專利名稱：腸道病毒rna提取試劑盒及相應(yīng)提取純化腸道病毒rna的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明提供一種腸道病毒(Enterovirus, EV) RNA提取試劑盒,具體是ー種磁珠法提取RNA的試劑盒，本發(fā)明還提供相應(yīng)提取純化腸道病毒RNA的方法。
背景技術(shù)：
目前，國內(nèi)已有多種基于實時熒光定量PCR技術(shù)定量檢測RNA的試劑盒應(yīng)用于臨床檢測中，這些試劑盒所提供的RNA提取方法主要是酚-氯仿法和柱提取法。該類試劑盒具有一定的優(yōu)點，但存在很多不足之處1)檢測靈敏度低，約在50(Tl000COpies/ml左右；檢測線性檢測范圍窄，一般在I. 00E+03copies/m廣I. 00E+07copies/ml之間，對于臨床高值 (大于5. 00E+07copies/ml)和低值(小于I. 00E+03copies/ml)的樣本無法檢測；2)酚-氯仿法是最經(jīng)典的RNA提取方法，但是操作繁瑣，對于設(shè)備和人員操作要求高，低病毒載量的標本檢出率低，且所用試劑具有一定的毒性；柱提取方法無需高速離心，但是需頻繁更換離心管，用時長，特異性較差；3)現(xiàn)有試劑無法與自動化儀器配套使用，大大增加了檢測成本；4)國外性能優(yōu)異的試劑有QAGEN、PR0MEGA和OMEGA等公司產(chǎn)品，但試劑成本和耗材成本太高，很難在臨床廣泛開展。磁珠(免疫磁珠)法是近年發(fā)展迅速且被廣泛應(yīng)用的ー種核酸提取方法，其系列試劑不含氯仿、苯酚等毒性大的有機溶劑；提取純化的核酸質(zhì)量好、產(chǎn)量高；提取步驟更簡單，不需要離心，易于實現(xiàn)自動化；該技術(shù)中核酸可以從磁珠上洗脫下來進行后續(xù)檢測和作其他用途；如需要對核酸進行準確定量，則核酸也可不與磁珠分離便進行后續(xù)檢測。這些優(yōu)點使其有替代其它核酸提取和純化方法的發(fā)展趨勢。然而目前磁珠法所用核酸提取試劑基本上為國外開發(fā)和壟斷，價格非常昂貴，從而限制了其在我國的廣泛應(yīng)用。

發(fā)明內(nèi)容
因此，本發(fā)明的目地在于開發(fā)一種磁珠法提取腸道病毒RNA的試劑盒，該試劑盒中的試劑易于獲取，有利于磁珠法用于RNA提取的大范圍推廣。本發(fā)明首先提供一種腸道病毒RNA的提取試劑盒，它包含如下組分，①RNA提取溶液I :包含十二烷基硫酸鈉、曲拉通、異硫氰酸胍和磁珠，且所述十二烷基硫酸鈉可以以SDS、LLS、Chelex-100, Tween 20和NP-40中的任意一種或多種替代！②RNA提取溶液II 含4-羥こ基哌嗪こ磺酸和氯化鈉RNA提取溶液III :含曲拉通和氯化鈉，且所述氯化鈉可以以氯化鉀或氯化鋰替代；和④RNA提取溶液IV :硅油。本發(fā)明提供的上述提取試劑盒能配合自動化儀器(如熒光定量PCR擴增儀)使用，進行腸道病毒RNA的定量檢測；該試劑盒RNA提取得率高、檢測靈敏度高；能對肛拭子、糞便、和咽拭子等樣本中的病原體RNA濃度進行快速、準確測定，為早期診斷各類病原體感染提供可靠的實驗依據(jù)。在本發(fā)明的試劑盒中，針對腸道病毒RNA的提取，使用了 RNA提取溶液IV :硅油；該組分的使用能使得RNA病毒樣本中的雜質(zhì)得到更好的去除。另外，本發(fā)明的試劑盒為專門針對RNA的提取試劑盒，其中的磁珠置于RNA提取溶液I中能取得更好的提取效果；而在磁珠法用于DNA提取時，磁珠均置于RNA提取溶液II中以取得更好的提取效果。本發(fā)明還提供一種腸道病毒RNA提取試劑盒，它包含上述試劑盒中的組分① ④，還包括RNA洗脫液，所述RNA洗脫液包含Tris-HCl和EDTA。在該RNA提取試劑盒中，增加的組分RNA洗脫液可使得RNA從磁珠上洗脫，一方面有利于待測樣本RNA的定性檢測(如上機進行熒光PCR檢測)，另ー方面從磁珠上洗脫下來的純化RNA可作其它用途。本發(fā)明還提供另ー種RNA提取試劑盒，該試劑盒中還包括用于快速提取腸道病毒RNA的核酸釋放劑水溶液,所述核酸釋放劑包括莎梵婦(sur factin) O. OfO. 2mM/L,氯化鉀2(T300mM/L，十二烷基磺酸鈉O. 05 30g/L，和こ醇O. Γ % (ν/ν)。使用該核酸釋放劑可對RNA進行一歩法快速提取，使用該核酸釋放劑時可不用上述RNA提取溶液I IV，而僅使用該核酸釋放劑來滿足某些病毒RNA的快速提取；該核酸釋放劑相應(yīng)的器材簡單，操作簡便，提取過程耗時短，成本低。當本發(fā)明的RNA提取試劑盒中既包括RNA提取溶液I IV、又包括該核酸釋放劑，還選擇性地包括RNA洗脫液時，基本上能滿足在RNA核酸提取過程中不同的需求，且都能實現(xiàn)自動化。在本發(fā)明試劑盒用于EV RNA的檢測吋，使用磁珠法相應(yīng)的RNA提取溶液或使用ー步法相應(yīng)的核酸釋放劑均能準確快速地提取EV RNA ;但在實際應(yīng)用中，若只需檢測EV中的具體某種病毒,如腸道病毒71型(Human enterovirus 71, EV71)或柯薩奇病毒A16型(Coxsackievirus A16, CA16),則使用一步法相應(yīng)的核酸釋放劑能有更快的核酸釋放速度；而若需分別同時檢測EV中的多種病毒，則使用磁珠法相應(yīng)的RNA提取溶液會更加方便快捷。另外，該試劑盒中磁珠法相應(yīng)的RNA提取溶液提取核酸的靈敏度會略高于ー步法相應(yīng)的核酸釋放劑提取核酸的靈敏度，因而也可以從這個角度去選擇具體的RNA提取方法。本發(fā)明提供一種腸道病毒RNA檢測試劑盒，它包括上述任意ー種RNA提取試劑盒中的組分，還包括PCR反應(yīng)液、酶混合液、陽性對照和陰性對照；所述PCR反應(yīng)液中包括5XPCR反應(yīng)緩沖液、脫氧核糖核苷三磷酸、和用于靶多核苷酸擴增和檢測的引物和探針，所述酶混合液中包含mMLV酶和H-Taq DNA聚合酶，所述陽性對照為標定已知濃度的慢病毒，所述陰性對照為滅菌生理鹽水。根據(jù)本發(fā)明所述的檢測試劑盒，所述檢測試劑盒中還優(yōu)選包括內(nèi)標即陽性內(nèi)對照，此時所述PCR反應(yīng)液中還包含用于內(nèi)標擴增和檢測的引物和探針。ー種如上所述試劑盒(磁珠法，RNA不洗脫)的提取純化腸道病毒RNA的方法，包括如下步驟步驟A，裂解病毒每支離心管加入含磁珠的RNA提取溶液I和待測樣本，混勻后離心；步驟B，磁珠吸附核酸每管加入RNA提取溶液II，混勻后靜置；步驟C，去除雜質(zhì)經(jīng)離心后將離心管置于磁珠分離器上進行磁珠分離，再緩慢將溶液吸出；步驟D，洗滌每管加入RNA提取溶液III和RNA提取溶液IV，混勻后離心，將離心管置于磁珠分離器上進行磁珠分離，靜置分層后將液體吸出丟棄。ー種如上所述試劑盒(磁珠法，RNA洗脫)的提取純化腸道病毒RNA的方法，它包括上述的步驟Al，還包括步驟D后的步驟E，即RNA洗脫加入所述RNA洗脫液將離心管壁上的磁珠洗脫到管底，混勻并靜置后將離心管再次置于磁珠分離器上，然后將從磁珠上洗脫下來的RNA吸至新的滅菌離心管中。
具體實施例方式通過以下實施例來具體說明本發(fā)明，但本發(fā)明并不僅限于這些實施例。實施例I本實施例為磁珠法提取純化試劑盒(核酸不洗脫)用于提取純化腸道病毒RNA，結(jié)合熒光PCR擴增儀進行腸道病毒RNA的檢測。本實施例中的核酸提取試劑包括①RNA提取溶液I :由十二烷基硫酸鈉O. 6 (質(zhì)量/體積)％、曲拉通3. 5 (v/v)%,異硫氰酸胍O. 8mol/L和300 μ g/ml的磁珠組成；
·
②RNA提取溶液II :包括4-羥こ基哌嗪こ磺酸100mmol/L、氯化鈉200mmol/L，溶液II的pH值為6·5±0·2 ;·③RNA提取溶液III 曲拉通O. 5 (ν/ν) %、氯化鈉300mmol/L ；④RNA提取溶液IV :娃油；本實施例所述核酸提取試劑盒用于腸道病毒RNA的提取和檢測步驟如下一、試劑準備I)按比例取相應(yīng)量的RNA提取溶液I (200 μ廣Iml/人份)及內(nèi)標(I μ I/人份)充分混勻成RNA提取溶液Ι-mix，瞬時離心后備用。2)根據(jù)待測樣本、陰性對照、陽性對照的數(shù)量，按比例取相應(yīng)量的PCR反應(yīng)液(43μ I/人份)及酶混合液(2μ I/人份)，充分混勻成PCR-mix，瞬時離心后備用。ニ、RNA提取操作I)裂解病毒每管加入200 μ廣Iml RNA提取溶液l_mix，然后加入100 μ廣Iml待測樣本(如咽拭子)，蓋上管蓋，震蕩混勻10秒鐘，瞬時離心；陰性對照和陽性對照參照與待測樣本相同方法作RNA提取和純化處理；2)磁珠吸附核酸每管加入5(Γ400 μ I RNA提取溶液II，震蕩混勻10秒鐘后，室溫靜置10 30分鐘；3)去除雜質(zhì)瞬時離心后，將離心管置于磁珠分離器上進行磁珠分離，2飛分鐘后緩慢將溶液吸出；4)洗滌每管加入400 μ Γ πι RNA提取溶液III和100 500 μ I RNA提取溶液IV，
震蕩混勻3 7秒鐘，瞬時離心后將離心管再次置于磁珠分離器上進行磁珠分離；靜置分層后將液體吸出丟棄。 為了更準確地對腸道病毒RNA定量，其RNA并不從磁珠上洗脫下來，而是將連接有磁珠的腸道病毒RNA直接進行熒光PCR定量檢測。5)熒光PCR分析每個反應(yīng)管加入50 μ I PCR-mix，用吸頭吸取PCR-mix沖洗吸附于離心管壁的棕色殘留物，反復(fù)幾次盡量將該RNA與磁珠的連接物完全洗下，然后將洗下的全部棕色混合液轉(zhuǎn)移至PCR反應(yīng)管中，蓋上管蓋,在熒光定量PCR擴增儀上進行PCR反應(yīng)，并分析結(jié)果。陰性對照和陽性對照參照與待測樣本相同的方法進行操作。通過對不同來源和不同濃度樣本中腸道病毒RNA檢測的結(jié)果表明不同樣本的腸道病毒檢測結(jié)果均有Ct值(即為陽性)，體系中沒有PCR抑制物的存在；而目前常用的酚-氯仿法和柱提取法中，均存在低濃度樣本的腸道病毒檢測無Ct值(Undet)的情況(SP為陰性)，由于三種提取方法使用的是同一種PCR擴增體系，由此說明，酚-氯仿法和柱提取法提取的RNA中有PCR抑制物存在，而導(dǎo)致腸道病毒陽性樣本檢測為陰性，即為假陰性，提示應(yīng)該進行重新檢測或者改進方法進行檢測。因此，本試劑盒所采用的磁珠法提取核酸，能夠有效去除復(fù)雜樣本中的PCR抑制物，適合于肛拭子、糞便、咽拭子等樣本的RNA提取和PCR檢測。實施例2本實施例為磁珠法提取純化試劑盒(核酸從磁珠上洗脫)用于提取純化腸道病毒RNA,結(jié)合熒光PCR擴增儀進行腸道病毒RNA的定性檢測。本實施例中的核酸提取試劑包括與實施例I相同的RNA提取溶液I IV，還包括由 Tris-HCl I. 2mol/L (ρΗ8· O)和 EDTAI. Omol/L (ρΗ8· O)組成的 RNA 洗脫液。本實施例所述核酸提取試劑盒用于腸道病毒RNA的提取和檢測步驟如下 一、試劑準備該步驟與實施例I中相應(yīng)步驟相同；ニ、RNA提取操作該步驟中的步驟I)裂解病毒至步驟4)洗滌均與實施例I中步驟相同；本實施例中腸道病毒RNA的檢測還包括如下步驟5)和6)；5)RNA洗脫加入30 μ I RNA洗脫液，將離心管壁上磁珠洗脫到管底，吸打混勻3 4次，室溫靜置10分鐘后將離心管再次置于分離器上3分鐘，然后將從磁珠上洗脫下來的RNA放于新的滅菌離心管中；從磁珠上洗脫下來的經(jīng)提取和純化的RNA中一部分可用于后續(xù)的熒光PCR分析，而另一部分純化的RNA可作其他用途。6)熒光PCR分析將洗脫磁珠后的待測樣本RNA、陰性對照、陽性對照中每個反應(yīng)管均加入45μ I的PCR-mix，吸取已經(jīng)洗脫磁珠后的待測樣本RNA、陰性對照、陽性對照各5 μ I加入PCR-mix中，蓋好管蓋。在熒光定量PCR擴增儀上進行PCR反應(yīng)，并分析結(jié)果。通過對不同濃度樣本中腸道病毒RNA檢測的結(jié)果表明咽拭子樣本的腸道病毒檢測和內(nèi)標檢測的結(jié)均有Ct值(即為陽性)，體系中沒有PCR抑制物的存在；而目前常用的酚-氯仿法和柱提取法中，均存在如實施例I中所述的假陰性情況出現(xiàn)。因此，本試劑盒所采用的磁珠法提取核酸，能夠有效去除復(fù)雜樣本中的PCR抑制物，適合于不同濃度的咽拭子樣本的RNA提取和PCR檢測。另外，臨床樣本的檢測試驗表明本發(fā)明的磁珠法提取純化試劑盒(核酸洗脫)檢測腸道病毒RNA的線性檢測范圍為2. 00E+02 2. 00E+08copies/mL，檢測下限即靈敏度為2.00E+02copies/mL。實施例3本實施例為ー步法提取純化試劑盒用于提取純化腸道病毒RNA，結(jié)合熒光PCR擴增儀進行腸道病毒RNA的定性檢測。本實施例中不需用到磁珠法提取RNA所用的RNA提取溶液I IV。本實施例中所用的核酸提取試劑為核酸釋放劑水溶液，所述核酸釋放劑包括莎梵婦(surfactin) O. 2mM/L,氯化鉀 100mM/L,十二燒基磺酸鈉 10g/L,和こ醇 O. 08% (ν/ν)。本實施例所述核酸釋放劑用于腸道病毒RNA的提取和檢測步驟如下取出核酸釋放劑中的各組分，室溫放置，待其溫度平衡至室溫后，混勻備用；每個PCR反應(yīng)管中加入核酸釋放劑2飛μ I (建議深吸淺打，避免出現(xiàn)氣泡)，加入待測樣本3飛μ 1，吸打3飛次混勻(輕輕吸打，避免出現(xiàn)氣泡);間隔10分鐘以上，每管加入與實施例2中相同的PCR-mix溶液40 45 μ I，吸打混勻2 3次，蓋上管蓋(去除氣泡后)，2000rpm離心30秒，繼續(xù)進行PCR反應(yīng)和檢測。本發(fā)明的快速提取試劑得到檢測結(jié)果的速度更快，處理50個樣本用時不到30分鐘，而煮沸裂解法與柱提取法試劑的樣本處理時間分別為60分鐘和75分鐘。在靈敏度上本發(fā)明的快速檢測試劑盒與其他試劑盒結(jié)果差別不大，對于濃度為I. 00E+03copies/mL的樣本均檢測為陽性，而煮沸裂解法和柱提取法的靈敏度均為5. 00E+02COpieS/mL。
另外，臨床樣本的檢測試驗表明本發(fā)明的快速檢測試劑盒(含核酸釋放劑)的線性范圍為 I. 00E+03 2. 00E+08copies/mL，檢測下限即靈敏度為 I. 00E+03copies/mL。本發(fā)明提供的三種提取純化試劑盒和相應(yīng)的三種提取方法都能有效提取含有各種抑制物成分的肛拭子、糞便、咽拭子等不同類型樣本的腸道病毒RNA。
權(quán)利要求
1.ー種用于腸道病毒RNA的提取試劑盒，它包含如下組分， ①RNA提取溶液I:包含十二烷基硫酸鈉、曲拉通、異硫氰酸胍和磁珠，且所述十二烷基硫酸鈉可以以SDS、LLS、Chelex-100, Tween 20和NP-40中的任意一種或多種替代； ②RNA提取溶液II:含4-羥こ基哌嗪こ磺酸和氯化鈉； ③RNA提取溶液III:含曲拉通和氯化鈉，且所述氯化鈉可以以氯化鉀或氯化鋰替代； ④RNA提取溶液IV:硅油。
2.根據(jù)權(quán)利要求I所述的提取試劑盒，其特征在于，它包含如下組分， ①RNA提取溶液I:由十二烷基硫酸鈉O. 2^1. 0% (質(zhì)量/體積)、曲拉通I. (Γ4. 0% (體積/體積)，異硫氰酸胍O. 2"l. Omol/L和10(Γ400 μ g/ml的磁珠組成； ②RNA提取溶液II:包括4-羥こ基哌嗪こ磺酸10(T300mmol/L、氯化鈉10(T300mmol/し溶液II的pH值為6·5±0·2; ③RNA提取溶液III:含曲拉通O. Γ1. 0% (體積/體積)和氯化鈉10(T300mmol/L ； ④RNA提取溶液IV:硅油。
3.根據(jù)權(quán)利要求I或2所述的提取試劑盒，其特征在干，該試劑盒中還包括RNA洗脫液，所述RNA洗脫液包含Tris-HCl和EDTA。
4.根據(jù)權(quán)利要求I至3中任意一項所述的提取試劑盒，其特征在干，該試劑盒中還包括用于快速提取RNA的核酸釋放劑水溶液,所述核酸釋放劑包括莎梵婦(surfactin)O.OI O. 2mM/L，氯化鉀 2(T300mM/L，十二烷基磺酸鈉 O. 05 30g/L，和こ醇 O. Γ % (ν/ν)。
5.一種腸道病毒RNA檢測試劑盒,它包括權(quán)利要求I 4中任意一種RNA提取試劑盒中的組分，還包括PCR反應(yīng)液、酶混合液、陽性對照和陰性對照；所述PCR反應(yīng)液中包括5XPCR反應(yīng)緩沖液、脫氧核糖核苷三磷酸、和用于靶多核苷酸擴增和檢測的引物和探針，所述酶混合液中包含mMLV酶和H-Taq DNA聚合酶，所述陽性對照為標定已知濃度的慢病毒，所述陰性對照為滅菌生理鹽水。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的檢測試劑盒，所述檢測試劑盒中還包括內(nèi)標即陽性內(nèi)對照，且所述PCR反應(yīng)液中還包含用于內(nèi)標擴增和檢測的引物和探針。
7.一種如權(quán)利要求I或2所述試劑盒的提取純化腸道病毒RNA的方法，包括如下步驟 步驟A，裂解病毒每支離心管加入含磁珠的RNA提取溶液I和待測樣本，混勻后離心； 步驟B,磁珠吸附核酸姆管加入RNA提取溶液II,混勻后靜置； 步驟C，去除雜質(zhì)經(jīng)離心后將離心管置于磁珠分離器上進行磁珠分離，再緩慢將溶液吸出； 步驟D，洗滌每管加入RNA提取溶液III和RNA提取溶液IV，混勻后離心，將離心管置于磁珠分離器上進行磁珠分離，靜置分層后將液體吸出丟棄。
8.一種如權(quán)利要求3所述試劑盒的提取純化腸道病毒RNA的方法，它包括如權(quán)利要求6所述的步驟Al還包括步驟D后的步驟E，即RNA洗脫加入所述RNA洗脫液將離心管壁上的磁珠洗脫到管底，混勻并靜置后將離心管再次置于磁珠分離器上，然后將從磁珠上洗脫下來的RNA吸至新的滅菌離心管中。
全文摘要
本發(fā)明首先提供一種腸道病毒RNA提取試劑盒，它包含如下組分，①RNA提取溶液Ⅰ含十二烷基硫酸鈉、曲拉通、異硫氰酸胍和100~400μg/ml的磁珠；②RNA提取溶液Ⅱ含4-羥乙基哌嗪乙磺酸和氯化鈉；③RNA提取溶液Ⅲ含曲拉通和氯化鈉；和④RNA提取溶液Ⅳ硅油。本發(fā)明提供的提取試劑盒能配合自動化儀器使用，進行腸道病毒RNA定量檢測；該試劑盒RNA提取得率高、檢測靈敏度高；能對各樣本中的RNA濃度進行快速、準確測定，為早期診斷各類病原體感染提供可靠的實驗依據(jù)。本發(fā)明還提供一種包含RNA洗脫液的磁珠法RNA提取試劑盒和一種一步法提取RNA的試劑盒。本發(fā)明提供的三種試劑盒都能有效提取含有各種抑制物的肛拭子、糞便、咽拭子等不同類型樣本的腸道病毒RNA。
文檔編號C12R1/93GK102839169SQ20121032205
公開日2012年12月26日 申請日期2012年9月3日 優(yōu)先權(quán)日2012年9月3日
發(fā)明者戴立忠 申請人:戴立忠