高純L-α-氨基酸的生物合成方法
【專(zhuān)利摘要】本發(fā)明公開(kāi)了一種高純L-α-氨基酸的生物合成方法，該方法是在反應(yīng)液中，醛類(lèi)化合物和甘氨酸原料在L-蘇氨酸醛縮酶和L-蘇氨酸脫氨酶復(fù)合酶的催化作用下進(jìn)行酶催化反應(yīng)得到2-酮酸產(chǎn)物；將所得2-酮酸產(chǎn)物在由亮氨酸脫氫酶與甲酸脫氫酶或葡萄糖脫氫酶組成的輔酶催化下進(jìn)行酶催化反應(yīng)，反應(yīng)產(chǎn)物依次經(jīng)過(guò)電滲析脫鹽、活性炭脫色、濃縮結(jié)晶、真空干燥處理，高產(chǎn)率得到高純度L-α-氨基酸晶體；該方法以水相為反應(yīng)體系，環(huán)保、廉價(jià)，設(shè)備要求低、酶可以反復(fù)使用，成本低，滿(mǎn)足工業(yè)化生產(chǎn)。
【專(zhuān)利說(shuō)明】高純L- α -氨基酸的生物合成方法

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及一種新型生物法轉(zhuǎn)化合成L-α -氨基酸及純化濃縮結(jié)晶得到高純度 L- α -氨基酸的方法，屬于生物合成領(lǐng)域。

【背景技術(shù)】
[0002] 氨基酸是組成蛋白質(zhì)的基本物質(zhì)，是人體生命活動(dòng)的必需，它在體內(nèi)擔(dān)負(fù)著合成 肌肉、皮膚、臟器、酶、免疫抗體所必需的成分。一般而言氨基酸分為D型和L型，人體中只 有L型氨基酸才參與代謝，具有生理活性。
[0003] L-正纈氨酸是合成培哚普利、ACE-抑制劑一抗高血壓類(lèi)藥物的關(guān)鍵中間體。L-正 纈氨酸可以通過(guò)拆分外消旋的DL-正纈氨酸獲得，也可以通過(guò)直接合成獲得，相關(guān)的報(bào)道 較少。日本專(zhuān)利JP7553587采用發(fā)酵法制取，產(chǎn)量約為3. 79g/L，遠(yuǎn)低于一般發(fā)酵生產(chǎn)氨 基酸的產(chǎn)量，難以滿(mǎn)足工業(yè)化的生產(chǎn)需求。中國(guó)專(zhuān)利CN1651400,公開(kāi)了以正丁醛和丙酮 氰醇為原料合成L-正纈氨酸的技術(shù)，該方法采用了劇毒的丙酮氰醇作為反應(yīng)原料，且丙酮 氰醇不易得，價(jià)格偏高，有其局限性。中國(guó)專(zhuān)利CN101007772對(duì)其進(jìn)行了一定改進(jìn)，采用氰 化鈉替代丙酮氰醇為反應(yīng)原料，降低了原料成本，但存在同樣缺點(diǎn)是氰化鈉也是劇毒的化 工原料，同時(shí)反應(yīng)步驟多，總收率不高。陳新志在中國(guó)專(zhuān)利CN1962613中，公開(kāi)了以正戊酸 為起始原料經(jīng)酰氯化、溴化、氨化、拆分、重結(jié)晶、水解合成L-正纈氨酸的技術(shù)，同時(shí)在中 國(guó)專(zhuān)利CN101007774中公開(kāi)了相同工藝路線(xiàn)合成D-正纈氨酸的技術(shù)，上述兩專(zhuān)利避免了 使用劇毒原料，降低了生產(chǎn)成本，但仍然存在反應(yīng)步驟多，總收率不高等問(wèn)題。中國(guó)專(zhuān)利 CN101508654A公開(kāi)了一種DL-正纈氨酸的合成方法，以正戊酸為主要起始原料，依次經(jīng)過(guò) 溴代、氨解、離子交換分離回收得到DL-正纈氨酸，再進(jìn)一步經(jīng)化學(xué)拆分或酶法拆分得到手 性正纈氨酸。該專(zhuān)利提高了合成段的收率，但需要進(jìn)一步拆分才能得到L-正纈氨酸，反應(yīng) 步驟多，總收率不高。
[0004] L-亮氨酸是合成新型靜脈抗腫瘤藥物卡非佐米的關(guān)鍵中間體。L-亮氨酸大部分 通過(guò)發(fā)酵法提取獲得，也可以直接通過(guò)化學(xué)法合成。國(guó)內(nèi)外相關(guān)專(zhuān)利和論文報(bào)告，L-亮氨 酸提取方法主要有沉淀法、離子交換法提取、乳狀液膜法，其中離子交換法提取分離效果和 效率較高，過(guò)程主要包括：離心處理發(fā)酵液，加入晶種后進(jìn)行多次重結(jié)晶，然后加入活性炭 脫色，陽(yáng)離子交換樹(shù)脂層析后濃縮抽濾粗結(jié)晶再加入95%的乙醇重結(jié)晶過(guò)濾干燥得到成 品。整個(gè)過(guò)程繁瑣復(fù)雜，能耗高，收率只有71. 28%，同時(shí)對(duì)設(shè)備的要求嚴(yán)苛，不便于工業(yè)化 生產(chǎn)。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)中L-亮氨酸的合成方法存在過(guò)程繁瑣、反應(yīng)條件苛刻、收率低、分 離提純困難等一系列缺陷，本發(fā)明的目的是在于提供一種基于生物酶為催化劑，以醛類(lèi)化 合物和甘氨酸原料在溫和條件條件下高產(chǎn)率合成高純度L- α -氨基酸的方法，該方法以水 相為反應(yīng)體系，環(huán)保、廉價(jià)，設(shè)備要求低、酶可以反復(fù)使用，成本低，滿(mǎn)足工業(yè)化生產(chǎn)。
[0006] 本發(fā)明提供了一種高純L-α-氨基酸的生物合成方法，該方法是在反應(yīng)液中，醛 類(lèi)化合物和甘氨酸原料在L-蘇氨酸醛縮酶和L-蘇氨酸脫氨酶復(fù)合酶的催化作用下，于pH 為6. 0?8. 0,溫度為20?40°C的條件下進(jìn)行酶催化反應(yīng)I，反應(yīng)產(chǎn)物通過(guò)層析分離后，得 到2-酮酸溶液；將所得2-酮酸溶液調(diào)節(jié)pH到7. 5?8. 5后，加入由亮氨酸脫氫酶與甲酸 脫氫酶或葡萄糖脫氫酶組成的輔酶，在20?40°C溫度下進(jìn)行酶催化反應(yīng)II，反應(yīng)產(chǎn)物依 次經(jīng)過(guò)電滲析脫鹽、活性炭脫色、濃縮結(jié)晶、真空干燥處理，得到L-α -氨基酸晶體；所述的 L-蘇氨酸醛縮酶和L-蘇氨酸脫氨酶復(fù)合酶中L-蘇氨酸醛縮酶與L-蘇氨酸脫氨酶的總活 力比為3?4:2?3 ;所述的輔酶中亮氨酸脫氫酶與甲酸脫氫酶或葡萄糖脫氫酶的總活力 比為1:1. 5?2. 5 ;
[0007] 所述的醛類(lèi)化合物具有式1結(jié)構(gòu)：
[0008]

【權(quán)利要求】
1. 高純L-α-氨基酸的生物合成方法，其特征在于，在反應(yīng)液中，醛類(lèi)化合物和甘氨酸 原料在L-蘇氨酸醛縮酶和L-蘇氨酸脫氨酶復(fù)合酶的催化作用下，于pH為6.O?8. 0,溫度 為20?40°C的條件下進(jìn)行酶催化反應(yīng)I，反應(yīng)產(chǎn)物通過(guò)層析分離后，得到2-酮酸溶液；將 所得2-酮酸溶液調(diào)節(jié)pH到7. 5?8. 5后，加入由亮氨酸脫氫酶與甲酸脫氫酶或葡萄糖脫 氫酶組成的輔酶，在20?40°C溫度下進(jìn)行酶催化反應(yīng)II，反應(yīng)產(chǎn)物依次經(jīng)過(guò)電滲析脫鹽、 活性炭脫色、濃縮結(jié)晶、真空干燥處理，得到L-α-氨基酸晶體；所述的L-蘇氨酸醛縮酶和 L-蘇氨酸脫氨酶復(fù)合酶中L-蘇氨酸醛縮酶與L-蘇氨酸脫氨酶的總活力比為3?4:2? 3 ;所述的輔酶中亮氨酸脫氫酶與甲酸脫氫酶或葡萄糖脫氫酶的總活力比為1:1. 5?2. 5 ; 所述的醛類(lèi)化合物具有式1結(jié)構(gòu)：
所述的2-酮酸具有式2結(jié)構(gòu) 所述的L-α-氨基酸具有式3 其中， R為C1?C4的脂肪烴基。
2. 如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，R為C1?C4的直鏈烷烴基或直鏈取代烷烴 基、烯烴基或取代烯烴基、炔基或取代炔基中一種。
3. 如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，L-蘇氨酸醛縮酶在反應(yīng)液中的加入量相對(duì) 于醛類(lèi)化合物為30000U/mol?80000U/mol，L-蘇氨酸脫氨酶在反應(yīng)液中的加入量相對(duì)于 醛類(lèi)化合物為20000U/mol?60000U/mol。
4. 如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，亮氨酸脫氫酶在2-酮酸溶液中的加入量相 對(duì)于2-酮酸為10000U/mol?16000U/mol，甲酸脫氫酶或葡萄糖脫氫酶在2-酮酸溶液中的 加入量相對(duì)于2-酮酸為20000U/mol?32000U/mol。
5. 如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，醛類(lèi)化合物在反應(yīng)液中的質(zhì)量百分比濃度 為2%?10%，醛類(lèi)化合物與甘氨酸的摩爾比為1:1?1. 05。
6. 如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，酶催化反應(yīng)II過(guò)程中加入不少于20ppm的 NAD或NADP輔組因子，和質(zhì)量為2-酮酸溶液的3?7%的甲酸銨或葡萄糖。
7. 如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，酶催化反應(yīng)II所得反應(yīng)產(chǎn)物通過(guò)電滲析脫 鹽后，維持溫度在20?40°C范圍內(nèi)，加入活性炭進(jìn)行吸附0. 5?I.Oh;其中，活性炭為木質(zhì) 活性炭，木質(zhì)活性炭的使用量為2-酮酸溶液體積的3. 0?5. 0%。。
8. 如權(quán)利要求1或7所述的方法，其特征在于，所述的電滲析脫鹽過(guò)程中采用的極水 為電導(dǎo)在5. 0?10.Oms/cm之間的硫酸鈉溶液，濃水為去離子水，終止物料電導(dǎo)為8. 0? 10.Oms/cm〇
9. 如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述的酶催化反應(yīng)I以反應(yīng)液中甘氨酸殘留 量低于0. 2wt%為反應(yīng)終點(diǎn)；酶催化反應(yīng)II以2-酮酸溶液中2-酮酸殘留量低于0. 2wt%為 反應(yīng)終點(diǎn)。
10. 如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述的層析分離是通過(guò)離子交換樹(shù)脂或吸 附樹(shù)脂進(jìn)行分離。
【文檔編號(hào)】C12P13/04GK104313071SQ201410552914
【公開(kāi)日】2015年1月28日 申請(qǐng)日期:2014年10月17日 優(yōu)先權(quán)日:2014年10月17日
【發(fā)明者】許崗, 曾紅宇, 帥得利, 王勝鋒 申請(qǐng)人:湖南寶利士生物技術(shù)有限公司