體外模擬胃腸消化制備綠鰭馬面鲀魚皮抗氧化肽液的方法
【專利摘要】本發明涉及體外模擬胃腸消化制備綠鰭馬面鲀魚皮抗氧化肽液的方法，屬于食品加工技術和蛋白利用【技術領域】。采用的制備工藝以綠鰭馬面鲀魚皮為原料，經剪切、烘干、粉碎等預處理后，使用體外模擬胃腸消化技術，由含胃蛋白酶、胰蛋白酶構建的雙酶模擬胃腸消化體系，沸水浴滅酶、調節pH法集成2次離心手段制備魚皮蛋白抗氧化肽液。本發明的制備方法采用雙酶酶解反應體系，極大地提高了魚皮蛋白的水解效率，使原料得以充分利用；體外模擬胃腸消化過程，在37℃水浴中進行，酶解條件溫和，與人體相近，能更好地反映人體的消化過程。
【專利說明】體外模擬胃腸消化制備綠鰭馬面鈍魚皮抗氧化肽液的方法

【技術領域】
[0001] 本發明屬于食品加工技術和蛋白利用【技術領域】，具體涉及利用體外模擬胃腸消化 制備魚皮蛋白抗氧化肽液的方法。

【背景技術】
[0002] 綠鰭馬面飩，亦稱馬面飩、馬面魚，因皮較厚且硬，少部分用于制造飼料魚粉，而大 部分在加工過程中被剝除丟棄，這不僅嚴重污染了環境，而且還造成資源的極大浪費。馬面 魚皮中粗蛋白含量一般在40%以上，其氨基酸組成豐富。之前有報道稱馬面魚皮不能食用， 目前對馬面魚皮的開發利用主要有提取氨基酸、制膠、制革、提取食用水溶性蛋白質，提取 魚皮膠原蛋白及其特性的研究。因此，研究馬面魚皮蛋白的抗氧化多肽具有可觀的現實意 義和經濟意義。
[0003] 多肽是α-氨基酸以肽鍵連接而成的化合物，也是蛋白質分解的中間體，通常分 子量在200Da到IOOOODa之間，能透過半透膜，不能被三氯乙酸及硫酸銨等沉淀。隨著人們 發現某些蛋白質具有清除生物體內過量游離基，抑制脂質氧化作用后，肽的抗氧化性成為 一大熱點。抗氧化肽的制取方法主要有直接提取法、酸堿水解法、酶水解法、發酵法、化學合 成法和基因重組法。針對魚皮蛋白的結構特性而言，現有的生產工藝、方法依照設計流程主 要可分為兩類： (1)將魚皮干燥、粉碎，采用蛋白酶水解制得蛋白多肽酶解液，最后進行冷凍干燥獲 得多肽粉。直接相關的研究結果很少，就相關技術而言，例如：中國專利CN103431154A， CN102676621B中，直接以菜籽柏或者菜籽分離蛋白質為原料，通過中性蛋白酶或堿性蛋白 酶法水解，獲得功能多肽。
[0004] (2)對魚皮進行預處理，再接種微生物菌種，進行發酵獲得多肽產品。類似的相 關技術有：CN103436581A，CN101654696B中，采用濕法球磨（250-400r/min)聯合纖維素酶 (5-10μ g)預處理l-3h，接著中性蛋白酶酶解，得到粗制多肽溶液；另外有將菜籽柏粉與營 養液混合制備液態發酵培養基，微生物接入液態發酵培養基發酵，固液分離，得到多肽的粗 提液。
[0005] 長期以來，傳統的蛋白酶解法（中性蛋白酶或堿性蛋白酶）和微生物發酵法在制備 魚皮膠原蛋白多肽的工業生產實踐中發揮了很大作用。但由于單一酶酶解效率低，且為維 持最適酶解PH需在酶解過程中不斷添加堿液以維持恒定pH，酶解產物中存在大量鈉鹽，從 而不利于高血壓人群使用等缺點，使該方法存在一定的安全隱患。另外，微生物發酵法，主 要采用黑曲霉、枯草芽孢桿菌、蠟狀芽孢桿菌或橙黃紅酵母等具有較高蛋白酶酶解活力、月旨 肪酶酶解活力、產酸能力的菌株進行發酵生產多肽。該方法中，由于接種微生物的不穩定性 和其他微生物的影響使得到的產品難以達到所需的功能性要求；另一方面，從發酵液中分 離多肽能耗高，廢液量大，產物復雜，安全性不高等缺點也使微生物發酵法不能得以很好利 用。
[0006] 隨著對環境保護，生產監控及產品穩定性等日趨規范及對蛋白資源利用水平要求 認識的不斷重新定義和逐步提高，以上兩種方法的主要不足使得蛋白酶解工藝、方法在工 業生產中的應用前景不佳，將逐步被新的技術和理念所替代。


【發明內容】

[0007] 本發明的目的在于克服現有技術中由于單酶酶解效率不高，酶解反應中不斷調節 PH而大量使用NaOH，增大鹽濃度，酶解產物活性和多肽分子量關聯特征不夠清晰等問題， 提供一種基于模擬人體胃腸消化體系，構建極為安全的魚皮蛋白多肽制備方法。
[0008] 本發明的技術工藝與科學原理如下： 隨著馬面魚資源的積極開發，它已成為我國主要的海產經濟魚類，魚皮資源相當豐富， 使得多肽增值化利用成為其極有前途的方向，基于高效安全的胃腸消化模式，采用胃蛋白 酶、胰蛋白酶雙酶模擬胃腸消化體系，制備具有抗氧化特性且分子量分布明確的魚皮蛋白 多肽；本發明中的胃液消化體系和十二指腸液消化體系是模擬人體消化原理所構筑的雙酶 分步反應體系，模擬胃消化結束時未進行滅酶處理，直接進行模擬十二指腸液消化，有利于 充分酶解消化反應；此外，消化結束時，進行沸水浴終止反應，離心獲取上清液后，調節PH 去除大分子蛋白，進行二次離心，獲得精制的魚皮蛋白抗氧化肽液。其優點是：雙酶作用位 點更多，使得酶解效率更高；沸水浴和調節PH，2次離心能有效去除少量未被酶解的大分子 蛋白，使得所制備的多肽純度更高。
[0009] 本發明的技術構思是創新性地采用雙酶體外模擬胃腸消化技術，提高酶解效率， 采用沸水浴變性蛋白酶和PH等電點沉淀蛋白技術，高效安全的酶解手段和簡單可行的多 肽純化精制工藝集成創新，因此本發明中的方法較傳統方法更適合于大規模開發魚皮蛋白 抗氧化肽液。
[0010] 本發明體外模擬胃腸消化制備魚皮蛋白抗氧化肽液的方法，實施流程圖如圖1所 示，按照下述步驟進行： (1)取烘干的魚皮，粉碎，獲得粗蛋白質量百分含量為40%的魚皮蛋白原料。
[0011] (2)模擬胃腸消化體系： 模擬胃液(稱取〇. 20g NaCl，0. 32g胃蛋白酶，7 mL蒸餾水，0. 7 mL 3mol/L鹽酸，鹽 酸調pH至L 2±0· 1，蒸饋水定容至100 mL。）， 模擬十二指腸液(稱取〇. 70g磷酸二氫鉀溶于25 mL蒸餾水中，振蕩使之完全溶解，力口 入19 1^0.2111〇1/1恥0!1和40 1^蒸餾水，加入1.(^胰蛋白酶，用0.2111〇1/1恥0!1調口!1至 6. 4±0. 1，蒸餾水定容至100 mL。）溫度37°C，消化時間I h。
[0012] (3)在100 mL錐形瓶中加入25 mL模擬胃液，37°C恒溫水浴5min。加入一定質量 的魚皮粉4-8%，迅速渦旋震蕩并快速置于37°C水浴，攪拌酶解4h。然后加入37°C恒溫水浴 5min的模擬十二指腸液175mL，調節pH至6. 4, 37°C恒溫條件下酶解lh。
[0013] (4)沸水浴1〇!1^11終止反應；450〇17^11離心1〇1^11，取上清液調節？!1至4.2， 4500r/min離心30min去除大分子蛋白，獲得魚皮蛋白抗氧化肽液。
[0014] 其中步驟（1)中的魚皮原料是指經烘干、剪切、粉碎后的魚粉，且蛋白含量40%以 上。
[0015] 其中步驟（3)中模擬胃液和模擬十二指腸液消化反應前都進行了 37°C恒溫水浴 5min預熱處理。
[0016] 其中步驟（3)中模擬胃液消化4h后，未進行胃蛋白酶滅酶處理，直接進行模擬 十二指腸液消化Ih。
[0017] 其中步驟（4)進行了沸水浴和調節pH兩種方法結合變性法和等電法沉淀蛋白，集 成2次離心法脫除大分子蛋白。
[0018] 其中步驟（4)中所得的魚皮蛋白多肽中含有分子量為2152Da、1352Da的多肽，兩 者可能與抗氧化活性相關。
[0019] 本發明的有益效果如下： (1) 本發明的制備方法采用胃蛋白酶、胰蛋白酶雙酶酶解反應體系，極大地提高魚皮蛋 白水解效率，充分利用原料，使得廢棄液中的蛋白更少。
[0020] (2)本發明的制備方法是模擬胃腸消化過程，溫度在37°C，條件溫和，并未進行常 規酶解中不斷添加 NaOH維持反應在最適pH進行，反應過程更加綠色；另外，由于模擬最完 美的人體胃腸消化手段，在潛在食品安全方面，較微生物發酵更有優勢。
[0021] (3)本發明的制備方法中沸水浴變性去蛋白和pH等電點沉淀蛋白技術，結合2次 離心分離手段，使得所制備的多肽含量更高，精制過程更加低碳節能、簡便易行。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0022] 圖1是體外模擬胃腸消化制備魚皮蛋白抗氧化肽液的工藝流程圖。
[0023] 圖2是標準分子量蛋白和多肽對照品色譜圖（A)，其中l_67000Da ;2_12500Da ; 3_204Da ； 魚皮抗氧化肽液多肽分子量分布色譜圖（B)，l-2152Da ;2-1352Da ;3-190Da。
[0024] 圖3是游離氨基酸標準品（A)分析測試色譜圖，魚皮原料（B)和魚皮蛋白抗氧化 肽液（C)中游離氨基酸測試色譜圖。

【具體實施方式】
[0025] 本發明采用液相色譜法、氨基酸分析儀、DPPH清除率、（V ·(超氧自由基）清除率 分別測定多肽液中肽分子量分布、游離氨基酸組成及含量、DPPH清除能力和(V ·(超氧自由 基）清除能力。
[0026] (1)膚分子量分布 色譜柱：TSKgel-G2000 SWxl(7. 8mmX 30cm，Tosoh);流動相：0· lmol/L Na2S04+0. Imol/ L磷酸緩沖液（pH6. 7);柱溫30°C ;檢測波長：220 nm ;流速：0. 5 mL/min ;進樣量：10 μ L。 1260型安捷倫液相色譜儀(安捷倫科技貿易公司） (2) 游離氨基酸組成及含量 通過全自動氨基酸分析儀測定游離氨基酸組分和含量。吸取不同消化時間的酶解液 0.1 mL于1.5 mL離心管中，加入0.9 mL 1%的磺基水楊酸，沉淀2h，10000rpm/min離心 15min，取上清液，用0. 22 μ m微膜(水膜)過濾至樣品瓶中，供上機測定，德國Sykam-433D全 自動氨基酸分析儀（SYKAM公司）。
[0027] (3) DPPH 清除能力 2 11^0--!1溶液(在95%乙醇中的濃度為0.1臟〇1/1)與2 1^樣品溶液混合。混合物 在室溫下避光靜置30min，用VIS-7220N型可見分光光度計在517nm處測定吸光度。使用蒸 餾水代替樣品作為對照。j/w·清除率計算公式如下

【權利要求】
1. 體外模擬胃腸消化制備綠鰭馬面飩魚皮蛋白抗氧化肽液的方法，其特征在于按照下 述步驟進行： (1) 取烘干的魚皮，粉碎，獲得粗蛋白質量百分含量為40%的魚皮蛋白原料； (2) 模擬胃腸消化體系： 模擬胃液(稱取〇. 20g NaCl，0. 32g胃蛋白酶，7 mL蒸餾水，0. 7 mL 3mol/L鹽酸，鹽 酸調pH至1. 2±0· 1，蒸饋水定容至100 mL ;)， 模擬十二指腸液(稱取〇. 70g磷酸二氫鉀溶于25 mL蒸餾水中，振蕩使之完全溶解，力口 入19 mL 0.2mol/L NaOH和40 mL蒸餾水，加入l.Og胰蛋白酶，用0.2mol/L NaOH調pH至 6. 4±0. 1，蒸餾水定容至100 mL ;)溫度37°C，消化時間1 h ; (3) 在100 mL錐形瓶中加入25 mL模擬胃液，37°C恒溫水浴5min ; 加入一定質量的魚皮粉4-8%，迅速渦旋震蕩并快速置于37°C水浴，攪拌酶解4h ; 然后加入37°C恒溫水浴5min的模擬十二指腸液175mL，調節pH至6. 4, 37°C恒溫條件 下酶解lh ; (4) 沸水浴10 min終止反應；4500r/min離心lOmin，取上清液調節pH至4. 2,4500r/ min離心30min去除大分子蛋白，獲得魚皮蛋白抗氧化肽液。
2. 根據權利要求1所述的體外模擬胃腸消化制備綠鰭馬面飩魚皮蛋白抗氧化肽液的 方法，其特征在于其中步驟（1)中的魚皮原料是指經烘干、剪切、粉碎后的魚粉，且蛋白含量 40%以上。
3. 根據權利要求1所述的體外模擬胃腸消化制備綠鰭馬面飩魚皮蛋白抗氧化肽液的 方法，其特征在于其中步驟（3)模擬胃液和模擬十二指腸液消化反應前都進行了 37°C恒溫 水浴5min預熱處理。
4. 根據權利要求1所述的體外模擬胃腸消化制備綠鰭馬面飩魚皮蛋白抗氧化肽液的 方法，其特征在于其中步驟（4)進行了沸水浴和調節pH兩種方法結合變性法和等電法沉淀 蛋白，集成2次離心法脫除大分子蛋白。
5. 根據權利要求1所述的體外模擬胃腸消化制備綠鰭馬面飩魚皮蛋白抗氧化肽液 的方法，其特征在于其中步驟（4)中所得的所得的魚皮蛋白多肽中含有分子量為2152Da、 1352Da的多肽。
【文檔編號】C12P21/06GK104263789SQ201410515066
【公開日】2015年1月7日 申請日期:2014年9月29日 優先權日:2014年9月29日
【發明者】周存山, 馬海樂, 余筱潔, 何榮海, 秦曉佩, 胡佳麗 申請人:江蘇大學