表達(dá)人外源胰島素原的人造血干細(xì)胞及其應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明屬于醫(yī)學(xué)分子生物學(xué)領(lǐng)域，具體涉及一種表達(dá)人外源胰島素原的人造血干細(xì)胞及其制備方法和應(yīng)用。本發(fā)明的表達(dá)人外源胰島素原的人造血干細(xì)胞是采用DNA重組技術(shù)，將人胰島素原基因克隆至慢病毒表達(dá)載體中，獲得能夠表達(dá)人胰島素原基因的慢病毒表達(dá)載體，將該表達(dá)載體和慢病毒包裝質(zhì)粒共同轉(zhuǎn)染至293FT細(xì)胞，包裝慢病毒顆粒，收集含病毒的細(xì)胞培養(yǎng)液上清，感染新分離的UCB HSCs，獲得表達(dá)人外源胰島素原的人造血干細(xì)胞，該人造血干細(xì)胞在體外能夠擴(kuò)增，擴(kuò)增細(xì)胞經(jīng)細(xì)胞移植，在體內(nèi)能夠進(jìn)行正常的自我更新和多向分化，分泌的proinsulin能夠激活insulin受體及其下游靶基因，移植到NOD/SCID/Diabetes I小鼠能夠顯著減低I型糖尿病小鼠的血糖，提高小鼠存活率。
【專利說明】表達(dá)人外源胰島素原的人造血干細(xì)胞及其應(yīng)用

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于醫(yī)學(xué)分子生物學(xué)領(lǐng)域，具體涉及一種表達(dá)人外源胰島素原的人造血干 細(xì)胞及其制備方法和應(yīng)用。

【背景技術(shù)】
[0002] 糖尿病是嚴(yán)重危害人類健康的主要疾病之一，已經(jīng)成為繼心血管疾病和腫瘤之后 的第三大疾病。近年來，糖尿病的發(fā)病率不斷上升，而且發(fā)病更趨年輕化。
[0003] 糖尿病是一組以高血糖為特征的代謝性疾病。高血糖則是由于胰島素分泌缺陷或 其生物作用受損，或兩者兼有引起。糖尿病病人由于產(chǎn)生胰島素障礙或胰島素不能發(fā)揮生 理作用引起糖代謝紊亂導(dǎo)致微血管病變，引起肢體壞死、失明和腎功能衰竭等一系列嚴(yán)重 的并發(fā)癥。目前尚無(wú)根治糖尿病的方法，但通過多種治療手段可以控制好糖尿病，胰島素治 療是其中一種有效的方法。雖然采用胰島素治療在一定程度上能夠改善病人的糖代謝紊 舌L然而長(zhǎng)期的胰島素注射不僅在治療上給病人帶來不便，并且這種方法并不能有效地防 止或逆轉(zhuǎn)糖尿病引起的微血管病變及其并發(fā)癥。
[0004] 細(xì)胞移植是將在體外建立的功能性細(xì)胞移植到體內(nèi)替代功能缺陷的細(xì)胞，以達(dá)到 治療疾病的目的。近年來，許多研究者致力于利用現(xiàn)代基因工程技術(shù)改造或新建各種可分 泌胰島素的細(xì)胞系，主要有胰島細(xì)胞系、胰島干細(xì)胞系和非胰島細(xì)胞系。
[0005] 相當(dāng)數(shù)量的生物因子在胰島β細(xì)胞產(chǎn)生、發(fā)育、分裂這一過程當(dāng)中起著調(diào)節(jié)的作 用。所有基因的啟動(dòng)與關(guān)閉，所有蛋白質(zhì)的激活和失活，都是由一個(gè)復(fù)雜的過程來調(diào)控的。 基于這個(gè)觀點(diǎn)，研究人員把胰島β細(xì)胞產(chǎn)生、發(fā)育、分裂這一過程所必須的生物因子轉(zhuǎn)入 體內(nèi)，用來促使胰島β細(xì)胞成熟。
[0006] 研究人員于本世紀(jì)初，初次選用胰島發(fā)育因子神經(jīng)元素胰腺十二指腸同源異型盒 基因 I (pancreatic duodenal homeobox-l，PDX_l)等促使非內(nèi)分泌細(xì)胞轉(zhuǎn)變?yōu)槟u細(xì)胞 或者β細(xì)胞顯型來取代胰島移植進(jìn)行1型糖尿病治療的研究。PDX-I蛋白可以參與調(diào)控 insulin基因的轉(zhuǎn)錄。PDX-I蛋白還可以促進(jìn)胰腺的發(fā)育、維持胰島β細(xì)胞特異基因的表 達(dá)。胰腺中的全部細(xì)胞在器官形成時(shí)均有I 3DX-I基因的表達(dá)，而在成體后，PDX-I基因則局 限表達(dá)于胰島β細(xì)胞。利用rox-ι對(duì)非β細(xì)胞進(jìn)行直接或間接修飾將會(huì)成為糖尿病基因 治療中一個(gè)極具潛力的發(fā)展方向。Raikwar等將rox-l基因轉(zhuǎn)入小鼠的胚胎干細(xì)胞使其大 部分分化為胰島素產(chǎn)生細(xì)胞。Talebi等將以慢病毒為載體的Η)Χ-1基因?qū)牍撬栝g充質(zhì)干 細(xì)胞，同時(shí)標(biāo)記表達(dá)神經(jīng)素3和GLUT2,并且確定之一系列因子的表達(dá)并不會(huì)對(duì)insulin基 因的表達(dá)產(chǎn)生影響。在對(duì)此細(xì)胞蛋白質(zhì)的免疫分析中發(fā)現(xiàn)，PDX-I基因和insulin基因均 有表達(dá)。將這種roxr的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞注入1型糖尿病大鼠后，大鼠血糖水平在三天 內(nèi)從485mg/L下降到正常水平。該研究數(shù)據(jù)顯示，PDX-I+的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞具有基因治 療1型糖尿病的潛能。
[0007] 多潛能干細(xì)胞（induced pluripotent stem cells，iPS cells)是當(dāng)前干細(xì)胞研 究的熱點(diǎn)。iPS細(xì)胞在修復(fù)與重建受損器官，治愈疾病等方面都擁有潛在的研究?jī)r(jià)值。許多 研究人員認(rèn)為，iPS將會(huì)被大范圍應(yīng)用于糖尿病的胰島細(xì)胞移植和各類受損、缺陷器官的自 體移植等領(lǐng)域。Deng等成功地用表皮生長(zhǎng)因子等誘導(dǎo)人多潛能干細(xì)胞分化為胰島素分泌 型細(xì)胞，其中可以正常分泌胰島素的細(xì)胞超約有25%，這一研究成果在用人iPS治療糖尿 病的領(lǐng)域獲得了非常大的突破。Zhou等將攜帶有roXl、Ngn3和Mafa等三個(gè)與胰腺發(fā)育有 關(guān)的轉(zhuǎn)錄因子的腺病毒載體注入缺少胰島β細(xì)胞的小鼠胰腺，選擇性的轉(zhuǎn)染胰腺外分泌 細(xì)胞。結(jié)果顯示，超過兩成的外分泌型細(xì)胞轉(zhuǎn)化為了胰島β細(xì)胞。雖然有研究表明iPS移 植可能產(chǎn)生免疫排斥，但是，最近的兩個(gè)實(shí)驗(yàn)則證實(shí)了將同基因的iPS細(xì)胞所分化的細(xì)胞 進(jìn)行移植并不會(huì)產(chǎn)生免疫反應(yīng)或排斥，而先前的研究結(jié)果可能是使用了逆轉(zhuǎn)錄病毒感染的 iPS細(xì)胞導(dǎo)致的。
[0008] 申請(qǐng)?zhí)枮?00710100326. 1的發(fā)明專利公開了一種應(yīng)用編碼多種外源基因的慢病 毒載體制備分泌胰島素的干細(xì)胞系的方法，該方法是將多種胰島素調(diào)控基因克隆至復(fù)制缺 陷型慢病毒載體PWPST，轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞進(jìn)行包裝后，收集病毒顆粒并濃縮后轉(zhuǎn)染人胚胎胰 腺干細(xì)胞，這種含有多種胰島素調(diào)控基因的慢病毒載體在轉(zhuǎn)染干細(xì)胞后，可以使干細(xì)胞合 成胰島素的能力大幅度提高，并在葡萄糖的刺激時(shí)產(chǎn)生明顯的胰島素釋放，該專利中僅僅 介紹了體外培養(yǎng)可以提高胰島素的分泌，但將細(xì)胞系移植入動(dòng)物模型體內(nèi)效果如何不得而 知。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0009] 有鑒于此，本發(fā)明的目的之一在于提供一種重組慢病毒表達(dá)載體，其攜帶有人胰 島素原基因（preproinsulin);本發(fā)明的目的之二在于提供一種重組慢病毒顆粒，其是由 所述的重組慢病毒表達(dá)載體和慢病毒包裝質(zhì)粒共同轉(zhuǎn)染宿主細(xì)胞后包裝得到；本發(fā)明的目 的之三在于提供一種表達(dá)人外源胰島素原的人造血干細(xì)胞，這種表達(dá)人外源胰島素原的人 造血干細(xì)胞能夠分泌有生物活性的人胰島素原并且保持造血干細(xì)胞自我更新和多向分化 的特性；本發(fā)明的目的之四在于提供一種表達(dá)人外源胰島素原的人造血干細(xì)胞的體外擴(kuò)增 方法，在單獨(dú)使用CHIR99021或者LiCl，不需要其他細(xì)胞因子的條件下，表達(dá)人外源胰島素 原的人造血干細(xì)胞能夠有效擴(kuò)增，擴(kuò)增細(xì)胞保持造血干細(xì)胞的特性。
[0010] 為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明的技術(shù)方案為：
[0011] -種重組慢病毒表達(dá)載體，所述重組慢病毒表達(dá)載體是在慢病毒載體 pCDH-CMV-MCS-EFl-GFP-T2A-Puro的多克隆位點(diǎn)插入序列如SEQ ID NO :1所示的人胰島素 原的基因序列，獲得含有人胰島素原基因的重組慢病毒表達(dá)載體；所述人胰島素原的基因 序列插入慢病毒載體EcoRl和BamHl位點(diǎn)之間。
[0012] 胰島素本身并不是胰島素基因控制合成的直接產(chǎn)物，其直接產(chǎn)物是前胰島素原 (pr印roinsulin)。它由NH2-末端信號(hào)序列（稱為信號(hào)肽），B鏈、C肽（又叫連接肽， connecting piptide)和具COOH-末端的A鏈等部分組成的單鏈由N端至C端的連接順序 為S-B-ARG-Arg-C-Lys-Arg-A，其中S為信號(hào)肽，C代表C-肽，由35個(gè)氨基酸殘基組成，A 和B分別為胰島素的A鏈和B鏈。全長(zhǎng)119個(gè)氨基酸殘基。信號(hào)肽由24個(gè)氨基酸殘基組 成，富含疏水氨基酸。在信號(hào)肽的作用下，正在合成的肽鏈進(jìn)入內(nèi)質(zhì)網(wǎng)腔，經(jīng)過信號(hào)肽酶的 切割作用，移去信號(hào)肽，形成胰島素原。胰島素原分子發(fā)生折疊，使其2個(gè)末斷片段A和B 之間形成正確的二硫鍵，并最終包裝成分泌顆粒的形式儲(chǔ)藏在高爾基體中。當(dāng)機(jī)體需要時(shí)， 高爾基體中的轉(zhuǎn)換酶（convertase)PC3和PC2-一類與枯草蛋白酶相關(guān)的內(nèi)切蛋白酶一便 會(huì)分別對(duì)胰島素原分子中的B/C和C/A連接點(diǎn)發(fā)生切割作用，再在羧肽酶的作用下的分別 切去Arg-Arg和Arg-Lys堿性二肽，從而移走了一段長(zhǎng)度為31個(gè)氨基酸的C肽，成為成熟 的胰島素。
[0013] 一種重組慢病毒顆粒，將上述得到的重組慢病毒表達(dá)載體和慢病毒包裝質(zhì)粒共同 轉(zhuǎn)染宿主細(xì)胞后得到的包裝體即為重組慢病毒顆粒。慢病毒載體包含了包裝、轉(zhuǎn)染、穩(wěn)定整 合所需要的遺傳信息，是慢病毒載體系統(tǒng)的主要組成部分。攜帶有外源基因的慢病毒載體 在慢病毒包裝質(zhì)粒、細(xì)胞系的輔助下，經(jīng)過病毒包裝成為有感染力的病毒顆粒，通過感染細(xì) 胞或活體組織，實(shí)現(xiàn)外源基因在細(xì)胞或活體組織中表達(dá)。
[0014] 對(duì)于載體的選擇，本發(fā)明選用慢病毒載體，慢病毒（IentiVirus)是基因轉(zhuǎn)染的工 具之一，可以將外源基因或外源的shRNA有效地整合到宿主染色體上，從而達(dá)到持久性表 達(dá)目的序列的效果。它對(duì)分裂細(xì)胞和非分裂細(xì)胞均具有感染能力，并且轉(zhuǎn)染效率高，能夠比 較方便快捷地實(shí)現(xiàn)目的基因或目的shRNA的長(zhǎng)期、穩(wěn)定表達(dá)。所以，在體外實(shí)驗(yàn)及體內(nèi)實(shí)驗(yàn) 的研究中，慢病毒[1]己經(jīng)成為表達(dá)外源基因或外源shRNA的常用載體形式之一，并且正在 獲得越來越廣泛的應(yīng)用。慢病毒是一種無(wú)包膜的雙鏈DNA病毒，二十面體對(duì)稱，蛋白外殼 主要由240個(gè)六鄰體和12個(gè)五鄰體組成。五鄰體是頂角殼粒，由基部和纖維組成，纖維的 節(jié)區(qū)是慢病毒與其相應(yīng)的細(xì)胞表面受體CAR結(jié)合的部位，介導(dǎo)慢病毒與受體細(xì)胞的接觸。 人類慢病毒共有51個(gè)血清型，目前應(yīng)用的慢病毒載體主要是在人慢病毒亞群的Ad2和Ads 的基礎(chǔ)上構(gòu)建的。慢病毒基因組長(zhǎng)36kb.基因組兩端各有長(zhǎng)100bp-150bp的末端反向重復(fù) 序列ITR，是病毒DNA復(fù)制的起始點(diǎn)，亦是復(fù)制包裝必需的順式作用元件。病毒體進(jìn)入細(xì)胞 后，基因組以病毒DNA是否開始復(fù)制為界限，分為早期和晚期基因表達(dá)兩個(gè)時(shí)期。早期基因 (Ei-Ea)編碼不同的基因表達(dá)調(diào)節(jié)因子，調(diào)控病毒基因表達(dá)。晚期基因編碼病毒結(jié)構(gòu)蛋白， 由晚期主要啟動(dòng)子MLP啟動(dòng)表達(dá)。野生型慢病毒最大外源基因容量約為2kb，將病毒非必需 基因組缺失，則可增加攜帶外源基因容量，又不影響病毒在包裝細(xì)胞中復(fù)制增殖。理論上除 慢病毒基因組兩端約500bp的順式結(jié)構(gòu)是復(fù)制和包裝所必需的結(jié)構(gòu)外，其他結(jié)構(gòu)均可被替 換成外源基因。慢病毒源性載體最主要的優(yōu)點(diǎn)是安全性與穩(wěn)定性好，易于制備、純化；病毒 滴度高，插入的外源基因片段長(zhǎng)，宿主細(xì)胞種類廣泛；可感染處于不同周期的細(xì)胞，轉(zhuǎn)導(dǎo)效 率較高，且無(wú)致突變的危險(xiǎn)，本發(fā)明選用載體為pCDH-CMV-MCS-EFI-GFP-T2A-Puro。
[0015] 優(yōu)選的，所述宿主細(xì)胞為293FT。
[0016] 一種表達(dá)人外源胰島素原的人造血干細(xì)胞，所述表達(dá)人外源胰島素原的人造血干 細(xì)胞是轉(zhuǎn)染有重組慢病毒顆粒的人造血干細(xì)胞，所述的人造血干細(xì)胞為人臍帶血造血干細(xì) 胞。
[0017] 優(yōu)選的，所述干細(xì)胞為人臍帶血造血干細(xì)胞⑶34+ ;和其他來源的造血干細(xì)胞相 t匕，臍帶血造血干細(xì)胞具有造血活性高、免疫原性低和采集容易等優(yōu)點(diǎn)。在本發(fā)明中，我 們分離人臍帶血造血干細(xì)胞（UCB CD34+)，再利用攜帶人胰島素原的慢病毒顆粒感染UCB ⑶34+，利用GFP體內(nèi)體外容易跟蹤監(jiān)測(cè)的優(yōu)點(diǎn)和puromycin篩選標(biāo)志，篩選獲得表達(dá)人胰 島素原的UCB CD34+細(xì)胞（UCB CD34+/proinsulin)，從而獲得一種表達(dá)人外源胰島素原的 人造血干細(xì)胞。
[0018] 本發(fā)明還提供了一種表達(dá)人外源胰島素原的人造血干細(xì)胞的體外擴(kuò)增方法，該方 法在單獨(dú)使用CHIR99021或者LiCl，不需要其他細(xì)胞因子的條件下，培養(yǎng)7天，表達(dá)人外 源胰島素原的人造血干細(xì)胞（UCB HSCs/proinsulin)數(shù)量擴(kuò)增約10倍，擴(kuò)增細(xì)胞保持原 始細(xì)胞的生物學(xué)特性，確保1份臍帶血來源的造血干細(xì)胞，通過擴(kuò)增能夠用于1-3次標(biāo)準(zhǔn) 的造血干細(xì)胞移植，用于糖尿病治療；所述CHIR99021濃度為3uM-5uM，所述LiCl濃度為 4mM-10mM。本發(fā)明中，通過建立了 LiCl代替細(xì)胞因子擴(kuò)增UCB⑶34+/proinsulin的方案， LiCl是獲準(zhǔn)臨床應(yīng)用的制劑，無(wú)需進(jìn)一步臨床試驗(yàn)。
[0019] 本發(fā)明還提供了一種重組慢病毒表達(dá)載體的制備方法，包括如下進(jìn)行的步驟：
[0020] (I) Insert DNA 的制備
[0021] 將GenBank NO. NM_000207人胰島素原的基因序列人工合成至pMD18-T simple載 體中，得到包含人胰島素原基因序列的PMD18-T simple質(zhì)粒，將包含人胰島素原基因序列 的PMD18-T simple質(zhì)粒使用EcoR I和BamH I進(jìn)行酶切得到345bp的DNA片段，命名為 Insert DNA ；
[0022] (2) Vector DNA 的制備
[0023] 將慢病毒載體 pCDH-CMV-MCS-EFl-GFP-T2A-Puro 使用 EcoR I 和 BamH I 進(jìn)行酶 切得到8. 2Kbp的DNA片段，命名為Vector DNA ;
[0024] (3)重組慢病毒表達(dá)載體的制備
[0025] 將步驟（1)中得到的Insert DNA和步驟（2)中得到的Vector DNA采用 Solution I進(jìn)行連接，獲得含有人胰島素原基因的重組慢病毒表達(dá)載體p⑶H-CMV-insuli n-EFl-GFP-T2A-Puro〇
[0026] 本發(fā)明所述的表達(dá)人外源胰島素原的人造血干細(xì)胞在制備用于治療糖尿病制劑 中的應(yīng)用。以人臍帶血造血干細(xì)胞為例，將本發(fā)明成功獲得的表達(dá)人proinsulin的UCB HSCs，在體外進(jìn)行擴(kuò)增，擴(kuò)增后的細(xì)胞移植入免疫缺陷型小鼠（N0D/SCID)造血干細(xì)胞移植 模型中，表達(dá)proinsulin的UCB HSCs在體內(nèi)能夠進(jìn)行正常的自我更新和多向分化，UCB HSCs分泌的proinsulin能夠激活insulin受體及其下游靶基因，移植到小鼠的UCB HSCs 約6周后能夠顯著減低I型糖尿病小鼠的血糖，在觀察6個(gè)月期間維持降低血糖的活性。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0027] 圖 IFACS 分析人臍帶血造血干細(xì)胞（CD34+)感染 pCDH-CMV-insulin-EFl-GFP-T2 A-Puro慢病毒后第2天GFP的表達(dá)結(jié)果。
[0028] 圖 2western blotting 分析 UCBCD34+細(xì)胞人 proinsulin 的表達(dá)（其中 1 :感染 pCDH-CMV-MCS-EFl-GFP-T2A-Puro慢病毒的UCBCD34+ ;2 :感染pCDH-CMV-insulin-EFl-GFP -T2A-Puro 慢病毒的 UCB CD34+)。
[0029] 圖3Real_time PCR檢測(cè)胰島素受體IR及其靶基因 Glutl的表達(dá)（其中，A為 UCBCD34+/control ;B 為 UCBCD34+/proinsulin)。

【具體實(shí)施方式】
[0030] 所舉實(shí)施例是為了更好地對(duì)本發(fā)明的內(nèi)容進(jìn)行說明，但并不是本發(fā)明的內(nèi)容僅限 于所舉實(shí)施例。所以熟悉本領(lǐng)域的技術(shù)人員根據(jù)上述
【發(fā)明內(nèi)容】
對(duì)實(shí)施方案進(jìn)行非本質(zhì)的改 進(jìn)和調(diào)整，仍屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。
[0031] 以下實(shí)施例中，人源胰島素原（preproinsulin)基因序列如SEQ ID NO :1所示。
[0032] 實(shí)施例1重組慢病毒表達(dá)載體的構(gòu)建
[0033] (I) Insert DNA 的制備
[0034] 根據(jù)GenBank提供的人胰島素原基因 mRNA序列（GenBank NO. NM_000207)，由 TaKaRa公司在其序列5 '端加 EcoR I的序列（5 ' -GAATTC-3 '），3 '端加 BamHI的序列 (5' -GGATCC-3'），共12個(gè)核苷酸，人工合成的人胰島素原基因包括酶切位點(diǎn)，共345bp，將 該人工合成的人胰島素原基因合成至PMD18-T simple載體中，得到包含人胰島素原基因序 列的pMD18-T simple質(zhì)粒，通過DNA序列分析，證實(shí)合成preproinsulin的序列完全正確。
[0035] 將包含人胰島素原基因序列的pMD18_T simple質(zhì)粒使用EcoR I /BamH I進(jìn)行酶 切，步驟如下：
[0036] 1)按照表1所示，于I. 5ml離心管中在冰上配制酶切反應(yīng)體系（50 μ 1體系）；
[0037] 表1酶切反應(yīng)體系（50 μ 1體系）
[0038]

【權(quán)利要求】
1. 一種重組慢病毒表達(dá)載體，其特征在于：所述重組慢病毒表達(dá)載體是在慢病毒載體 pCDH-CMV-MCS-EFl-GFP-T2A-Puro的多克隆位點(diǎn)插入序列如SEQ ID NO :1所示的人胰島素 原的基因序列，獲得含有人胰島素原基因的重組慢病毒表達(dá)載體；所述人胰島素原的基因 序列插入慢病毒載體EcoRl和BamHl位點(diǎn)之間。
2. -種重組慢病毒顆粒，其特征在于：將權(quán)利要求1所述的重組慢病毒表達(dá)載體和慢 病毒包裝質(zhì)粒共同轉(zhuǎn)染宿主細(xì)胞后得到的包裝體即為重組慢病毒顆粒。
3. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的一種重組慢病毒顆粒，其特征在于，所述宿主細(xì)胞為293FT。
4. 一種表達(dá)人外源胰島素原的人造血干細(xì)胞，其特征在于，所述表達(dá)人外源胰島素原 的人造血干細(xì)胞是轉(zhuǎn)染有權(quán)利要求2或3所述的重組慢病毒顆粒的人造血干細(xì)胞，所述的 人造血干細(xì)胞為人臍帶血造血干細(xì)胞。
5. 權(quán)利要求4所述的表達(dá)人外源胰島素原的人造血干細(xì)胞的體外擴(kuò)增方法，其特征在 于，在單獨(dú)使用CHIR99021或者LiCl，不需要其他細(xì)胞因子的條件下，培養(yǎng)7天，UCB HSCs/ proinsulin數(shù)量擴(kuò)增10倍，擴(kuò)增細(xì)胞保持原始細(xì)胞的生物學(xué)特性；所述CHIR99021濃度為 3uM-5uM，所述 LiCl 濃度為 4mM-10mM。
6. 權(quán)利要求1所述的重組慢病毒表達(dá)載體的制備方法，其特征在于，包括如下進(jìn)行的 步驟： (1) Insert DNA 的制備 將GenBank NO. NM_000207人胰島素原的基因序列人工合成至pMD18-T simple載體 中，得到包含人胰島素原基因序列的PMD18-T simple質(zhì)粒，將包含人胰島素原基因序列 的PMD18-T simple質(zhì)粒使用EcoR I和BamH I進(jìn)行酶切得到345bp的DNA片段，命名為 Insert DNA； (2) Vector DNA 的制備 將慢病毒載體pCDH-CMV-MCS-EFl-GFP-T2A-Puro使用EcoR I和BamH I進(jìn)行酶切得 至Ij 8. 2Kbp 的 DNA 片段，命名為 Vector DNA ; (3) 重組慢病毒表達(dá)載體的制備 將步驟（1)中得到的Insert DNA和步驟（2)中得到的Vector DNA采用Solution I 進(jìn)行連接，獲得含有人胰島素原基因的重組慢病毒表達(dá)載體P⑶H-CMV-insulin-EFl-GFP-T 2A-Puro 〇
7. 權(quán)利要求4所述的表達(dá)人外源胰島素原的人造血干細(xì)胞在制備用于治療糖尿病制 劑中的應(yīng)用。
【文檔編號(hào)】C12N15/66GK104313054SQ201410493652
【公開日】2015年1月28日 申請(qǐng)日期:2014年9月24日 優(yōu)先權(quán)日:2014年9月24日
【發(fā)明者】葉治家, 韓月雯, 湯玲 申請(qǐng)人:中國(guó)人民解放軍第三軍醫(yī)大學(xué)