重組紅鰭東方鲀抗菌肽Defb-1蛋白的制備方法
【專利摘要】本發明公開一種重組紅鰭東方鲀抗菌肽Defb-1蛋白的制備方法，是對其成熟肽編碼區進行密碼子優化，采用重疊PCR單向延伸方法獲得經優化的Defb-1蛋白成熟肽編碼序列，連入pET-32a(+)載體，獲得重組表達質粒，并轉化至大腸桿菌TransB（DE3）感受態細胞中；通過IPTG誘導獲得重組蛋白的可溶性表達；利用重組蛋白含有的His標簽，對重組蛋白進行鑒定和純化，可以快速高效獲得重組紅鰭東方鲀抗菌肽。不僅操作簡單，降低制作成本，更主要的是蛋白結構不受破壞，重組蛋白純度好、得率高且不易降解，適應于工業化生產，表達產物可用于制作飼料添加劑、產品保鮮劑和醫藥產品等。
【專利說明】重組紅鰭東方鈍抗菌肽Defb-1蛋白的制備方法
【技術領域】
[0001]本發明屬于生物基因工程【技術領域】，尤其涉及一種操作簡便、成本低廉、重組蛋白純度好、得率高、適應于工業規模化生產的重組紅鰭東方飩抗菌肽Defb-1蛋白的制備方法。
【背景技術】
[0002]紅鰭東方飩(/?濟/在我國主要分布于黃海、渤海和東海，是近海底層肉食性魚類，其肉味鮮美，具有很高的食用價值，在紅鰭東方飩的生殖腺和肝臟等內臟中產生河豚毒素，其高活性和高特異性的生物特征具有潛在的醫藥開發價值，在臨床上具有廣闊的前景。抗菌肽是一類具有殺菌抑菌功能的小分子多肽，紅鰭東方飩抗菌肽Defb-1對革蘭氏陰性菌和陽性菌都有較好的抑菌殺菌功效，同時還會增強魚體的免疫反應；而其本身又是一種魚源多肽，不會殘留，不會引發生態問題。然而，從紅鰭東方飩中直接提取該蛋白的操作復雜、成本高、產量少，不能大規模產業化生產。

【發明內容】

[0003]本發明是為了解決現有技術所存在的上述技術問題，提供一種操作簡便、成本低廉、重組蛋白純度好、得率高、適應于工業規模化生產的重組紅鰭東方飩抗菌肽Defb-1蛋白的制備方法。
[0004]本發明的技術解決方案是:一種重組紅鰭東方飩抗菌肽Defb-1蛋白的制備方法，其特征按如下步驟進行:
a.以pET32a+載體為模板，用引物pETF19/pETR19進行PCR擴增；所述引物pETF19/pETR19序列如下:`
PETF19:5， -GGGAAAGGCTTCCAGTGCTGCTACCGACGACGACGACAAG-3’ ；pETR19:5， -TCTCAGTGGTGGTGGTGGT-3，；
b.以a步驟反應產物的20倍稀釋液為模板，用引物76F20/pETR19進行PCR;所述引物76F20序列如下:
5’ -AAATGTTTTTTGGGCCTCTGGGCTGTGGGAAAGGCTTCCAGTGCTG-3’ ；
c.以b步驟反應產物的20倍稀釋液為模板，用引物50F21/pETR19進行PCR擴增；所述引物50F21序列如下:
5’ -TGTAGGAAGGTTTGCCTCCCAACTGAAATGTTTTTTGGGCCTCTGG-3’ ；
d.以c步驟反應產物的20倍稀釋液為模版，用引物25F21/pETR19進行PCR擴增，所述引物25F21序列如下:
5’ -ACTTGTCCAAGCCTGAGCGGCGTGTGTAGGAAGGTTTGCCTCCCA-3’ ；
e.以d步驟反應產物的20倍稀釋液為模板，用引物NcoIF/XhoIR進行PCR擴增，所述引物NcoIF/XhoIR序列如下:
上游引物 NcoIF:5’ -CATGCCATGGGCACTTGTCCAAGCCTGAG-3’ ；下游引物 XhoIR:5’ -CCGCTCGAGTCAGCAGCACTGGAAGCCTT-3’ ；
f.電泳回收e步驟PCR產物與克隆載體pMD19T連接，轉入大腸桿菌感受態細胞DH5ci，再涂布于含氨芐青霉素、IPTG和X-gal的LB固體平板上培養，通過藍白斑篩選陽性克隆，選擇120bp大小的條帶進行回收；
g.用限制性內切酶AfcoI和通ol分別雙酶切f步驟所回收產物的質粒和表達載體pET-32a(+)，將得到的兩種目的基因片斷用T4 DNA連接酶連接，將連接產物轉化入大腸桿菌感受態細胞DH5 α進行培養并篩選提取重組表達質粒；
h.將所提取的重組表達質粒轉化入大腸桿菌表達菌株TransB(DE3)大腸桿菌感受態細胞內，挑取單克隆經IPTG誘導后收集菌體；
1.將收集的菌體用pH8.0、0.5M Tris-HCl緩沖溶液重懸，進行超聲波破碎，離心取上清，過N1-TNA柱純化，收集洗脫液；
j.將洗脫液透析，獲得重組表達蛋白。
[0005]所述a步驟的PCR反應條件為:94°C預變性5min，94°C變性30s，56°C復性30s、72°C延伸20s，循環30次，72°C延伸7min，4°C保存；
所述b步驟的PCR反應條件為:94°C預變性5min，94°C變性30s，58°C復性30s、72°C延伸20s，循環30次，72°C延伸7min，4°C保存；
所述c步驟的PCR反應條件為:94°C預變性5min，94°C變性30s，59°C復性30s、72°C延伸20s，循環30次，72°C延伸7min，4°C保存；
所述d步驟的PCR反應條件為`:94°C預變性5min，94°C變性30s、60°C復性30s、72°C延伸20s，循環30次，72°C延伸7min，4°C保存；
所述e步驟的PCR反應條件為:94°C預變性5min，94°C變性30s，55°C復性30s、72°C延伸20s，循環30次，72°C延伸7min，4°C保存。
[0006]本發明設計了針對紅鰭東方飩抗菌肽Defb-1蛋白編碼序列的引物，對其成熟肽編碼區進行密碼子優化，采用重疊PCR單向延伸方法獲得經優化的Defb-1蛋白成熟肽編碼序列，連入pET-32a(+)載體,獲得重組表達質粒，并轉化至大腸桿菌TransB (DE3)感受態細胞中；通過IPTG誘導獲得重組蛋白的可溶性表達；利用重組蛋白含有的His標簽，對重組蛋白進行鑒定和純化，可以快速高效獲得重組紅鰭東方飩抗菌肽。不僅操作簡單，降低制作成本，更主要的是蛋白結構不受破壞，重組蛋白純度好、得率高且不易降解，適應于工業化生產，表達產物可用于制作飼料添加劑、產品保鮮劑和醫藥產品等。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0007]圖1為本發明實施例的PCR產物瓊脂糖凝膠電泳圖。
[0008]圖2為本發明實施例的重組表達產物SDS-PAGE凝膠電泳圖及Western bloting鑒定結果。
[0009]圖3為本發明實施例純化后重組蛋白的SDS-PAGE凝膠電泳圖。
[0010]圖4為本發明實施例重組蛋白的Elisa鑒定結果。
【具體實施方式】
[0011]按如下步驟進行:a.以pET32a+載體為模板，用引物pETF19/pETR19進行PCR擴增；所述引物pETF19/pETR19序列如下:
PETF19:5， -GGGAAAGGCTTCCAGTGCTGCTACCGACGACGACGACAAG-3’ ；pETR19:5， -TCTCAGTGGTGGTGGTGGT-3，；
PCR反應條件為:94°C預變性5min，94°C變性30s，56°C復性30s、72°C延伸20s，循環30 次，72 °C 延伸 7min，4°C 保存；
b.以a步驟反應產物的20倍稀釋液為模板，用引物76F20/pETR19進行PCR;所述引物76F20序列如下:
5’ -AAATGTTTTTTGGGCCTCTGGGCTGTGGGAAAGGCTTCCAGTGCTG-3’ ；
PCR反應條件為:94°C預變性5min，94°C變性30s，58°C復性30s、72°C延伸20s，循環30 次，72 °C 延伸 7min，4°C 保存；
c.以b步驟反應產物的20倍稀釋液為模板，用引物50F21/pETR19進行PCR擴增；所述引物50F21序列如下:
5’ -TGTAGGAAGGTTTGCCTCCCAACTGAAATGTTTTTTGGGCCTCTGG-3’ ；
PCR反應條件為:94°C預變性5min，94°C變性30s，59°C復性30s、72°C延伸20s，循環30 次，72 °C 延伸 7min，4°C 保存；
d.以c步驟反應產物 的20倍稀釋液為模版，用引物25F21/pETR19進行PCR擴增，所述引物25F21序列如下:
5’ -ACTTGTCCAAGCCTGAGCGGCGTGTGTAGGAAGGTTTGCCTCCCA-3’ ；
PCR反應條件為:94°C預變性5min，94°C變性30s、60°C復性30s、72°C延伸20s，循環30 次，72 °C 延伸 7min，4°C 保存；
e.以d步驟反應產物的20倍稀釋液為模板，用引物AfcoI/ZAoI進行PCR擴增，所述引物AfcoI/lSoI序列如下:
上游引物Afco1:5’ -CATGCCATGGGCACTTGTCCAAGCCTGAG-3’ ；
下游引物IAo1:5’ -CCGCTCGAGTCAGCAGCACTGGAAGCCTT-3’ ；
PCR反應條件為:94°C預變性5min，94°C變性30s，55°C復性30s、72°C延伸20s，循環30 次，72 °C 延伸 7min，4°C 保存；
a^e步驟PCR反應產物瓊脂糖凝膠電泳結果如圖1所示:圖1中1、2、3、4分別為a、b、
c、d步驟延伸PCR產物，5為e步驟擴增反應產物，M為DL2000bp ；
f.電泳回收e步驟PCR產物與克隆載體pMD19T連接，轉入大腸桿菌感受態細胞DH5ci，再涂布于含氨芐青霉素、IPTG和X-gal的LB固體平板上培養，通過藍白斑篩選陽性克隆，選擇120bp大小的條帶進行回收；
按照現有技術方法，對所回收的PCR產物進行測序，其序列如下:ACTTGTCCAAGCCTGAGCGGCGTGTGTAGGAAGGTTTGCCTCCCAACTGAAATGTTTTTTGGGCCTCTGGGCTGTGGGAAAGGCTTCCAGTGCTGC
與天然紅鰭東方飩抗菌肽Defb-1蛋白成熟肽區域序列對比，可以看出:經密碼子優化的DNA序列中，第3號氨基酸Pro (CCC)替換為Pio (CCA)，第7號氨基酸Gly (GGA)替換為Gly (GGC)，第10號氨基酸Arg (AGA)替換為Arg (AGG)，第15號氨基酸Pro (CCC)替換為Pro (CCA)，第19號氨基酸Phe (TTC)替換為Phe (TTT)，第21和26號氨基酸Gly (GGA)替換為 Gly (GGG)，第 28 號氨基酸 Gly (GGA)替換為 Gly (GGC)；
g.用限制性內切酶AfcoI和通ol分別雙酶切f步驟所回收產物的質粒和表達載體pET-32a(+)，將得到的兩種目的基因片斷按摩爾比10:1比例混勻，用T4 DNA連接酶連接，將連接產物轉化入大腸桿菌感受態細胞DH5ci進行培養并挑選單克隆菌落，篩選用T7promoter/ T7 terminator primer通用引物菌檢結果為765bp的陽性克隆,提取重組表達質粒;
h.將所提取的重組表達質粒轉化入大腸桿菌表達菌株TransB(DE3)大腸桿菌感受態細胞內，接種于100ml含氨芐青霉素的LB液體培養基中，37°C 200rpm培養至菌液OD6tltl為
0.6時，向菌液中加入IPTG至總濃度為0.5mM，于4°C培養6h，4°C 6000rpm離心，富集菌體，棄上清，得菌體；
1.將收集的菌體用pH8.0、0.5M Tris-HCl緩沖溶液重懸，將重懸菌體于超聲波破碎(750W 9s/9s 4°C) 25min，將破碎產物于12000rpm 4°C離心20min，取上清。對上清夜進行SDS-PAGE凝膠電泳和Western blotting鑒定(電泳步驟參見蛋白質技術冊),結果如圖2所示=M為蛋白Maker，O為pET32a+載體轉化TransB (DE3)宿主菌誘導后結果，A為重組表達載體轉化TransB (DE3)宿主菌誘導后結果，NC膜為Western blotting鑒定結果；結果表明:重組表達載體表達框正確，表達產物為目的表達產物。
[0012]將上清液加入事先平衡好的N1-NTA柱子中過柱吸附，3倍柱體積Washing Buffer過柱洗漆，IOmL Elution Buffer過柱洗脫,收集洗脫液(具體步驟參見蛋白手冊)；對洗脫液進行SDS-PAGE凝膠電泳，結果如圖3所示:M為蛋白Maker，I為純化后的重組蛋白；結果表明:純化結果為目的融合蛋白，且純度好，得率高； k.將收集的洗脫液充入透析袋中于緩沖液中，4°C透析過夜，收集透析產物。
[0013]對透析產物進行Elasa檢測(具體步驟參見蛋白質技術手冊)，以Ant1-Defensinbeta2抗體為一抗，HRP標記羊抗鼠IgG為二抗的直接Elisa反應；檢測結果如圖4所示:A、B、C、D、E 和 F 分別為 20/200，40/200，60/200，80/200，100/200 和 200/200 稀釋度重組蛋白樣品；G為1%小牛血清蛋白對照；注20/200為20 μ L重組蛋白樣品稀釋至200 μ L。結果表明=Elisa反應OD492結果與重組蛋白樣品濃度呈正相關，結果表明:重組蛋白樣品構象正確。
[0014]按現有技術對透析產物進行測序，結果為與天然重組紅鰭東方飩抗菌肽Defb-1蛋白相同。
【權利要求】
1.一種重組紅鰭東方飩抗菌肽Defb-1蛋白的制備方法，其特征按如下步驟進行: a.以pET32a+載體為模板，用引物pETF19/pETR19進行PCR擴增；所述引物pETF19/pETR19序列如下: PETF19:5， -GGGAAAGGCTTCCAGTGCTGCTACCGACGACGACGACAAG-3’ ；pETR19:5， -TCTCAGTGGTGGTGGTGGT-3，； b.以a步驟反應產物的20倍稀釋液為模板，用引物76F20/pETR19進行PCR;所述引物76F20序列如下:
5’ -AAATGTTTTTTGGGCCTCTGGGCTGTGGGAAAGGCTTCCAGTGCTG-3’ ； c.以b步驟反應產物的20倍稀釋液為模板，用引物50F21/pETR19進行PCR擴增；所述引物50F21序列如下:
5’ -TGTAGGAAGGTTTGCCTCCCAACTGAAATGTTTTTTGGGCCTCTGG-3’ ； d.以c步驟反應產物的20倍稀釋液為模版，用引物25F21/pETR19進行PCR擴增，所述引物25F21序列如下:
5’ -ACTTGTCCAAGCCTGAGCGGCGTGTGTAGGAAGGTTTGCCTCCCA-3’ ； e.以d步驟反應產物的20倍稀釋液為模板，用引物NcoIF/XhoIR進行PCR擴增，所述引物NcoIF/XhoIR序列如下:
上游引物 NcoIF:5’ -CATGCCATGGGCACTTGTCCAAGCCTGAG-3’ ；
下游引物 XhoIR:5’ -CCGCTCGAGTCAGCAGCACTGGAAGCCTT-3’ ； f.電泳回收e步驟PCR產物與克隆載體PMD19T連接，轉入大腸桿菌感受態細胞DH5ci，再涂布于含氨芐青霉素、IPTG和X-gal的LB固體平板上培養，通過藍白斑篩選陽性克隆，選擇120bp大小的條帶進行回收； g.用限制性內切酶AfcoI和通ol分別雙酶切f步驟所回收產物的質粒和表達載體pET-32a(+)，將得到的兩種目的基因片斷用T4 DNA連接酶連接，將連接產物轉化入大腸桿菌感受態細胞DH5 α進行培養并篩選提取重組表達質粒； h.將所提取的重組表達質粒轉化入大腸桿菌表達菌株TransB(DE3)大腸桿菌感受態細胞內，挑取單克隆經IPTG誘導后收集菌體； 1.將收集的菌體用pH8.0、0.5M Tris-HCl緩沖溶液重懸，進行超聲波破碎，離心取上清，過N1-TNA柱純化，收集洗脫液； j.將洗脫液透析，獲得重組表達蛋白。
2.根據權利要求1所述重組紅鰭東方飩抗菌肽Defb-1蛋白的制備方法，其特征在于: 所述a步驟的PCR反應條件為:94°C預變性5min，94°C變性30s，56°C復性30s、72°C延伸20s，循環30次，72°C延伸7min，4°C保存； 所述b步驟的PCR反應條件為:94°C預變性5min，94°C變性30s，58°C復性30s、72°C延伸20s，循環30次，72°C延伸7min，4°C保存； 所述c步驟的PCR反應條件為:94°C預變性5min，94°C變性30s，59°C復性30s、72°C延伸20s，循環30次，72°C延伸7min，4°C保存； 所述d步驟的PCR反應條件為:94°C預變性5min，94°C變性30s、60°C復性30s、72°C延伸20s，循環30次，72°C延伸7min，4°C保存；` 所述e步驟的PCR反應條件為:94°C預變性5min，94°C變性30s，55°C復性30s、72°C延伸20s，循環30次，72℃延伸7min，4℃保存。
【文檔編號】C12N15/12GK103773772SQ201310689151
【公開日】2014年5月7日 申請日期:2013年12月17日 優先權日:2013年12月17日
【發明者】仇雪梅, 徐進, 王秀利, 姜志強, 高長富 申請人:大連海洋大學