一種慢病毒的純化方法
【專(zhuān)利摘要】本發(fā)明涉及一種慢病毒的純化方法，包括以下步驟：S10，提供含慢病毒的細(xì)胞培養(yǎng)物；S20，離心濃縮上述細(xì)胞培養(yǎng)物，并進(jìn)行過(guò)濾，得到病毒懸液；S30，陰離子交換層析純化病毒懸液；S40，凝膠過(guò)濾層析純化病毒懸液。本發(fā)明的慢病毒純化工藝易于放大，可大規(guī)模處理細(xì)胞工廠(chǎng)或生物反應(yīng)器生產(chǎn)的大量病毒液，能滿(mǎn)足慢病毒液的生產(chǎn)需求，工藝穩(wěn)定，重復(fù)性好；且本發(fā)明制備的慢病毒純化液無(wú)外源因子污染，細(xì)胞宿主蛋白、宿主DNA殘留低，安全性好、純度和滴度高，完全達(dá)到臨床基因治療的要求。
【專(zhuān)利說(shuō)明】一種慢病毒的純化方法

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及生物【技術(shù)領(lǐng)域】，特別涉及一種慢病毒的純化方法。

【背景技術(shù)】
[0002] 隨著生物技術(shù)的發(fā)展，病毒學(xué)的基因轉(zhuǎn)移方法，被越來(lái)越多的應(yīng)用于基因治療。它 可以將外源基因?qū)氚ㄊ箢?lèi)、靈長(zhǎng)類(lèi)及人在內(nèi)的體細(xì)胞中，并整合到細(xì)胞基因組中，達(dá)到 長(zhǎng)期穩(wěn)定表達(dá)的目的，因而在包括遺傳病治療、移植、干細(xì)胞轉(zhuǎn)導(dǎo)等許多領(lǐng)域的應(yīng)用中有非 常好的如景。
[0003] 病毒學(xué)的基因轉(zhuǎn)移載體以逆轉(zhuǎn)錄病毒載體和腺病毒載體最為成熟。常見(jiàn)的逆轉(zhuǎn)錄 病毒載體由小鼠白血病病毒（MLV)改造而來(lái)，雖可使目的基因整合至靶細(xì)胞基因組、實(shí)現(xiàn) 穩(wěn)定表達(dá)，但只能轉(zhuǎn)導(dǎo)分裂細(xì)胞，因此只能用于基因治療的離體方案；腺病毒載體既能轉(zhuǎn)導(dǎo) 分裂細(xì)胞，亦可轉(zhuǎn)導(dǎo)靜止細(xì)胞，轉(zhuǎn)導(dǎo)效率也較高，但目的基因不整合至靶細(xì)胞基因組，僅能 短暫表達(dá)，而且腺病毒本身某些抗原的表達(dá)可引起人體免疫反應(yīng)，阻止其重復(fù)轉(zhuǎn)導(dǎo)。
[0004] 近來(lái)，一些研究者把目光投向了以I型人類(lèi)免疫缺陷病（HIV-I)為代表的慢病 毒。研究表明，以HIV-I為基礎(chǔ)構(gòu)建的慢病毒載體不僅能將目的基因整合至靶細(xì)胞基因組， 實(shí)現(xiàn)長(zhǎng)期穩(wěn)定表達(dá)，同時(shí)具有可感染非分裂細(xì)胞、免疫反應(yīng)小等優(yōu)點(diǎn)，適于體內(nèi)基因治療， 因此有望成為理想的基因轉(zhuǎn)移載體。
[0005] HIV-I慢病毒載體由兩部分組成，即包裝成分和載體成分。包裝成分由HIV-I基因 組去除了包裝、逆轉(zhuǎn)錄和整合所需的順式作用序列而構(gòu)建，能夠反式提供產(chǎn)生病毒顆粒所 必需的蛋白；載體成分則與包裝成分互補(bǔ)，含有包裝、逆轉(zhuǎn)錄和整合所需的HIV順式作用序 列，同時(shí)具有異源啟動(dòng)子控制下的多克隆位點(diǎn)及在此位點(diǎn)插入的目的基因。將包裝成分與 載體成分共轉(zhuǎn)染細(xì)胞（如人腎293T細(xì)胞），即可在細(xì)胞上清中收獲只有一次性感染能力而 無(wú)復(fù)制能力的、攜帶目的基因的HIV-I載體顆粒。
[0006] 通常，制備出的慢病毒顆粒在進(jìn)一步應(yīng)用之前，需要進(jìn)行純化。在大多數(shù)小規(guī)模的 實(shí)驗(yàn)應(yīng)用中，可采用離心技術(shù)等相對(duì)簡(jiǎn)單的方法來(lái)進(jìn)行病毒的濃縮和純化。但將純化方法 進(jìn)行放大以便臨床使用，使其純度和滴度達(dá)到臨床基因轉(zhuǎn)移治療的標(biāo)準(zhǔn)，同時(shí)確保其安全 性和功效，這是一個(gè)重大挑戰(zhàn)。因此需要摸索一種更有效的病毒純化方法以滿(mǎn)足要求。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0007] 本發(fā)明的目的在于提供一種從細(xì)胞培養(yǎng)物中純化慢病毒，最終獲得低殘留、高純 度、高滴度的病毒純化的方法。
[0008] 本發(fā)明提出一種慢病毒的純化方法，包括以下步驟：
[0009] S10,提供含慢病毒的細(xì)胞培養(yǎng)物；
[0010] S20,離心濃縮細(xì)胞培養(yǎng)物，并進(jìn)行過(guò)濾，得到病毒懸液；
[0011] S30,陰離子交換層析純化病毒懸液；
[0012] S40,凝膠過(guò)濾層析純化病毒懸液。
[0013] 優(yōu)選地，還包括步驟S50,將步驟S20得到的病毒懸液經(jīng)過(guò)核酸酶處理之后，再進(jìn) 行步驟S30的操作。
[0014] 優(yōu)選地，步驟SlO中所述的細(xì)胞培養(yǎng)物由細(xì)胞工廠(chǎng)或生物反應(yīng)器產(chǎn)生。
[0015] 優(yōu)選地，所述細(xì)胞培養(yǎng)物其細(xì)胞株為293T細(xì)胞。
[0016] 優(yōu)選地，步驟S20中所述的離心濃縮采用5000-10000g離心力在2-8°C離心10-30 分鐘；所述的過(guò)濾采用2. 5 μ M和0. 45 μ M孔徑的過(guò)濾器進(jìn)行兩次過(guò)濾。
[0017] 優(yōu)選地，步驟S30中陰離子交換層析介質(zhì)為Hi Trap Q-XL。
[0018] 優(yōu)選地，步驟S40中凝膠過(guò)濾層析介質(zhì)為HiPrep S-500。
[0019] 本發(fā)明的慢病毒純化工藝易于放大，可大規(guī)模處理細(xì)胞工廠(chǎng)或生物反應(yīng)器生產(chǎn)的 大量病毒液，能滿(mǎn)足病毒液的生產(chǎn)需求，工藝穩(wěn)定，重復(fù)性好；且本發(fā)明制備的病毒純化液 無(wú)外源因子污染，細(xì)胞宿主蛋白、宿主DNA殘留低，安全性好、純度和滴度高，完全達(dá)到臨床 基因治療的要求。

【專(zhuān)利附圖】

【附圖說(shuō)明】
[0020] 圖1為純化后的病毒液經(jīng)SDS-PAGE結(jié)果。

【具體實(shí)施方式】
[0021] 以下結(jié)合附圖對(duì)本發(fā)明的原理和特征進(jìn)行描述，所舉實(shí)例只用于解釋本發(fā)明，并 非用于限定本發(fā)明的范圍。
[0022] 本發(fā)明提供了一種慢病毒純化方法，其是從細(xì)胞培養(yǎng)物中收集病毒液，隨后進(jìn)行 核酸酶處理，再使用陰離子交換層析和凝膠過(guò)濾層析純化病毒。
[0023] 具體步驟如下：
[0024] S10,提供含慢病毒的細(xì)胞培養(yǎng)物。
[0025] 此步驟中，產(chǎn)生細(xì)胞培養(yǎng)物的細(xì)胞株為適應(yīng)于慢病毒培養(yǎng)的任何細(xì)胞，優(yōu)選為 293T細(xì)胞；培養(yǎng)方式包括細(xì)胞工廠(chǎng)或生物反應(yīng)器；細(xì)胞培養(yǎng)物為細(xì)胞培養(yǎng)上清液。
[0026] S20,離心濃縮步驟SlO中所述細(xì)胞培養(yǎng)物，并進(jìn)行過(guò)濾，得到病毒懸液。
[0027] 根據(jù)細(xì)胞培養(yǎng)物的體積選擇合適的離心機(jī)和轉(zhuǎn)子，優(yōu)選以5000_10000g離心力在 2-8°C離心10-30分鐘，收取上清，即為病毒澄清液；過(guò)濾澄清，優(yōu)選的方法是先通過(guò)2. 5 μ M 孔徑的表面過(guò)濾器進(jìn)行預(yù)過(guò)濾；然后通過(guò)具有0. 45 μ M孔徑的過(guò)濾器進(jìn)行再次過(guò)濾。濾過(guò) 液即為澄清的病毒懸液。
[0028] S30,陰離子交換層析純化病毒懸液。
[0029] 優(yōu)選地，此步驟之前，使用核酸酶除去包裝細(xì)胞的核酸。本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方案 中，所述核酸酶是Benzonase,其通過(guò)水解特定核苷酸之間的內(nèi)部磷酸二酯鍵使核酸快速水 解，從而降低細(xì)胞宿主蛋白、宿主DNA殘留。應(yīng)用的核酸酶的濃度優(yōu)選為200-280U/mL。
[0030] 陰離子交換層析采用的介質(zhì)優(yōu)選為Hi Trap Q-XL或SOURCE 30Q;平衡緩沖液優(yōu) 選pHpH7. 5-8. 0 的 50mM Tris-HCl ;洗脫緩沖液優(yōu)選pH7. 5-8. 0 的 50mM Tris-HCl，含 400mM NaCl。
[0031] S40,凝膠過(guò)濾層析純化病毒懸液。
[0032] 陰離子交換層析純化的病毒液繼續(xù)用凝膠過(guò)濾層析純化，采用的介質(zhì)優(yōu)選為 HiPr印S-500,平衡緩沖液優(yōu)選pH7. 0-7. 5的磷酸鹽緩沖液（PBS)。
[0033] 進(jìn)一步地，SlO具體包括順次進(jìn)行的以下幾步：
[0034] Sl 1，包裝細(xì)胞的培養(yǎng)。
[0035] 優(yōu)選地，包裝細(xì)胞為293T細(xì)胞，且處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期。
[0036] S12,質(zhì)粒轉(zhuǎn)染上述包裝細(xì)胞,并在上述包裝細(xì)胞內(nèi)進(jìn)行慢病毒包裝,產(chǎn)生病毒顆 粒。
[0037] S13,收集經(jīng)步驟S12的細(xì)胞上清液，得到含慢病毒的細(xì)胞培養(yǎng)物。
[0038] 本發(fā)明的慢病毒純化工藝易于放大，可大規(guī)模處理細(xì)胞工廠(chǎng)或生物反應(yīng)器生產(chǎn)的 大量病毒液，能滿(mǎn)足病毒液的生產(chǎn)需求，工藝穩(wěn)定，重復(fù)性好；且本發(fā)明制備的病毒純化液 無(wú)外源因子污染，細(xì)胞宿主蛋白、宿主DNA殘留低，安全性好、純度和滴度高，完全達(dá)到臨床 基因治療的要求。
[0039] 實(shí)施例1 :病毒液的制備
[0040] (1)大規(guī)模培養(yǎng)包裝細(xì)胞。
[0041] 首先，從液氮罐中取出凍存的293T細(xì)胞，立即放入37°C水浴箱中使其復(fù)蘇。待其 完全融化后加入5mL DMEM完全培養(yǎng)基（DMEM+10%FBS+P/S)充分混勻，IOOOrpm離心5min， 棄去上清，沉淀用5mL DMEM完全培養(yǎng)基充分混勻，轉(zhuǎn)移到T-25cm2的細(xì)胞培養(yǎng)瓶中，37°C， 5% C02培養(yǎng)箱培養(yǎng)過(guò)夜；接著，待上述細(xì)胞生長(zhǎng)到80%融合度時(shí)，棄去培養(yǎng)基，加入5mL PBS，輕微搖勻，棄去PBS，加入ImL 0. 25 % EDTA-胰酶，室溫放置2-3min，待其細(xì)胞完全從瓶 壁上脫落下來(lái)，加入IOmL DMEM完全培養(yǎng)基，充分混勻，IOOOrpm離心5min，棄去上清，細(xì)胞 沉淀用5mL DMEM完全培養(yǎng)基充分混勻，轉(zhuǎn)移到T-75cm2的細(xì)胞培養(yǎng)瓶中，37°C，5% C02培 養(yǎng)箱培養(yǎng)過(guò)夜。以此類(lèi)推，傳代到T-175cm2和T-225cm2的細(xì)胞培養(yǎng)瓶中；最后，準(zhǔn)備10層 細(xì)胞培養(yǎng)工廠(chǎng)，37°C，5% C02培養(yǎng)箱培養(yǎng)過(guò)夜，待用。
[0042] (2)質(zhì)粒轉(zhuǎn)染。
[0043] 準(zhǔn)備 1 支 50ml 的潔凈離心管，依次加入 900ul (I. Oug/ul)的 pCCL、600ul (I. Oug/ 111)的口]\?1^/^1?1?、200111 (1.0叫/111)的口1?￥-1^￥、300111 (1.0叫/111)的口]\?2.6、341111 ddH20、4ml 2. 5mol/L的CaCl2(pH7. 2)共40ml，用移液器輕微混勻。另取1支50ml的潔凈 離心管，加入40ml HEPES緩沖鹽溶液（即2XHEBS Buffer，pH 7. 2)。用移液器吸入前者的 溶液加入到后者的溶液中，用IOml移液器反復(fù)吹打混勻。室溫孵育30min后將混合液一滴 一滴添加到步驟（1)中所述的10層細(xì)胞培養(yǎng)工廠(chǎng)中，輕輕搖晃混勻后放置37°C、5% 0)2飽 和濕度培養(yǎng)箱中過(guò)夜培養(yǎng)。轉(zhuǎn)染后12_14h更換2L新鮮的不含雙抗（P/S)的高糖DMEM+5% FBS的培養(yǎng)液。
[0044] (3)病毒液收集。
[0045] 轉(zhuǎn)染后24h，收集培養(yǎng)上清液約2L，放入2?8°C環(huán)境中保存；同時(shí)步驟（2)中轉(zhuǎn) 染后的細(xì)胞再次更換2L新鮮的不含雙抗（P/S)的高糖DMEM+5% FBS的培養(yǎng)液；繼續(xù)培養(yǎng) 24h后，再次收集培養(yǎng)上清液約2L。將兩次收集的細(xì)胞培養(yǎng)上清液共4L，混合在一起。
[0046] (4)病毒液的濃縮與過(guò)濾。
[0047] 步驟（3)中的上清液經(jīng)5000r/min低速離心IOmin,收集上清，先用2. 5 μ M孔徑的 表面過(guò)濾器進(jìn)行預(yù)過(guò)濾，再用〇. 45um PVDF濾器進(jìn)行過(guò)濾，以徹底去除細(xì)胞碎片。
[0048] 實(shí)施例2 :病毒液的純化：
[0049] (5)核酸酶處理病毒液。
[0050] 實(shí)施例1中的病毒液經(jīng)步驟（4)的濃縮與過(guò)濾后，加入250U/mL Benzonase，37°C 水浴反應(yīng)6h。
[0051] (6)使用陰離子交換層析純化病毒液并離心濃縮。
[0052] 具體地，有如下步驟：①先用IL ddH20沖洗500mL HiTrap Q-XL強(qiáng)陰離心柱，流 速設(shè)為 50mL/min。②再用 IL 上樣緩沖液 Buffer A(50mM Tris-HCl, pH 8.0)平衡 500mL HiTrap Q-XL強(qiáng)陰離心柱，流速設(shè)為50mL/min。③將0. 45um過(guò)濾后的病毒上清液上樣，流 速設(shè)為 50mL/min。④用 I. 5L 上樣緩沖液 Buffer A(50mM Tris-HCl, ρΗ8·0)沖洗 500mL HiTrap Q-XL強(qiáng)陰離心柱，直至基線(xiàn)平穩(wěn)，以去除非特異性結(jié)合的蛋白，流速設(shè)為50mL/min。 ⑤用 3L 洗脫液 Buffer B (50mM Tris-HCl，400mM NaCl, ρΗ8·0)沖洗 500mL HiTrap Q-XL 強(qiáng) 陰離心柱，直至液色去除，以去除非特異性結(jié)合的蛋白，流速設(shè)為50mL/min。⑥用I. 5L洗脫 液Buffer C(50mM Tris-HC1，1M NaCl, ρΗ8·0)沖洗500mL HiTrap Q-XL強(qiáng)陰離心柱，收集目 的病毒，流速設(shè)為50mL/min。⑦用IL ddH20沖洗500mL HiTrap Q-XL強(qiáng)陰離心柱，流速設(shè) 為50mL/min。⑧最后用IL 20%的無(wú)水乙醇沖洗500mL HiTrap Q-XL強(qiáng)陰離心柱，流速設(shè) 為50mL/min。⑨對(duì)于收集的目的病毒液用50, OOOg離心3h，棄去上清，病毒沉淀用10-20mL PBS充分溶解。
[0053] (7)凝膠過(guò)濾層析純化病毒懸液，并經(jīng)0. 22 μ m濾器過(guò)濾除菌。
[0054] 本步驟通過(guò)S-500凝膠過(guò)濾純化柱進(jìn)行純化，且病毒液與純化柱體積比為1:15。 其具體操作如下：①先用120mL PBS Buffer平衡120mL HiPr印S-500凝膠過(guò)濾柱，流速設(shè) 為lmL/min。②上樣，再用PBS Buffer沖洗，流速設(shè)為lmL/min。③收集最先檢測(cè)到的病毒 樣品約20?25mL。④再用180ml ddH20沖洗120mL HiPr印S-500凝膠過(guò)濾柱，流速設(shè)為 lmL/min。⑤最后用120ml 20%的無(wú)水乙醇沖洗120mL HiPr印S-500凝膠過(guò)濾柱，流速設(shè) 為lmL/min。⑥用0· 22um PVDF針頭濾器過(guò)濾除菌。
[0055] 純化后的病毒液經(jīng)十二燒基磺酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（sodium dodecyl sulphate-polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE)，純度可達(dá) 99%，結(jié)果如圖 1 所示。
[0056] 純化后的病毒液進(jìn)行以下指標(biāo)的檢定，結(jié)果見(jiàn)表一。
[0057] 表一
[0058]
[0059；

【權(quán)利要求】
1. 一種慢病毒的純化方法，其特征在于，包括以下步驟： S10,提供含慢病毒的細(xì)胞培養(yǎng)物； S20,離心濃縮細(xì)胞培養(yǎng)物，并進(jìn)行過(guò)濾，得到病毒懸液； S30,陰離子交換層析純化病毒懸液； S40,凝膠過(guò)濾層析純化病毒懸液。
2. 如權(quán)利要求1所述的純化方法，其特征在于，還包括步驟S50,將步驟S20得到的病 毒懸液經(jīng)過(guò)核酸酶處理之后，再進(jìn)行步驟S30的操作。
3. 如權(quán)利要求1或2所述的純化方法，其特征在于，步驟S10中所述的細(xì)胞培養(yǎng)物由細(xì) 胞工廠(chǎng)或生物反應(yīng)器產(chǎn)生。
4. 如權(quán)利要求3所述的純化方法，其特征在于，所述細(xì)胞培養(yǎng)物其細(xì)胞株為293T細(xì)胞。
5. 如權(quán)利要求4所述的純化方法，其特征在于，步驟S20中，所述的離心濃縮采用 5000-10000g離心力在2-8°C離心10-30分鐘；所述的過(guò)濾采用2. 5 ii M和0? 45 ii M孔徑的 過(guò)濾器進(jìn)行兩次過(guò)濾。
6. 如權(quán)利要求1或2所述的純化方法，其特征在于，步驟S30中陰離子交換層析介質(zhì)為 Hi Trap Q-XL〇
7. 如權(quán)利要求1或2所述的純化方法，其特征在于，步驟S40中凝膠過(guò)濾層析介質(zhì)為 HiPrep S-500。
【文檔編號(hào)】C12N7/02GK104371982SQ201410561875
【公開(kāi)日】2015年2月25日 申請(qǐng)日期:2014年10月21日 優(yōu)先權(quán)日:2014年10月21日
【發(fā)明者】黃 俊 申請(qǐng)人:武漢維諾賽生物技術(shù)有限公司