(wǎng)膜細(xì) 胞和神經(jīng)元來源的胚胎細(xì)胞。細(xì)胞轉(zhuǎn)化因子可以是SV40的T抗原(GeneBank登錄號(hào)J02400)、 HPV 的E6和E7基因產(chǎn)物(例如HPV16, GeneBank登錄號(hào)K02718)、和人腺病毒 的E1A和E1B基因產(chǎn)物(例如人腺病毒血清型5, GeneBank登錄號(hào) X02996)。如果本發(fā)明的方法使用E6和E7基因產(chǎn)物的核酸序列，則必須用 這兩種基因產(chǎn)物的序列轉(zhuǎn)染原代人細(xì)胞。如果本發(fā)明的方法使用E1A和 E1B基因產(chǎn)物的核酸序列，則必須用這兩種基因產(chǎn)物的序列轉(zhuǎn)染原代人細(xì) 胞。在通過天然存在的HPV來進(jìn)行表達(dá)的場合，可以從RNA轉(zhuǎn)錄本表達(dá) E6和E7。對于通過天然存在的腺病毒表達(dá)E1A和E1B也是如此。細(xì)胞轉(zhuǎn) 化因子(例如腺病毒E1基因功能)導(dǎo)致細(xì)胞的永生化或者轉(zhuǎn)化，從而導(dǎo)致它 們可持久培養(yǎng)的能力。未轉(zhuǎn)染的原代人細(xì)胞在培養(yǎng)中至少經(jīng)數(shù)周后即自然 死亡，而轉(zhuǎn)染的細(xì)胞則由于永生化活性(例如El基因產(chǎn)物的永生化活性)而 擴(kuò)增成為表型上可識(shí)別的細(xì)胞集落。于是，在本發(fā)明方法中，細(xì)胞轉(zhuǎn)化因 子的轉(zhuǎn)移(這種轉(zhuǎn)移對細(xì)胞的永生化是至關(guān)重要的)就擔(dān)負(fù)了選擇標(biāo)記的功 能，該選擇標(biāo)記使得人們能夠在沒有任何附加的外源化學(xué)選擇壓力的條件 下分離細(xì)胞系，其中所述細(xì)胞系表達(dá)一種或多種不同的重組多肽。因此， 本發(fā)明特別地涉及無需轉(zhuǎn)染選擇標(biāo)記的永久人細(xì)胞系制備方法。用于表達(dá)細(xì)胞轉(zhuǎn)化因子的核酸序列以表達(dá)盒的形式存在。表達(dá)盒可分別含有同源啟動(dòng)子和轉(zhuǎn)錄終止序列，例如用于表達(dá)腺病毒 E1A基因功能的天然E1A啟動(dòng)子和天然E1A聚腺苷酸化位點(diǎn)。如果轉(zhuǎn)染所 用的核酸分子含有各自病毒基因組的片段，例如顯示所述基因功能的腺病 毒基因組的片段，例如E1A、 E1B,這是可以實(shí)現(xiàn)的。細(xì)胞轉(zhuǎn)化因子的表達(dá) 盒還可含有不與所用編碼區(qū)或者轉(zhuǎn)錄終止序列 一起天然存在的異源啟動(dòng) 子。可作為異源啟動(dòng)子的有，例如CMV(巨細(xì)胞病毒)啟動(dòng)子(Makrides， 9-26 in: Makrides (Eds.), Gene Transfer and Expression in Mammalian Cells, Elsevier:Amsterdam, 2003)、 EF-1啟動(dòng)子(Kim et al., Gene 91:217-223, 1990)、 CAG啟 動(dòng)子(來自人巨細(xì)胞病毒立即早期增強(qiáng)子及具有第 一 內(nèi)含子的修飾的雞卩肌 動(dòng)蛋白啟動(dòng)子的雜合啟動(dòng)子)(Niwa et al., Gene 108:193-199, 1991)、人或鼠 pgk (磷酸甘油酸激酶)啟動(dòng)子(Adra et al., Gene 60:65-74， 1987)、 RSV (勞氏肉 瘤病毒)啟動(dòng)子(Makrides, 9-26 in: Makrides (Eds,)， Gene Transfer and Expression in Mammalian Cells, Elsevier, Amsterdam, 2003)或者SV40沐猴 病毒40)啟動(dòng)子(Makrides, 9-26 in: Makrides (Eds.)， Gene Transfer and Expression in Mammalian Cells, Elsevier, Amsterdam, 2003)。 可4乍為聚A泉香酉臾 化位點(diǎn)的有，例如SV40大T抗原(GeneBank登錄號(hào)J02400)的聚腺香酸化 位點(diǎn)或者人G-CSF (粒細(xì)胞集落刺激因子)基因的聚腺苷酸化位點(diǎn) (Mizushima and Nagata, Nucl. Acids Res. 18:5322, 1990)。同樣地，有些表達(dá) 盒可含有用于轉(zhuǎn)化因子的同源調(diào)控元件及其它異源調(diào)節(jié)元件。即，EIA表達(dá)盒可以例如顯示異源啟動(dòng)子，而E1B表達(dá)盒可顯示同源啟動(dòng)子，或者相 反；或者兩個(gè)表達(dá)盒均顯示異源啟動(dòng)子。用于表達(dá)至少一種重組多肽的核酸序列也存在于至少一種表達(dá)盒中， 其中啟動(dòng)子和轉(zhuǎn)錄終止序列的種類和選擇與上述用于細(xì)胞轉(zhuǎn)化因子的那些 對應(yīng)。細(xì)胞轉(zhuǎn)化因子和重組多肽的核酸序列，包括各自的調(diào)控元件，可以存 在于一個(gè)核酸分子上或者數(shù)個(gè)不同的核酸分子上。在本發(fā)明一個(gè)優(yōu)選的實(shí) 施方案中，包括各自調(diào)控元件的細(xì)胞轉(zhuǎn)化因子的序列，例如E6和E7基因 功能或者EIA和E1B基因功能，或者細(xì)胞轉(zhuǎn)化因子例如SV40的T抗原的 序列，存在于一個(gè)核酸分子上，而包括調(diào)控元件的重組多肽的序列存在于 不同于前一核酸分子的第二個(gè)核酸分子上。在另一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中， 細(xì)胞轉(zhuǎn)化因子E6與E7，以及E1A與E1B的序列，包括其各自的調(diào)控元件， 存在于不同的核酸分子上。在此情況下，包括調(diào)控元件的重組多肽序列可 以存在于不同于上述第一個(gè)和第二個(gè)核酸分子的第三個(gè)核酸分子上，或者 可以存在于第一個(gè)或第二個(gè)核酸分子上，構(gòu)成(comprising)所述細(xì)胞轉(zhuǎn)化因 子之一的序列。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，用含有E1A和E1B基因功能之 表達(dá)盒的第一種核酸分子和顯示重組多肽之表達(dá)盒的第二種核酸分子轉(zhuǎn)染 原代人細(xì)胞，其中第二種核酸分子不同于第一種核酸分子。在這個(gè)實(shí)施方 案中，第一種核酸分子含有E1A表達(dá)盒，該表達(dá)盒含有異源啟動(dòng)子和同源轉(zhuǎn)錄終止元件；而E1B轉(zhuǎn)錄單元含有同源啟動(dòng)子和同源轉(zhuǎn)錄終止元件。在 一個(gè)特別優(yōu)選的實(shí)施方案中，第一種核酸分子含有從核苷酸505到核苷酸 4079的腺病毒血清型 5核苷酸序列。在另 一 個(gè)特別優(yōu) 選的實(shí)施方案中，第一種核酸分子含有從核苷酸505到核苷酸3522的腺病 毒血清型5核苷酸序列。在另一個(gè)特別優(yōu)選的實(shí)施方案中，第一種核酸分 子含有從核苷酸1到核苷酸4344的腺病毒血清型5核苷酸序列，對應(yīng)于 HEK293細(xì)胞的腺病毒DNA (Louis et al., Virology 233:423-429， 1997)。在這個(gè)實(shí)施方式的情況下，E1B啟動(dòng)子和E1B聚腺苷酸化序列(核苦酸 4037-4070)的存在可能導(dǎo)致E1B的最優(yōu)轉(zhuǎn)錄和表達(dá)。另一個(gè)優(yōu)勢在于EIB 終止密碼子和EIB聚腺苷酸化位點(diǎn)之間的序列區(qū)域含有腺病毒pIX基因功 能。pIX多肽是一種病毒結(jié)構(gòu)蛋白質(zhì)，它在不同的病毒和細(xì)胞啟動(dòng)子(例如 胸苷激酶和p-珠蛋白啟動(dòng)子)上充當(dāng)轉(zhuǎn)錄活化物。如果重組多肽的編碼序列 處于上面提到的啟動(dòng)子之一的控制下，則細(xì)胞中附加表達(dá)的pIX多肽的轉(zhuǎn) 錄活化效應(yīng)可導(dǎo)致本發(fā)明的生產(chǎn)細(xì)胞系中重組多肽的表達(dá)率(expression mtes)增力口。重組多肽可以是治療用蛋白，例如人al抗胰蛋白酶或者生長因子例如 紅細(xì)胞生成素或白細(xì)胞介素-2。人al抗胰蛋白酶(hAAT)是一種蛋白酶抑制 劑，它抑制彈性蛋白酶和其它蛋白酶，在導(dǎo)致嚴(yán)重肺和肝損害的遺傳性 hAAT缺陷中具有治療活性。紅細(xì)胞生成素是紅細(xì)胞(紅血球)的重要生長因 子，在貧血的場合以及移植患者的場合具有成血(bloodforming)活性。白細(xì) 胞介素-2 (n-2)是免疫系統(tǒng)的一種細(xì)胞信使，在細(xì)胞免疫應(yīng)答活化的場合， 例如在肺瘤疾病的情況下，其具有顯著的重要性。凝血因子，例如治療具 有凝血障礙的血友病患者時(shí)使用的因子VIII和IX,也屬于治療活性多肽。 根據(jù)本發(fā)明方法的重組多肽可以是激素。在具有激素性病癥的患者的場合， 在替代療法中使用生物技術(shù)工程化的激素。例子有降低血糖的激素胰島 素，許多糖尿病患者依賴于該激素；用于治療侏儒癥的促生長素 (somatotropin ， growth hormone)，和用于治療生育障礙的促性腺因子 (gonadotrope factors)例如促卵泡激素(FSH)或黃體化激素(LSH)。重組多肽可以是重組抗體，其可用于治療或診斷目的。針對腫瘤壞死 因子a (TNF-a)的抗體用于類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎患者的場合，針對表皮生長因子 細(xì)胞受體(EGFR)的抗體用于癌癥患者的場合。用于診斷目的的抗體可以是，例如，基于酶聯(lián)免疫吸附測定(ELISA)或放射免疫吸附測定(RIA)等方法的商 品化診斷試劑盒的組成部分。在這些試驗(yàn)測定法中，抗體用于檢測感染原 例如人乙型肝炎病毒的抗原。抗體或者免疫球蛋白(Ig)由重鏈和輕鏈構(gòu)成，重鏈和輕鏈各自由可變和 恒定區(qū)或域構(gòu)成。用于表達(dá)抗體的轉(zhuǎn)染核酸分子的核酸序列可含有兩個(gè)分 別的(separated)表達(dá)盒，其中一個(gè)編碼免疫球蛋白的輕鏈，另一個(gè)編碼免疫 球蛋白的重鏈。在本發(fā)明的抗體中表達(dá)兩條鏈時(shí)，這些鏈組裝成活性抗體不過，輕鏈和重鏈的編碼序列可以存在于同一表達(dá)盒內(nèi)并由IRES序歹'j(內(nèi) 部核糖體進(jìn)入位點(diǎn))所分隔，該IRES序列可用于實(shí)現(xiàn)重鏈和輕鏈的同時(shí)表 達(dá)。輕鏈和重鏈的編碼序列在大體上(in principle)還可以存在于同一表達(dá)盒 內(nèi)并由編碼蛋白酶(例如凝血酶)酶切位點(diǎn)的序列分隔，所述蛋白酶同時(shí)在細(xì) 胞中表達(dá)，將由重鏈和輕鏈的序列構(gòu)成的前體多肽切割成活性的輕鏈和重 鏈。由本發(fā)明細(xì)胞的核酸序列編碼的重組抗體還可以由抗體片段，而不是 完整的輕鏈和重鏈所構(gòu)成。所謂單鏈抗體(scFv,單鏈可變片段)是由一個(gè)重 鏈可變域、 一個(gè)輕鏈可變域、以及連接這兩個(gè)域并為它們提供自由運(yùn)動(dòng)性 的氨基酸序列(所謂"接頭")所構(gòu)成。這兩個(gè)域的分子內(nèi)組裝形成抗原結(jié)合 結(jié)構(gòu)，該結(jié)構(gòu)對應(yīng)于免疫球蛋白分子的可變區(qū)。雙特異性單鏈抗體(bis-scFv) 由兩個(gè)這樣的單鏈組裝體構(gòu)成，組裝體由重鏈和輕鏈的可變域組成，這些 可變域通過連接序列連結(jié)并且可以彼此相對運(yùn)動(dòng)；這樣的分子可以同時(shí)結(jié) 合兩個(gè)抗原結(jié)合位點(diǎn)(表位)從而以非共價(jià)方式連接兩個(gè)分子結(jié)構(gòu)。雙特異性 雙抗體由分別表達(dá)的兩條單鏈構(gòu)成，每條單鏈由輕鏈可變域和重鏈可變域 構(gòu)成，輕鏈可變域和重鏈可變域僅由非常短的接頭分隔開或者根本沒有接 頭。短接頭或者缺少接頭抑制分子內(nèi)組裝；通過重鏈可變域和輕鏈可變域 的分子內(nèi)組裝再一次形成具有兩個(gè)結(jié)合價(jià)的活性分子。在本發(fā)明方法中轉(zhuǎn)染的核酸分子所編碼的重組多肽可以是要制備用作 預(yù)防性或治療性疫苗的病毒蛋白、細(xì)菌蛋白或者寄生蟲蛋白。這些蛋白可 以是來自病毒、細(xì)菌或寄生蟲的結(jié)構(gòu)性多肽和調(diào)控性多肽或酶活性多肽。 病毒蛋白可以是，例如，乙肝病毒表面抗原(HBV表面抗原)或者來自人乳 頭瘤病毒的結(jié)構(gòu)性蛋白Ll。考慮在生產(chǎn)細(xì)胞系中表達(dá)后用于生產(chǎn)疫苗的細(xì)菌蛋白有，例如，來自產(chǎn)腸毒素性(enterotoxinogeneous)大腸桿菌(Escherichia coli)的腸毒素亞單位(ETEC)或來自淋病奈瑟氏菌(Neisseria gonorrhoeae)的 運(yùn)鐵蛋白結(jié)合蛋白(Tbp A和B)。來自寄生蟲的多肽(這些多肽可以被本發(fā)明 方法中轉(zhuǎn)染的核酸分子所編碼)有例如癥疾致病原惡性癡原蟲(Plasmodium falciparum)的裂殖子表面蛋白(MSP),或者來自日本血吸蟲(Schistosoma japonicum)的谷胱甘肽S轉(zhuǎn)移酶(GST)。本發(fā)明方法中轉(zhuǎn)染的核酸分子所編碼的重組多肽可以是一種或多種這 樣的病毒多肽它們具有復(fù)制因子活性，使得隨后通過轉(zhuǎn)染導(dǎo)入人細(xì)胞系 中的核酸分子能夠在該細(xì)胞系中進(jìn)行附加型復(fù)制，即獨(dú)立于染色體的復(fù)制。 隨后通過轉(zhuǎn)染導(dǎo)入細(xì)胞系中的核酸分子含有稱為"復(fù)制起點(diǎn)"(ori)的基因元 件，充當(dāng)復(fù)制因子的多肽結(jié)合該元件，從而起始附加型核酸分子的復(fù)制。 核酸分子，尤其是質(zhì)粒DNA在細(xì)胞中的附加型復(fù)制導(dǎo)致;故轉(zhuǎn)移的核酸分子 的拷貝數(shù)激增，從而增加由該分子編碼的重組多肽的表達(dá)及其在多次細(xì)胞 分裂中的維持。這樣的病毒復(fù)制因子是，例如，猿猴病毒40 (SV40)的T抗 原，它在結(jié)合于核酸分子(例如質(zhì)粒DNA)上稱作SV40復(fù)制起點(diǎn)(SV40 ori) 的序列時(shí)，起始其復(fù)制。Epstein-Barr病毒蛋白EBNA-1 (Epstein-Barr病毒 核抗原-l)識(shí)別稱為ori-P的復(fù)制起點(diǎn)，并催化攜帶ori-P的核酸分子的染色 體外復(fù)制。本發(fā)明的方法中轉(zhuǎn)染的核酸分子所編碼的重組多肽也可以是用于在細(xì) 胞系中產(chǎn)生重組病毒基因轉(zhuǎn)移載體的病毒蛋白。這些病毒蛋白，又稱為互 補(bǔ)因子(complementation factors),在細(xì)胞系中被表達(dá)，并且是產(chǎn)生基因轉(zhuǎn)移 載體所必需的酶組分或結(jié)構(gòu)組分，這些組分沒有被編碼在基因轉(zhuǎn)移載體的 核酸分子上。在這樣的基因轉(zhuǎn)移載體中，往往出于安全考慮而刪除某些病 毒基因功能。基因轉(zhuǎn)移載體的互補(bǔ)因子可以由通過上述方法導(dǎo)入的轉(zhuǎn)基因 所編碼；基因轉(zhuǎn)移載體的例子有基于腺病毒、腺伴隨病毒(AAV)或者皰滲病 毒的載體。細(xì)胞系中表達(dá)的互補(bǔ)因子還可以在缺失病毒或重組病毒的產(chǎn)生 過程中補(bǔ)全這些病毒，這些病毒不含有要轉(zhuǎn)移的基因，因此不充當(dāng)基因轉(zhuǎn) 移載體，而是用作例如疫苗。在基于腺病毒的基因轉(zhuǎn)移載體的場合，例如基因功能pIX、 E2、 E3和/ 或E4可以在本發(fā)明的細(xì)胞中表達(dá)。從載體基因組刪除上述各基因功能可提 高載體的安全性，并提高其攝取不相關(guān)的核酸序列的能力。基因功能pIX13是一種腺病毒結(jié)構(gòu)蛋白，即病毒核殼的組分。病毒基因功能E2、 E3和E4 編碼調(diào)控性多肽，這些多肽在病毒復(fù)制的早期階段中被表達(dá)。第一代的腺 病毒載體僅僅刪除了 El和/或E3。第二代的腺病毒載體還缺少基因功能E2 和/或E4。補(bǔ)全所有病毒基因功能的細(xì)胞系大體上可具有補(bǔ)全被稱為"無內(nèi) 容"(gutless)載體或稱高容量腺病毒載體的一代腺病毒基因轉(zhuǎn)移載體的能 力，這些載體不再含有任何編碼基因功能，而只具有用于載體核酸復(fù)制的 序列，這樣的序列稱為反向末端重復(fù)(ITR)。通過本發(fā)明的方法轉(zhuǎn)染到原代人細(xì)胞的核酸可以進(jìn)一步編碼受體多 肽，該多肽尤其定位于細(xì)胞表面，分別負(fù)責(zé)病毒對細(xì)胞的感染和病毒基因 轉(zhuǎn)移載體對細(xì)胞的轉(zhuǎn)導(dǎo)。作為以腺病毒血清型2或5 (最常規(guī)的腺病毒載體 衍生自這兩種血清型)感染細(xì)胞的最初步驟所用的病毒受體，鑒定了所謂柯 薩奇病毒和腺病毒受體(Coxsackie and adenovirus receptor)， 即 CAR (Bergelsonetal., Science 275:1320-1323, 1997)。 CAR在表面上的足量表達(dá)是 細(xì)胞適合用作腺病毒基因轉(zhuǎn)移載體生產(chǎn)細(xì)胞的先決條件。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí) 施方案中，重組多肽是柯薩奇病毒和腺病毒受體(CAR)。受體多肽的過度表 達(dá)能夠顯著改善可感染性(infectibility),從而顯著提高這些細(xì)胞對腺病毒載 體的生產(chǎn)效率。此外，核酸分子除了 CAR之外，還可以編碼次級(jí)受體 (secondary receptors)或者內(nèi)在4b受體(internalizing receptors), 例如某些整洱關(guān) 蛋白，它們分別介導(dǎo)細(xì)胞對病毒和基因轉(zhuǎn)移載體的攝入，它們的額外表達(dá) 對于制備腺病毒載體的生產(chǎn)細(xì)胞是有利的。本發(fā)明的方法中用于轉(zhuǎn)染原代人細(xì)胞的核酸分子(這些核酸分子編碼至 少一種重組多肽)，或者編碼細(xì)胞轉(zhuǎn)化因子的核酸分子，可以含有"基質(zhì)附 著區(qū)"(matrix attachment regions, MAR)。這些基因元件又稱"支架附著區(qū)" (scaffold attachment regions, SAR)，在基因表達(dá)的調(diào)控中起作用，因?yàn)樗鼈?與基因組中的轉(zhuǎn)錄單位和調(diào)控元件相關(guān)。MAR能夠保護(hù)整合到細(xì)胞中的外 來基因不受轉(zhuǎn)染細(xì)胞內(nèi)的轉(zhuǎn)錄沉默(muting)或轉(zhuǎn)錄關(guān)閉(shut-off)的作用，從 而提高它們的表達(dá)(Girod and Mermod, p. 359-379， in S.C. Makrides (Eds.) Gene Transfer and Expression in Mammalian Cells. 2003. Elsevier, Amsterdam)。通過以含有如下所述的核酸序列的核酸分子同時(shí)轉(zhuǎn)染原代人細(xì)胞，發(fā) 明人成功地制成了用于在不添加選擇試劑的情況下生產(chǎn)重組多肽的永久人細(xì)胞系，其中所述核酸序列分別是細(xì)胞轉(zhuǎn)化因子和兩個(gè)功能上關(guān)聯(lián)的因
子的可表達(dá)核酸序列，以及至少一種重組多肽的可表達(dá)核酸序列。由此， 本發(fā)明進(jìn)一步涉及一種制備用于表達(dá)至少一種期望多肽的永久細(xì)胞系的方 法，優(yōu)選不轉(zhuǎn)染選擇標(biāo)記。所述細(xì)胞可用于制備治療用多肽、凝血因子和 生長因子、激素和抗體，以及供用作疫苗的病毒多肽、細(xì)菌多肽或寄生蟲 多肽，及其它。另外，根據(jù)本發(fā)明的細(xì)胞可用于制備診斷上有意義的蛋白 質(zhì)，例如病毒抗原、細(xì)菌抗原或寄生蟲抗原或它們各自的特異性抗體。另 外，本發(fā)明的細(xì)胞可用于生產(chǎn)技術(shù)上或工業(yè)上有意義的蛋白質(zhì)，例如用于 催化技術(shù)合成過程或者降解有害物質(zhì)的酶。本發(fā)明的細(xì)胞可表達(dá)一種或者 多種不同的重組多肽。可表達(dá)的多肽數(shù)目取決于使用本發(fā)明方法轉(zhuǎn)染到細(xì) 胞中的編碼重組多肽的不同核酸序列有多少。
生產(chǎn)細(xì)胞中轉(zhuǎn)基因表達(dá)的強(qiáng)度，關(guān)鍵取決于轉(zhuǎn)基因?qū)爰?xì)胞后所整合 到的基因組中的區(qū)域。雖然在細(xì)胞基因組的某些位點(diǎn)上，轉(zhuǎn)基因的表達(dá)在
相對較短的時(shí)間后即被關(guān)閉，但在另 一些位點(diǎn)，即所謂轉(zhuǎn)錄"熱點(diǎn)"(hot spots) 上，表達(dá)盒在長時(shí)間內(nèi)保持高效率的轉(zhuǎn)錄活性。為了維持根據(jù)本發(fā)明制備 的永久細(xì)胞中的轉(zhuǎn)化表型，要求細(xì)胞轉(zhuǎn)化因子的持續(xù)表達(dá)。因此，在永久 人細(xì)胞中，各個(gè)表達(dá)盒的整合位點(diǎn)處于細(xì)胞基因組中的"熱點(diǎn)"上。由此， 本發(fā)明的另外一個(gè)方面涉及一種制備永久人細(xì)胞的方法，其中，顯示細(xì)胞 轉(zhuǎn)化因子序列的核酸分子進(jìn)一步包含序列特異性重組酶的識(shí)別序列。在后 續(xù)的步驟中，可以將另外的轉(zhuǎn)基因表達(dá)盒整合到永久人細(xì)胞系中，而同時(shí) 表達(dá)特定的(respective)重組酶，其中該表達(dá)盒還含有一個(gè)或多個(gè)特定 (respective)重組酶識(shí)別序列。由此使得該表達(dá)盒整合到特定的"熱點(diǎn)，，中， 從而使轉(zhuǎn)基因得以持久高表達(dá)。通過所述方式制備的、具有確定的高生產(chǎn) 效率的生產(chǎn)細(xì)胞系，可以用來快速生成用于另 一種轉(zhuǎn)基因的高效生產(chǎn)細(xì)胞。 本發(fā)明的另 一個(gè)方面涉及通過對整合位點(diǎn)的序列分析來分離這些特定的 "熱點(diǎn)，，，以及它們在表達(dá)載體中的用途。藉此可以從人細(xì)胞中分離迄今 未知的熱點(diǎn)序列。可以通過同源重組將特定表達(dá)盒整合到這些序列中。
本發(fā)明的另 一個(gè)方面涉及一種制備永久人細(xì)胞系的方法，其中展示允 許重組多肽表達(dá)之序列的核酸分子，除了該重組多肽的表達(dá)盒或者該重組 多肽的編碼序列之外，還顯示一個(gè)或多個(gè)重組酶識(shí)別序列。例如，重組酶 識(shí)別序列可以位于特定(respective)序列的5'末端和3，末端。在此情況下，重組多肽可以是報(bào)道基因，即具有易于識(shí)別和定量測定的基因表達(dá)產(chǎn)物的基 因。選擇具有報(bào)道蛋白(即報(bào)道基因編碼的基因產(chǎn)物)強(qiáng)表達(dá)的穩(wěn)定細(xì)胞系之 后，可以通過作為另 一步驟的轉(zhuǎn)染將包含另 一重組多肽表達(dá)盒的核酸分子 整合到細(xì)胞中。該表達(dá)盒也含有同一重組酶的識(shí)別序列。在短期表達(dá)重組 酶后，通過原重組多肽的切除及新轉(zhuǎn)染到細(xì)胞中的重組多肽的整合，將生 成亦具有高生產(chǎn)效率的新生產(chǎn)細(xì)胞系。這種方法縮短了篩選良好表達(dá)的細(xì)
胞系的耗時(shí)過程。重組酶及其各自的識(shí)別序列例子有來自噬菌體P1的 Cre重組酶和loxP識(shí)別序列、來自噬菌體cJ)C31的整合酶和attB/attP識(shí)別序 列、或來自酵母的Flp重組酶和frt識(shí)別序列(Groth et al.， PNAS 97: 5995-6000: 2000; Araki et al., Nucl. Acids Res. 25: 868-872, 1997; O'Go腿n et al" Science 251: 1351-1355, 1991)。 4艮多時(shí)候，"偽，，lox (Araki et al., Nucl. Acids Res. 25: 868-872, 1997)或"偽，，att (Thyagarajan et al" Mol. Cell Biol. 21: 3926-3934， 2001)而非真實(shí)識(shí)別序列，對于高效整合是有利的。
下面的實(shí)施例舉例說明了本發(fā)明，不應(yīng)視為限制性。除非另外指出， 使用標(biāo)準(zhǔn)的分子方法，例如Sambrook et al" 1989, Molecular cloning: A Laboratory Manual, 2. Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York.中描述的方法。
1.克隆方法
a) 質(zhì)粒pSTK146
質(zhì)粒pSTK146在EP 1 230 354 Bl有詳細(xì)描述，包含鼠磷酸甘油酸激酶 (pgk)啟動(dòng)子，腺病毒血清型5 (Ad5)序列核苷酸(nt.) 505至3522，和SV40 的剪接和聚腺苷酸化信號(hào)。
b) 質(zhì)粒pGS119 (圖1)
質(zhì)粒pGS119含有鼠pgk啟動(dòng)子、含有整個(gè)El區(qū)的Ad5序列nt. 505-3522, SV40的3，剪接和聚腺苷酸化信號(hào)，和Ad5的pIX區(qū) (nt.3485-4079)。
Ad5 pIX基因序列來自含有Ad5序列nt.22-5790的質(zhì)粒pXCl (Microbix Biosystems Inc, Catalogue No. PD-01-03)。 4吏用該質(zhì)粒和引物p9.3485匿3504 (CTGGCTCGAGCTCTAGCGATGAAGATACAG;SEQIDNO:l)和p9.4079-4060 (GCTGCTCGAGCACTTGCTTGATCCAAATCC; SEQ ID N0:2) 通過聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)擴(kuò)增Ad5基因序列nt. 3485-4079,用Xhol切割(每 個(gè)引物含有一個(gè)Xhol限制位點(diǎn))，并導(dǎo)入pSTK146的Xhol限制位點(diǎn)。
c)質(zhì)粒pGS122
質(zhì)粒pGS122含有Ad5序列bp 1-4344。在第一個(gè)步驟中，利用SacII 消化從pXCl (Microbix Biosystems Inc， Catalogue No. PD畫01隱03)分離Ad5序 列nt. 356-3826，并導(dǎo)入pSTK31的SacII限制位點(diǎn)(含有Pmel限制位點(diǎn)，后 續(xù)pBluescript中的Ad5序歹'j bp 1-400)。將如此產(chǎn)生的質(zhì)粒pGS120用BstEII 線性化，然后導(dǎo)入含有Ad5序列bp 1914-5185的來自pXCl的BstEII片段 (pGS121)。 將兩個(gè)寡核苷酸 Ad5_4297-4344.PX
TTGCCAGTTTAAAC; SEQ ID NO:3) 和 Ad5—4344-4297
ACCACGCCCAGCT; SEQ ID N0:4)雜交形成雙鏈。用Afel和Xhol消化質(zhì) 粒pGS121,并將上述寡核苷酸導(dǎo)入。所述寡核苷酸序列的選擇使得導(dǎo)入 pGS131時(shí)5，末端的Afel限制位點(diǎn)被保留，而在3'末端Pmel限制位點(diǎn)之后 跟隨再生的Xhol限制位點(diǎn)。這樣，pGS122中的Ad5序列就直接側(cè)翼鄰接 著一個(gè)PmeI限制位點(diǎn)。
d)質(zhì)粒pGS124
質(zhì)粒pGS124含有SV40啟動(dòng)子和SV40 T抗原的基因序列。通過用 Bamffl和Kpnl消化SV40 DNA，從SV40基因組切出 一個(gè)3 kb片段并將其 導(dǎo)入經(jīng)Bamffl和Kpnl消化的pBluescript。這樣，質(zhì)粒pGS124表達(dá)SV40 T抗原。
e)質(zhì)粒pGS116 (圖2)， pGS129， pGS131， pGS132， pGS133
質(zhì)粒pGS116、 pGS129、 pGS131、 pGS132和pGS133在不同啟動(dòng)子控 制下表達(dá)人al抗胰蛋白酶(hAAT)。
質(zhì)粒pGS116(圖2)含有人巨細(xì)^^病毒(CMV)早期啟動(dòng)子，后隨SV40剪 接供體/剪接受體位點(diǎn)，hAAT-cDNA和SV40聚腺苷酸化位點(diǎn)(polyA)。 CMV和SV40序列來自質(zhì)粒pCMVp (BD Clontech, Catalogue No. 6177-1)。通過 Notl消化然后進(jìn)行5'突出端填平反應(yīng)來刪除pCMV卩中的p-半乳糖苦酶基 因并代之以hAAT cDNA,該hAAT cDNA是從質(zhì)粒Ad/PGK-hAAT (Kay et al.: Hepatology 21:815-819, 1995)通過EcoRI消化而分離的。
質(zhì)粒pGS129含有處于人延伸因子EF-la啟動(dòng)子控制之下的上述hAAT cDNA。通過Xhol和EcoRI消化pGS116然后進(jìn)行5'突出端填平反應(yīng)來刪 除pGS116中的CMV啟動(dòng)子并代之以含EF-la啟動(dòng)子的1.3 kb片段。
質(zhì)粒pGS131含有在由CMV增強(qiáng)子和雞卩肌動(dòng)蛋白啟動(dòng)子構(gòu)成的雜合 啟動(dòng)子(CAG啟動(dòng)子)控制下的hAAT cDNA。通過用Xhol和EcoRI消化， 隨后進(jìn)行5，填平反應(yīng)，用1.1 kbCAG啟動(dòng)子取代CMV啟動(dòng)子。
質(zhì)粒pGS 132含有在勞氏肉瘤病毒(RSV)啟動(dòng)子控制下的hAAT cDNA。 通過用Xhol和EcoRI消化隨后進(jìn)行5'突出端填平反應(yīng)刪除pGS116中的 CAG啟動(dòng)子，并代之以0.58kbRSV啟動(dòng)子。
在質(zhì)粒pGS133中，hAAT cDNA的表達(dá)受猿猴病毒40 (SV40)早期啟動(dòng) 子的控制。通過用Xhol和EcoRI消化，隨后進(jìn)行5，突出端填平反應(yīng)，刪除 pGS116中的CMV啟動(dòng)子并代之以0.23 kb SV40啟動(dòng)子。
f) 質(zhì)粒pGS126
質(zhì)粒pGS126含有下列元件由pkg啟動(dòng)子、Ad5序列nt. 505-3522、 SV40 polyA組成的El表達(dá)盒，由Ad5序列nt. 3485-4079組成的pIX表達(dá) 盒，和由CMV啟動(dòng)子、hAATcDNA、 SV40 polyA組成的hAAT表達(dá)盒。 通過用EcoRI和HindIII消化pGS116 (見1 e)然后進(jìn)行填平反應(yīng)分離hAAT 表達(dá)盒，并導(dǎo)入經(jīng)過BamHI消化和5，突出端填平反應(yīng)的質(zhì)粒pGS119(見1 b) 中。由此，質(zhì)粒pGS126表達(dá)Ad5El和pIX蛋白及hAAT。
g) 質(zhì)粒pGS123
質(zhì)粒pGS 123除了 hAAT表達(dá)盒外，還含有基質(zhì)相關(guān)區(qū)(matrix associated region, MAR)。該MAR定位于來自人AAT基因座位的內(nèi)含子區(qū)域的2085 bp 的EcoRI/Spel片段(GenBank登錄號(hào)K02212)中。該片段克隆在pBluescript 中(pGS58),并在pGS116 5'突出端填平反應(yīng)后將其導(dǎo)入EcoRI限制位點(diǎn)中 (見1 e)。h)質(zhì)粒pGS127
質(zhì)粒pGS127含有CMV啟動(dòng)子、人紅細(xì)胞生成素(Epo) cDNA和SV40 polyA序列。通過Notl消化從pCMVp去除(3半乳糖苷酶基因并代之以Epo cDNA。
2. 構(gòu)建體的JiHi
a) 序列分析
通過限制消化檢驗(yàn)上述所有質(zhì)粒的完整性。此外，通過序列分析證實(shí) 了 pGS119、 pGS122和pGS126中腺病毒片段的正確序列；未發(fā)現(xiàn)序列相比 于Ad5野生型有所改變。
b) 表達(dá)
將質(zhì)粒pGS 116 、 pGS 129 、 pGS 131 、 pGS 132 、 pGS 13 3 、 pGS 123和pGS 126 轉(zhuǎn)染到HEK293細(xì)胞中，并利用ELISA (見6b章)檢測人al抗胰蛋白酶 (hAAT)的表達(dá)和向培養(yǎng)上清液中的分泌。
將質(zhì)粒pGSl 19和pGS122轉(zhuǎn)染到HeLa細(xì)胞中，使用單克隆抗體進(jìn)行 Western印跡來分斗斤E1A蛋白的表達(dá)。
將質(zhì)粒pGS124轉(zhuǎn)染到HeLa和HEK293細(xì)胞中，使用Western印跡和 單克隆抗體(Abcam, Cambridge, UK)來檢測T抗原的表達(dá)。
3. 細(xì)胞培養(yǎng)
a) 細(xì)月包系
除非另有說明，細(xì)胞培養(yǎng)試劑獲自Invitrogen GmbH公司。HEK293和 HeLa細(xì)胞在含10。/。胎牛血清(FCS)、 1 x青霉素/鏈霉素的改進(jìn)的Eagle's Medium (MEM)中于37°C 、 95%濕度和5% C02的條件下培養(yǎng)。
b) 原代羊水細(xì)胞
在羊膜穿刺術(shù)中根據(jù)常規(guī)方法獲得原代羊水細(xì)胞。將這樣的羊膜穿刺 液(puncture) 1-2 ml用5ml Ham氏F10培養(yǎng)基、10%FCS、 2% Ultroser G (CytoGen GmbH)、 lx抗生素/抗真菌劑在37°C 、 95%濕度和5% C02的條件下于6 cmPrimaria細(xì)胞培養(yǎng)皿(Falcon)中培養(yǎng)。4-6天后羊膜細(xì)胞開始貼壁， 添加3ml含添加劑(如上)的新鮮培養(yǎng)基。 一旦細(xì)胞完全貼壁，即除去培養(yǎng)基 并換成5 ml加添加劑的新鮮培養(yǎng)基。對于進(jìn)一步的傳代，將匯合的細(xì)胞用 PBS洗滌，用胰蛋白酶(TrypleSelect, Invitrogen)解離，分別轉(zhuǎn)入10和25 ml 的加有添加劑的新鮮培養(yǎng)基中，分別加入10和25 cm亞中。
4.原代羊水細(xì)胞的轉(zhuǎn)染和轉(zhuǎn)化
通過轉(zhuǎn)染不同組合的上述質(zhì)粒來轉(zhuǎn)染原代羊水細(xì)胞，分離轉(zhuǎn)化的細(xì)胞 系并分析其轉(zhuǎn)基因的表達(dá)。下面，詳細(xì)描述使用質(zhì)粒pGS116和pGS119產(chǎn) 生hAAT表達(dá)細(xì)胞系。以同樣方式使用下面的核酸組合產(chǎn)生了其它細(xì)胞系
-pSTK146 (含有Ad5序列nt, 505-3522)和pGSl 16 (含有CMV-hAAT 表達(dá)盒)
-pGSl 19 (含有Ad5序列nt. 505-4079)和pGS129 (含有EFla hAAT表 達(dá)盒)
-pGS 119和pGS 131 (含有CAG hAAT表達(dá)盒)
-pGS 119和pGS32 (含有RSV hAAT表達(dá)盒)
-pGS 119和pGS 133 (含有SV40 hAAT表達(dá)盒)
-pGS 119和pGS 123 (含有CMV hAAT表達(dá)盒和MAR序列)
-pGS122 (含有Ad5序列nt. l-4344)和pGSl 16 (CMV hAAT表達(dá)盒)
-pGS126 (含有Ad5序列nt. 505-4079和CMV hAAT表達(dá)盒)
-pGSl 19和pGS127 (含有CMV-Epo表達(dá)盒)
-pGS124(表達(dá)T-Ag)和pGS116
為了轉(zhuǎn)染，在轉(zhuǎn)染之前通過用合適的限制性核酸酶消化將除pGS122之 外的所有質(zhì)粒線性化。在轉(zhuǎn)染前用Pmel消化質(zhì)粒pGS112,因?yàn)閜GS112 中的腺病毒序列分別側(cè)翼鄰接一個(gè)PmeI限制位點(diǎn)。當(dāng)轉(zhuǎn)染兩種質(zhì)粒時(shí)，每 種質(zhì)粒使用1嗎；當(dāng)只用一種質(zhì)粒(pGS126)轉(zhuǎn)染時(shí)，使用2嗎。用所有核 酸組合均可以獲得轉(zhuǎn)化細(xì)胞克隆，并且可以分離和測試單克隆。轉(zhuǎn)化細(xì)胞 克隆的數(shù)目依賴于所用的編碼細(xì)胞轉(zhuǎn)化因子的核酸分子。因此，使用質(zhì)粒 pGS119時(shí)獲得的轉(zhuǎn)化細(xì)胞克隆令人驚訝且出人意料地顯著多于使用 pSTK146時(shí)獲得的轉(zhuǎn)化細(xì)胞克隆。此外，使用具有E1作為細(xì)胞轉(zhuǎn)化因子的 核酸分子進(jìn)行轉(zhuǎn)化導(dǎo)致轉(zhuǎn)化細(xì)胞克隆顯著多于用表達(dá)SV40 T抗原(pGS 124)轉(zhuǎn)染所得的轉(zhuǎn)化細(xì)胞克隆。重組多肽的表達(dá)則依賴于所用的啟動(dòng)子，其中
pGS133中使用SV40導(dǎo)致最低的表達(dá)率。
下面，詳細(xì)描述使用質(zhì)粒pGS 116和pGS 119生成表達(dá)hAAT的細(xì)胞系。 轉(zhuǎn)染之前，使羊水細(xì)胞適應(yīng)于含2% Ultroser的Opti-Pro培養(yǎng)基。為此 目的，每2-3天以75:25%、 50:50%、 25:75%和0:100%向細(xì)胞添加新鮮Ham 氏F10培養(yǎng)基(含添加劑)+ Opti-Pro培養(yǎng)基(含2% Ultroser)。
對于轉(zhuǎn)染，將一個(gè)大約80%匯合的15 cm培養(yǎng)皿的細(xì)胞分配到6 cm培 養(yǎng)皿上，相應(yīng)于每個(gè)培養(yǎng)皿5-7 x 105個(gè)細(xì)胞的細(xì)胞數(shù)。第二天，使用轉(zhuǎn)染 試劑Effectene(Qiagen)，根據(jù)制造商的規(guī)程，用1 pg的pGS116和pGS119 (均 經(jīng)過Scal線性化)轉(zhuǎn)染5個(gè)培養(yǎng)皿上的細(xì)胞。對一個(gè)培養(yǎng)皿不進(jìn)行轉(zhuǎn)染，培 養(yǎng)用作對照。次日，用PBS洗滌細(xì)胞，用TrypleSelect將細(xì)胞解離，并轉(zhuǎn)移 到15cm培養(yǎng)亞中。將細(xì)胞再培養(yǎng)10-15天，其中每3-4天用新鮮培養(yǎng)基更 換培養(yǎng)基。在此過程中，Ultroser的添加減少到1%。大約10-15天后，細(xì)胞 匯合，將它們轉(zhuǎn)移到15cm培養(yǎng)皿中，如上所述。
5. 轉(zhuǎn)化細(xì)胞克隆的分離
轉(zhuǎn)染后數(shù)周，可觀察到克隆細(xì)胞島(clonal cell islands),這些細(xì)胞在形態(tài) 上顯著不同于未轉(zhuǎn)化的羊水細(xì)胞。挑取這些細(xì)胞島并轉(zhuǎn)移到24孔培養(yǎng)皿上 (對應(yīng)于第l代)。進(jìn)一步增殖細(xì)胞，并將它們先轉(zhuǎn)移到6cm培養(yǎng)皿中， 而后轉(zhuǎn)移到15 cm培養(yǎng)皿中。
最初，有大約40個(gè)克隆被分離，在進(jìn)一步培養(yǎng)中，它們部分地在形態(tài) 上彼此顯著不同。這些克隆中有一些在長期培養(yǎng)的情況下表現(xiàn)出顯著的"危 機(jī)"，即它們的生長非常不穩(wěn)定。進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)限于對7個(gè)形態(tài)上穩(wěn)定的 細(xì)胞克隆的進(jìn)一步培養(yǎng)和分析。這些克隆命名如下2AL2、 2AI.3、 2AI.6、 2AU2、 2AI.15、 2AU7、 2AU8。
6. 細(xì)胞系的表征
a) El基因的表達(dá)(Western印跡)
使用單克隆抗體進(jìn)行Western印跡分析，在7個(gè)克隆細(xì)胞系中檢測了 E1A和E1B 21kD蛋白質(zhì)的表達(dá)。
為此目的，將每個(gè)細(xì)胞克隆的7 x 105個(gè)細(xì)胞各自鋪在6孔培養(yǎng)皿上。72小時(shí)后，用Tris-鹽水/4mMEDTA解離細(xì)胞，離心沉淀，重懸在lOO(ilTris-鹽水中，并添加30 pl 4 x SDS上樣緩沖液(40%甘油、1.4 M巰基乙醇、8% SDS、 250 mMTris/HClpH7)加以裂解。作為陰性對照，使用由同樣數(shù)目 的原代羊水細(xì)胞制備的裂解物。以HEK293細(xì)胞的裂解物作為陽性對照。 將這些蛋白質(zhì)混合物各自取10在10% SDS聚丙烯酰胺凝膠上電泳分離， 并轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素膜上。通過分別與抗E1A和抗E1B 21 kD抗體 (Oncogene Research)—起溫育，并分別與HRP偶聯(lián)的抗小鼠抗體(E1A， Jackson Immunoresearch Laboratories )及抗大鼠抗體(EIB 21 kD, Oncogene Research) —起溫育，然后再溫育，利用化學(xué)發(fā)光(ECL， Amersham)使膜結(jié) 合蛋白可視化。E1A和EIB的Western印跡結(jié)果示于圖3,其顯示，所有被 檢細(xì)胞系均表達(dá)E1A蛋白(30-50 kD的三個(gè)條帶)和EIB 21 kD蛋白。
b) hAAT表達(dá)(Western印跡)
分別在細(xì)胞內(nèi)(克隆細(xì)胞系中)和分泌后(培養(yǎng)基中)檢測hAAT的表達(dá)， 斗企測方式也是使用單克隆hAAT特異性抗體進(jìn)行Western印跡分析。為此目 的，將單個(gè)細(xì)胞克隆的7x 105個(gè)細(xì)胞分別鋪在6孔培養(yǎng)皿上。作為陰性對
作為后續(xù)測定中的陽性對照，使用50ng來自人血漿的純化hAAT。
72小時(shí)后，除去細(xì)胞培養(yǎng)上清液，用Tris-鹽水/4mMEDTA解離細(xì)胞， 離心沉淀，重懸于100 (ilTris-鹽水中，并加入30)il4xSDS上樣緩沖液加 以裂解。為檢測細(xì)胞內(nèi)hAAT，取裂解細(xì)胞的蛋白混合物10 (il加以電泳分 離，并利用單克隆hAAT抗體(ICN Biomedicals)和HRP偶聯(lián)的抗山羊抗體 (Pierce)及隨后進(jìn)行化學(xué)發(fā)光染色來可視化。為檢測分泌的hAAT，用10 pl 細(xì)胞培養(yǎng)基添加2xSDS上樣緩沖液，電泳分離，并如上所述^f企測。
圖4A顯示從細(xì)胞分泌到培養(yǎng)上清中的hAAT, hAAT的細(xì)胞內(nèi)表達(dá)示 于圖4B。用于hAAT細(xì)胞內(nèi)檢測的裂解物相對于細(xì)胞培養(yǎng)上清濃縮了大約 20倍。這意味著細(xì)胞以很高的效率分泌hAAT。
c) 在數(shù)次傳代中hAAT表達(dá)的量和穩(wěn)定性
使用ELISA (酶聯(lián)免疫吸附反應(yīng))方法定量測定分泌到培養(yǎng)基中的 hAAT的量。為此目的，將不同克隆細(xì)胞系的7 x 105個(gè)細(xì)胞分別鋪到6孔培養(yǎng)皿中，72小時(shí)后除去細(xì)胞培養(yǎng)上清液。使用多克隆抗hAAT抗體(未偶 聯(lián)的或者偶聯(lián)HRP的，ICN Biomedicals)進(jìn)行ELISA來確定hAAT的量。 使用/人人血漿純化的hAAT (ICN Biomedicals)作為對照。圖5A顯示各個(gè)細(xì) 胞克隆的第5代中表達(dá)的每個(gè)細(xì)胞的hAAT量。圖5B顯示了選定細(xì)胞克隆 中表達(dá)在數(shù)次傳代中的穩(wěn)定性。受檢細(xì)胞系在大約20代的測試時(shí)間段內(nèi)恒 定地每個(gè)細(xì)胞表達(dá)0.2至4 pg。
d) hAAT的糖分沖斤(glyco國analysis)
由于hAAT是糖蛋白，考察了各個(gè)細(xì)胞系中hAAT的糖基化程度。為 此目的，預(yù)先將細(xì)胞克隆逐步適應(yīng)于不含Ultroser的Opti-Pro培養(yǎng)基中，結(jié) 果使得細(xì)胞不再貼壁而是懸浮生長。為了測試分泌到培養(yǎng)上清液中的hAAT 是否為糖基化的，用肽-N-糖苷酶F (PNGase F)酶進(jìn)行消化。這種酶切去附 接于天冬酰胺殘基的(N連接的)糖殘基，使得蛋白質(zhì)的分子量減少。取各個(gè) 細(xì)胞克隆的細(xì)胞培養(yǎng)上清液22.5 pl，加入2.5 (al致變性緩沖液(10倍5% SDS、 10% P-巰基乙醇)，IO(TC IO分鐘使蛋白變性。然后，向蛋白中加入 3.5 pl G7反應(yīng)緩沖液(IO倍500 mM磷酸鈉pH 7.5)、 3.5 pl 10% NP-40和3 pl PNGase F (New England Biokbs; 500單位/pl)，在37。C溫育60分鐘。作為 對照，在每種情況下，分別將45 ng的來自人血漿的純化hAAT在25 pl Opti-Pro培養(yǎng)基中如上述方式變性，并添加PNAase F和H20。隨后，通過 使用單克隆hAAT特異性抗體進(jìn)行Western印跡分析，如6b)所述方式檢測 hAAT分子量的變化。圖6分別顯示在4種不同細(xì)胞克隆中表達(dá)的hAAT， 以及從人血漿純化的hAAT經(jīng)過PNGase F消化后分子量的變化。這些實(shí)驗(yàn) 清楚地顯示，這些單個(gè)細(xì)胞克隆中合成的hAAT是糖基化的。
權(quán)利要求
1.一種制備永久人細(xì)胞系的方法，其中用一種核酸分子或至少兩種不同核酸分子轉(zhuǎn)染分離的原代人細(xì)胞，并且在轉(zhuǎn)染一種核酸分子的情況下，該核酸分子顯示允許至少一種細(xì)胞轉(zhuǎn)化因子表達(dá)及重組多肽表達(dá)的序列；而在轉(zhuǎn)染至少兩種不同核酸分子的情況下，第一種核酸分子顯示允許至少一種細(xì)胞轉(zhuǎn)化因子表達(dá)的序列，第二種核酸分子顯示允許至少一種重組多肽表達(dá)的序列。
2. 權(quán)利要求1的方法，其中所述原代人細(xì)胞是羊水細(xì)胞、胚胎視網(wǎng)膜 細(xì)胞和源自神經(jīng)元的胚胎細(xì)胞。
3. 前述任一權(quán)利要求的方法，其中所述細(xì)胞轉(zhuǎn)化因子是來自SV40的T 抗原、來自HPV的E6和E7或者來自人腺病毒的E1A和E1B。
4. 權(quán)利要求3的方法，其中來自人腺病毒的E1A和E1B的序列包括人 腺病毒血清型5的核普酸1-4344、 505-3522或核苷酸505-4079。
5. 前述任一權(quán)利要求的方法，其中所述重組多肽是激素；凝血因子； 生長因子；柯薩奇病毒和腺病毒受體(CAR);抗體；病毒抗原、細(xì)菌抗原或 寄生蟲抗原；或用于產(chǎn)生重組病毒的互補(bǔ)因子。
6. 前述任一權(quán)利要求的方法，其中，在細(xì)胞轉(zhuǎn)化因子是來自HPV的E6 和E7的情況下，E6的序列存在于一個(gè)核酸分子上，E7的序列存在于另一 個(gè)不同的核酸分子上；而在細(xì)胞轉(zhuǎn)化因子是來自人腺病毒的E1A和E1B的 情況下，E1A的序列存在于一個(gè)核酸分子上，E1B的序列存在于另一個(gè)不 同的核酸分子上。
7. 權(quán)利要求6的方法，其中重組多肽的序列存在于細(xì)胞轉(zhuǎn)化因子的兩 個(gè)核酸分子之一上。
8. 前述任一權(quán)利要求的方法，其中允許細(xì)胞轉(zhuǎn)化因子或重組多肽表達(dá) 的序列顯示異源啟動(dòng)子和/或異源轉(zhuǎn)錄終止元件。
9. 權(quán)利要求8的方法，其中所述啟動(dòng)子是CMV(巨細(xì)胞病毒)啟動(dòng)子、 EF-la啟動(dòng)子、CAG啟動(dòng)子、人或鼠pgk啟動(dòng)子、RSV啟動(dòng)子或SV40啟 動(dòng)子；所述轉(zhuǎn)錄終止元件是SV40大T抗原的聚腺苷酸化序列或者人G-CSF 基因的聚腺苷酸化序列。
10. 前述任一權(quán)利要求的方法，其中允許重組多肽表達(dá)的序列含有重組酶識(shí)別序列，所述識(shí)別序列位于所述重組多肽的編碼序列或者所述重組 多肽的全表達(dá)盒的側(cè)翼。
11. 權(quán)利要求10的方法，其中所述識(shí)別序列是loxP、 attB/attP或Frt序列。
12. 前述任一權(quán)利要求的方法，其中所述被轉(zhuǎn)染的核酸分子不顯示編 碼選捧標(biāo)記的序列。
13. 能夠根據(jù)權(quán)利要求l-12任一項(xiàng)的方法得到的永久人細(xì)胞系。
14. 權(quán)利要求13的細(xì)胞系用于制備多肽的用途。
15.權(quán)利要求13的細(xì)胞系用于制備病毒基因轉(zhuǎn)移載體的用途。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種制備永久人細(xì)胞系的方法，其中用允許至少一種細(xì)胞轉(zhuǎn)化因子表達(dá)的序列和允許至少一種重組多肽表達(dá)的序列同時(shí)轉(zhuǎn)染分離的原代人細(xì)胞。
文檔編號(hào)C12N5/10GK101310014SQ200680043000
公開日2008年11月19日 申請日期2006年11月15日 優(yōu)先權(quán)日2005年11月16日
發(fā)明者克里斯托弗·沃爾珀斯, 古德倫·希德納 申請人:塞維克制藥有限責(zé)任公司