專利名稱：頜下腺特異表達多拷貝人源ngf基因的轉基因小鼠構建的制作方法
技術領域：
本發明涉及轉基因技術領域，具體地涉及頜下腺特異表達多拷貝人源NGF基因的轉基因小鼠構建。基因組，是分子生物學的專有名詞，其就是指單倍體細胞中包括編碼序列和非編碼序列在內的全部DNA分子，而BAC是指其中的一個比較長的片段。
背景技術：
目前，臨床使用的NGF多為動物(小鼠)基因表達產物或為單拷貝人源NGF基因的轉基因小鼠生產，因此小鼠頜下腺中NGF的表達量有限。因此，如何在保證小鼠頜下腺中特異性表達，同時能夠增加其在頜下腺中的表達量是人們有待解決的技術問題。
發明內容
本發明的目的是提供頜下腺特異表達多拷貝人源NGF基因的轉基因小鼠構建，通過如下步驟實現:(I)將5-6個hNGF基因串聯并克隆到小鼠的KLK1B22基因的啟動子后面；(2)所述小鼠的KLK1B22基因的啟動子從BAC或基因組上面克隆，并采用ATG上游2kb左右的序列；(3)將所述小鼠的KLK1B22基因啟動子的區域中REl和RE2之間的片段從載體上切下來，且所述REl和RE2之間的片段包括KLK1B22基因啟動子及5_6個hNGF基因；(4)將切下來的所述REl 和RE2之間的片段中的hNGF基因片段純化；(5)將經過純化的hNGF基因片段通過原核顯微注射的方法注射到小鼠受精卵細胞核內，以生產出具有在小鼠頜下腺內特異表達的多拷貝人源NGF基因的轉基因小鼠。與現有技術相比，本發明具有如下有益效果:通過上述技術方案，本發明提供的頜下腺特異表達多拷貝人源NGF基因的轉基因小鼠構建，由于所述REl和RE2之間的片段包括5-6個hNGF基因，當把經過純化的hNGF基因片段通過原核顯微注射的方法注射到小鼠受精卵細胞核內，就可以生產出能夠表達多拷貝人源NGF基因的轉基因小鼠。
具體實施例方式下面將對本發明實施例中的技術方案進行清楚、完整地描述。小鼠的KLK1B22基因啟動子區域為chr7:51367043_51368116，長度為1074bp，其序列為:chr7:51367043-51368116TGTTGAGGGACATATGGGTTCTTTCCACCTTCTGGCTATTATAAAAAGGGCTGCTATGAACATAGTATAACATGTATCCTTATTACCAGTTGGAACATCTTCTGGGTATATGCCCAGGAGAGGTATTGCTGGATCTACCAGTAGTGTCCAGTTTTCTGAGGAACCTCCAGACTGATTTCCAGAGTGGTTGTATAAGCTTGCAAACCCACCAGCAATGGAGGAGTGTTCCTCTTTCTCCAC
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CCTGTTACCATGAGGTTCCTGATCCTGTTCCTAACCCTGTCCCTAGGAGGGATT本發明所提供的頜下腺特異表達多拷貝人源NGF基因的轉基因小鼠構建，通過如下步驟實現:(I)將5-6個hNGF基因串聯并克隆到小鼠的KLK1B22基因的啟動子后面；(2)所述小鼠的KLK1B22基因的啟動子從BAC或基因組上面克隆，并采用ATG上游2kb左右的序列；(3)將所述小鼠的KLK1B22基因啟動子的區域中REl和RE2之間的片段從載體上切下來，且所述REl和RE2之間的片段包括KLK1B22基因啟動子及5_6個hNGF基因；(4)將切下來的所述REl和RE2之間的片段中的hNGF基因片段純化；(5)將經過純化的hNGF基因片段通過原核顯微注射的方法注射到小鼠受精卵細胞核內，以生產出具有在小鼠頜下腺內特異表達的多拷貝人源NGF基因的轉基因小鼠。由此可見，本發明提供的頜下腺特異表達多拷貝人源NGF基因的轉基因小鼠構建，由于所述REl和RE2之間的片段包括5-6個hNGF基因，當把經過純化的hNGF基因片段通過原核顯微注射的方法注射到小鼠受精卵細胞核內，就可以生產出能夠表達多拷貝人源NGF基因的轉基因小鼠。再通過鑒定獲得穩定遺傳的多拷貝hNGF轉基因小鼠，繁殖擴大種群，就可以高效率生產人源化NGF。
對所公開的實施例的上述說明，使本領域專業技術人員能夠實現或使用本發明。對這些實施例的多種修改對本領域的專業技術人員來說將是顯而易見的，本文中所定義的一般原理可以在不脫離本發明的精神或范圍的情況下，在其它實施例中實現。因此，本發明將不會被限制于本文所示的這些實施例，而是要符合與本文所公開的原理和新穎特點相一致的最寬的范圍。
權利要求
1.頜下腺特異表達多拷貝人源NGF基因的轉基因小鼠構建，其特征是，包括如下步驟: (1)將5-6個hNGF基因串聯并克隆到小鼠的KLK1B22基因的啟動子后面； (2)所述小鼠的KLK1B22基因的啟動子從BAC或基因組上面克隆，并采用ATG上游2kb左右的序列； (3)將所述小鼠的KLK1B22基因啟動子的區域中REl和RE2之間的片段從載體上切下來，且所述REl和RE2之間的片段包括KLK1B22基因啟動子及5_6個hNGF基因； (4)將切下來的所述REl和RE2之間的片段中的hNGF基因片段純化； (5)將經過純化的hNGF基因片段通過原核顯微注射的方法注射到小鼠受精卵細胞核內，以生產出具有在小鼠 頜下腺內特異表達的多拷貝人源NGF基因的轉基因小鼠。
全文摘要
本發明公開了頜下腺特異表達多拷貝人源NGF基因的轉基因小鼠構建，包括如下步驟(1)將5-6個hNGF基因串聯并克隆到小鼠的KLK1B22基因的啟動子后面；(2)小鼠的KLK1B22基因的啟動子從BAC或基因組上面克隆，并采用ATG上游2kb左右的序列；(3)將小鼠的KLK1B22基因啟動子的區域中RE1和RE2之間的片段從載體上切下來，且所述RE1和RE2之間的片段包括KLK1B22基因啟動子及5-6個hNGF基因；(4)將切下來hNGF基因片段純化；(5)將經過純化的hNGF基因片段注射到小鼠受精卵細胞核內，以生產出具有在小鼠頜下腺內特異表達的多拷貝人源NGF基因的轉基因小鼠。
文檔編號C12N15/89GK103146706SQ20121055409
公開日2013年6月12日 申請日期2012年12月19日 優先權日2012年12月19日
發明者毛富祥, 左從林, 李洪貞, 鄧樂, 官敏 申請人:昭衍(蘇州)新藥研究中心有限公司