一種判別越冬藍藻越冬復蘇期界限的方法
【專利摘要】本發明公開了一種判別越冬藍藻越冬復蘇期界限的方法，取藍藻水華區域的水樣和室內培養微囊藻，進行RNA提取純化，然后反轉錄得到cDNA，以cDNA為模板，進行實時熒光定量PCR擴增。以引物 gvpC 擴增微囊藻偽空胞基因，以引物 Micr 特異性擴增微囊藻 16srRNA 內參基因，PCR完成后，導出相應的閾值循環數值，兩者差值為校正后的細胞拷貝數，野外樣品與室內樣品的細胞拷貝數差值為野外目的基因相對循環數，記作ΔΔCt，采用2-ΔΔCt計算相對表達量，以時間為橫坐標，2-ΔΔCt的值為縱坐標繪制曲線，根據曲線確定越冬藍藻越冬復蘇期界限。本方法可以同時對多個樣品進行分析，其重復性好且準確，檢測時間短。
【專利說明】一種判別越冬藍藻越冬復蘇期界限的方法

【技術領域】
[0001] 本發明涉及一種判別越冬藍藻越冬復蘇期界限的方法，屬于水環境治理技術領 域。

【背景技術】
[0002] 近幾十年來，我國湖泊富營養化的發展趨勢很快，大型淺水湖泊（如太湖）隨著富 營養化加重，常常發生以銅綠微囊藻?is aerwgiflosa )為優勢種群的水華。水華 多發生在夏季，有明顯季節性特點。有研究者根據生態學的基本理論和野外對水華形成過 程的原位檢測，將藍藻水華的形成分為相互區別而又連續的4個過程：下沉和越冬、復蘇、 生物量增加、上浮聚集形成水華。這一假設為治理藍藻水華提供了一條"分階段"治理的新 思路。藍藻越冬休眠或者春季復蘇是這些藻類生命過程中最薄弱的環節，越冬復蘇策略不 僅會影響水體中藍藻的種群變動，而且可能有助于其越過環境惡劣的冬季，為隨后的浮游 生長提供潛在的"種源"。要有效控制夏季藍藻水華，就要在藻類大量繁殖形成水華之前，采 取更加有針對性的措施抑制藍藻的生長，在藻類大量復蘇生長前對其進行消減，就有可能 達到事半功倍的效果。在越冬期對藍藻開展底泥翻耕類工程可以在藍藻進入水體前阻斷藍 藻復蘇期的開始，而在藍藻復蘇期開展生物抑制(如水稻、大麥秸桿）措施將極大降低藍藻 的復蘇率。因此建立一種判別越冬藍藻的越冬復蘇期的檢測方法將有助于區分藍藻越冬期 和復蘇期的界限，為有針對性的開展藍藻的種源清除提供依據。
[0003] 越冬期藍藻休眠體成為水華種源必須同時滿足兩個條件：保持活性和上浮。越 冬期底泥中具有活性的藍藻數量決定來年藍藻的復蘇量，是水華暴發的直接因素之一。而 在水華暴發這一過程中，藍藻能調節自身浮力進行垂直遷移的特性也起到了關鍵的作用， 這種特性使藍藻群體的空間位置發生改變，使越冬期底泥中具有活性的藍藻上浮到水體表 層，并受風力作用在湖岸局部地區大量聚集。藍藻之所以能夠形成水華與它胞內偽空胞所 產生的漂浮能力是密不可分的。藍藻的偽空胞是由含有12個基因的8. 7Kb的基因簇組成 的，但是長期以來偽空胞編碼基因和結構蛋白的研究主要集中在和GvpA、GvpC 上。幾乎在所有產偽空胞的藍藻中出現，在大多數具有偽空胞的藻細胞檢測到基 因具有多拷貝，不同的藻細胞中，拷貝數有所不同，但基因拷貝數的多少影響偽空胞 的哪個表型特征并不清楚。而基因決定著偽空胞的直徑，失去GvpC蛋白結構的偽空 胞更容易坍塌。
[0004] 隨著分子生物學技術的發展，從環境樣品中提取和處理核酸的技術逐漸被應用到 微生物形態學中。可是在一般情況下，通常是從環境樣品中提取DNA，并以DNA為模板通過 PCR技術來擴增目的基因序列。由于DNA存在于垂死和已經死亡的生物中，而且DNA還可能 存在于細胞外，所以這些生物的生態意義就很難判斷。因此，通過提取環境中RNA，運用實時 熒光定量PCR技術，在轉錄水平上研究野外藍藻偽空胞基因的表達，從而確定有活 性藍藻的上浮能力，就能清楚的將藍藻復蘇期和越冬期劃清界限，為種源的清除提供依據。


【發明內容】

[0005] 本發明的目的在于針對現有技術的不足，提供一種判別越冬藍藻越冬復蘇期界限 的方法，該方法采用在轉錄水平上的實時熒光定量PCR技術，能夠快速準確的定量檢測出 藍藻偽空胞基因的表達，通過結果分析出藍藻偽空胞基因是在哪個時間段 開始表達并在哪個時間段表達下降，從而將藍藻復蘇期和越冬期劃清界限，為種源的清除 提供依據。
[0006] 為實現上述目的，本發明采用的技術方案為： 一種判別越冬藍藻越冬復蘇期界限的方法，包括如下步驟： 1) 取發生藍藻水華區域的水樣，進行總RNA提取純化，得到RNA樣本a ; 2) 室內培養微囊藻，在對數生長期離心收集藻細胞，進行總RNA提取純化，得到RNA樣 本b ; 3) 分別以RNA樣本a和RNA樣本b進行反轉錄得到cDNA-a和cDNA-b ; 4) 以步驟3)得到的cDNA-a作為熒光定量PCR的模板，以引物擴增微囊藻偽空胞 基因，PCR完成后，導出相應的閾值循環數值，記為;以引物#icr特異性擴增微 囊藻財內參基因，PCR完成后，導出相應的閾值循環數值，記為Ct 16s ;兩者差 值Ct野外目的翻_Ct野外同一樣本16s為校正后的細胞拷貝數，記作Δ Ct野外目的基因； 5) 以步驟3)得到的cDNA-b作為熒光定量PCR的模板，以引物擴增微囊藻偽空胞 基因，PCR完成后，導出相應的閾值循環數值，記為Cts__H ;以引物#icr特異性擴增微 囊藻財內參基因，PCR完成后，導出相應的閾值循環數值，記為Cts_n 16s ;兩者差 值Ct室內目腿因_ Ct室內同一樣本16s為校正后的細胞拷貝數，記作ACt室內目腿因； 6) 與ACt室肖_基_差值為里了外目的基因相對循環數，記作Δ ACt，米用 計算相對表達量； 7) 取不同時間的水樣重復上述步驟1)?6)，以時間為橫坐標，步驟6) 2^ 的值為 縱坐標繪制曲線，根據曲線確定越冬藍藻越冬復蘇期界限。
[0007] 步驟2)中微囊藻為微囊藻aerwgifliosa 7汾形。
[0008] 步驟2)中室內培養微囊藻的培養基為BG-11，培養溫度為28?35 °C，光照強度 為 20 ?60 μ E · (m2 · s) S光照周期為 9 h:15 h ?12 h:12 h。
[0009] 引物 序列為5' -TGCTTTGCGTCAGTCTTTCC-3'， gvpC-R^ -TCCTTCACCTGTTTGGCTCT-3, 〇
[0010] 引物 #icr 引物序列為:#icr7財F 5、GCCGCRAGGTGAAAMCTAA-3\ Micr431R^ -AATCCAAARACCTTCCTCCC-3, 〇
[0011] 熒光定量PCR的反應程序為：95°C 3 min，緊接著40個循環，每個循環包括95°C 15s、55°C 30s 和 72°C 45s。
[0012] 閾值循環數值！Threshold cycle value,簡寫Ct值，定義為突光信號到達設定的 閾值時所經歷的循環數，目的基因的拷貝數與Ct值呈負相關。熒光閾值的設定：一般將PCR 反應前15個循環的熒光信號作為熒光本底信號，熒光閾值是PCR 3-15個循環熒光信號標 準差的10倍，熒光閾值設定在PCR擴增的指數期。以16srRNA為陽性內對照基因來校正 PCR模板的細胞拷貝數Ct 從而消除組間加樣量的影響。
[0013] 為了保證目的基因（仍€)和內參基因（16S)的擴增效率一致，將室內樣品的cDNA 模板稀釋成一系列梯度，利用內參基因16S和目的基因引物擴增，通過cDNA濃度梯 度的log值對ACt值（Z 0=^_細7-0_顏）作圖，所得直線為y=-0. 0931X+10. 109,所 得直線斜率絕對值接近于〇，說明擴增效率相同。
[0014] 具體步驟如下： 1.利用室內培養的微囊藻始'^/-〇<^75^'5· aerwgifliosa 7汾形為對照，培養基為BG-11， 培養溫度為28?35 °C，光照強度為20?60 μ E · (m2 · s)-1，光照周期為9 h: 15 h?12 h: 12 h，離心收集處于對數生長期的藻細胞，進行總RNA提取純化，得到RNA樣本b。
[0015] 2.取發生藍藻水華的湖泊水樣，經GF/C膜過濾后，將濾物進行總RNA提取純化，得 到RNA樣本a。
[0016] 3.反轉錄：米用 QIAGEN 公司的 QuantiTect Reverse Transcription Kit 試劑 盒。根據RNA濃度計算IygRNA所需的體積。按照試劑盒進行反轉錄：加入2μ L gDNA Wipeout Buffer，1 μ gRNA，和 RNase-free H2O，總體積 14 μ L，混勻后至于 PCR 儀中 42°C溫 浴 2min〇 然后向其中力口入 IuL Reverse-transcription master mix,4 μ L Quantiscript RT Buffer及IyL RT Primer Mix,混合后至于PCR儀中42°C溫浴15min，然后95°C滅活 3min。反轉錄后的cDNA-a和cDNA-b稀釋10倍作為熒光定量PCR模板。
[0017] 4.實時熒光定量PCR的反應體系為：采用SYBR Green I嵌合熒光法進行 實時熒光定量PCR，其 PCR混合液包括 12.5 yL 2XQuantiFast SYBR Green PCR Master Mix，2 μ M 引物，1 μ L 模板，無 RNA 酶的水 10. 5 μ L。引物仍^ -丁0(：1'176〇61^六61'(：1'17〇：-3'）與^^^-7?(5,-了〇：1'1^六〇^61'1766(：1'(：1'-3'）特異性擴 增微囊藻偽空胞基因，引物 #icr7財F (5 'GCCGCRAGGTGAAAMCTAA-3 J 與 (5^ -AATCCAAARACCTTCCTCCC-3J特異性擴增微囊藻財內參基因。
[0018] 5.實時熒光定量PCR的反應程序為：95°C 3 min，緊接著40個循環，每個循環包 括 95°C 15s、55°C 30s 和 72°C 45s。
[0019] 6.分別取步驟3中得到的cDNA-a和cDNA-b作為模板，按步驟4和步驟5實時熒 光定量PCR的反應體系和反應程序在實時熒光定量PCR儀上進行擴增。PCR完成后，導出相 應的閾值循環數值（Threshold cycle value，簡寫Ct值，定義為熒光信號到達設定的閾值 時所經歷的循環數，目的基因的拷貝數與Ct值呈負相關。熒光閾值的設定：一般將PCR反 應前15個循環的熒光信號作為熒光本底信號，熒光閾值是PCR 3-15個循環熒光信號標準 差的10倍，熒光閾值設定在PCR擴增的指數期)?；虻南鄬Ρ磉_量用表示，Λ ACt @的基因= ACt野外目的基因 -ACt室內目的基因）。以時間為橫坐標，2 Gt的值為縱坐標繪制曲線，根 據曲線確定越冬藍藻越冬復蘇期界限。
[0020] 有益效果：傳統的測定藻類現存量的方法以及基于DNA的實時熒光定量PCR方法 難以區分死活細胞，不能真正反映具有活性的越冬藻類的狀態。而且絕對定量的實時熒光 定量PCR方法，需要通過標準曲線計算起始模板的拷貝數。而采用本發明的方法，通過對室 內微囊藻以及野外樣品RNA的提取，運用相對定量實時熒光定量PCR方法，比較野外不同時 間段內樣品和室內微囊藻基因之間的表達差異，檢測出水體藍藻在時間上和空間上的動態 變化。這種方法可以同時對多個樣品進行分析，而且不受環境樣品懸浮顆粒物和藻類群體 狀態等影響，體現出其重復性好且準確。對樣品的定量檢測能在短時間內完成（3個小時左 右，多個樣品可同時進行)，其它研究偽空胞形態和特性的壓力毛細管法等需要將偽空胞從 細胞中分離純化，耗時費力。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0021] 圖1是太湖流域取樣位點分布圖； 圖2是2012年11月至2013年7月太湖梅梁灣水體藍藻基因相對表達量； 圖3是2012年11月至2013年7月太湖湖心水體藍藻基因相對表達量。

【具體實施方式】
[0022] 以下結合實施例對本發明的技術方案進一步描述。
[0023] 以下實施例中所采用的的微囊藻為微囊藻#/<^〇<^75^5· aerwgifliosa ，該藻 種由中科院典型培養物種保藏委員會淡水藻種庫（FACHB)提供。
[0024] 實施例1 1.樣品采集和RNA提取 2012年11月至2013年7月每月采集太湖梅梁灣（N2)水樣，在采樣點立即用GF/C濾 膜過濾IOOml水樣，迅速放入液氮中保存，帶回實驗室放在-70°C中保存直到RNA提取。取 40mL室內培養的處于對數生長期的微囊藻(室內培養微囊藻的培養基為BG-11，培養溫度 為30 °C，光照強度為30 μΕ^Οι^^Γ1，光照周期為12 h:12 h)，，進行離心收集藻細胞，然 后提取RNA。野外樣本和室內樣本的RNA的提取均采用QIAGEN公司的RNeasy Plant Mini Kit試劑盒。野外樣品和室內樣本分別轉移到相對應編號的裂解管B (Lysing MatrixB， 直徑0. I mm)中，然后每個裂解管B中加入500 μ L Buffer RLT，將裂解管B放置于Fast Pr印-24樣品處理儀器中。設置Fast Pr印-24樣品處理儀器參數，速度6 m/s，時間35 s。 擊打破碎之后，立即取出裂解管B并放入冰上。然后將裂解管B在4 °C，12000 rpm條件下 離心10 s，緊接著將上清液轉移至無 RNase 2 mL離心管中。按試劑盒說明提取RNAdfi 清液轉移至于淡紫色的QIA shredder spin柱中，12000rmp離心2分鐘，取上清轉移至新 的無 RNase的2mL離心管內，加入0. 5倍體積的無水乙醇，迅速吹打混勻。然后轉移至2mL 粉色1?他387 8口;[11柱中，120001'115)離心158，將濾出物丟棄。加入700以1^1?￥1，120001'115)離 心15s清洗柱子上的濾膜，丟棄濾出物。再用RPE清洗兩次柱子。再用30 μ L無 RNA酶的 dd H2O洗脫RNA。測定RNA濃度和純度，記作RNA樣本a和RNA樣本b。
[0025] 2.分別對RNA樣本a和RNA樣本b進行反轉錄：采用QIAGEN公司的QuantiTect Reverse Transcription Kit試劑盒。根據RNA濃度計算IygRNA所需的體積。按照試 劑盒進行反轉錄：加入 2 μ L gDNA Wipeout Buffer，1 μ gRNA，和 RNase-free H2O，總體積 14 μ L，混勻后至于PCR儀中42°C溫浴2min。然后向其中加入1 μ L Reverse-transcription master mix，4 μ L Quantiscript RT Buffer 及 1μ L RT Primer Mix，混合后至于 PCR 儀 中42°C溫浴15min，然后95°C滅活3min。反轉錄得到cDNA-a和cDNA-b稀釋10倍作為熒 光定量PCR模板。
[0026] 3.實時熒光定量PCR的反應體系為：采用SYBR Green I嵌合熒光法進行 實時熒光定量PCR，其 PCR混合液包括 12.5 yL 2XQuantiFast SYBR Green PCR Master Mix，2 μ M 引物，1 μ L 模板，無 RNA 酶的水 10. 5 μ L。引物仍^ -TGCTTTGCGTCAGTCTTTCC-31 )與 -TCCTTCACCTGTTTGGCTCT-31 )特異性擴增微 囊藻偽空胞基因，引物 #icr7財F (5 ^ -GCCGCRAGGTGAAAMCTAA-3 J 與 #icr^?77? (5 ^ -AATCCAAARACCTTCCTCCC-3 J特異性擴增微囊藻16srRNA內參基因。
[0027] 4.實時熒光定量PCR的反應程序為：95°C 3 min，緊接著40個循環，每個循環包 括 95°C 15s、55°C 30s 和 72°C 45s。
[0028] 5.分別以步驟2得到的9個水樣的反轉錄得到的cDNA-a和cDNA-b樣本為模板， 按上述實時熒光定量PCR的反應體系和反應程序在實時熒光定量PCR儀上進行擴增。以 引物擴增微囊藻偽空胞基因，PCR完成后，導出相應的閾值循環數值，記為Ct a^hgws 因、Ct室內目的基因，以引物#化，特異性擴增微囊藻財內參基因，PCR完成后，導出相應的 閾值循環數值，記為Cts外肖-樣本16s、Ct室肖樣本16s ;兩者差值（Cts外目_g_Ct|j外肖-樣本16s)、 (Ct室內目的基因-Ct室內同一樣本16s)為校正后的細胞拷貝數，記作Δ Ct野外目的基因、Δ Ct室內目的基因；以 16srRNA為陽性內對照基因來校正PCR模板的細胞拷貝數從而消除組間加樣量差異。ACt 野外目的基因與Mt室細貓因差值為野外目的基因相對循環數，記作AACt，采用計算相 對表達量。以時間為橫坐標，以的值為縱坐標繪制曲線見圖2,由圖2可以看出太湖 梅梁灣水體藍藻基因相對表達量在2012年11月到2013年2月處于較低水平階段， 到2013年3月^基因相對表達量急劇升高并持續到5月，但到6月份時又急劇下降，說 明2013年3月到2013年5月是藍藻的復蘇期，而3月份是藍藻越冬期與復蘇期的分界線。 所以在2013年3月份即藍藻復蘇之前對太湖梅梁灣藍藻開展底泥翻耕類工程，之后在2013 年7月到2013年9月連續三個月時間采集太湖梅梁灣水樣檢測藍藻生物量(通常根據藍藻 體內參與光合作用的藻藍蛋白濃度表征藍藻生物量)。與2012年7月到2012年9月同一 時間段但未采取措施處理之前相比，藍藻藻藍蛋白濃度大大下降，結果間表1。
[0029] 表1 :處理前與處理后太湖梅梁灣水體藻藍蛋白濃度對比 實施例2

【權利要求】
1. 一種判別越冬藍藻越冬復蘇期界限的方法，其特征在于包括如下步驟： 1) 取發生藍藻水華區域的水樣，進行總RNA提取純化，得到RNA樣本a ; 2) 室內培養微囊藻，在對數生長期離心收集藻細胞，進行總RNA提取純化，得到RNA樣 本b ; 3) 分別以RNA樣本a和RNA樣本b進行反轉錄得到cDNA-a和cDNA-b ; 4) 以步驟3)得到的cDNA-a作為熒光定量PCR的模板，以引物^擴增微囊藻偽空胞 基因，PCR完成后，導出相應的閾值循環數值，記為;以引物#icr特異性擴增微 囊藻MsrTS財內參基因，PCR完成后，導出相應的閾值循環數值，記為Ct 16s ;兩者差 值Ct野外目的翻-Ct野外同一樣本16s為校正后的細胞拷貝數，記作ACt野外目的基因； 5) 以步驟3)得到的cDNA-b作為熒光定量PCR的模板，以引物^擴增微囊藻偽空胞 基因，PCR完成后，導出相應的閾值循環數值，記為Cts__H ;以引物#icr特異性擴增微 囊藻MsrTS財內參基因，PCR完成后，導出相應的閾值循環數值，記為Cts_n16s ;兩者差 值Ct室內目腿因_ Ct室內同一樣本16s為校正后的細胞拷貝數，記作ACt室內目腿因； 6) 八(]1:野外_基_與ACt室肖_基_差值為里了外目的基因相對循環數，記作A ACt，米用 fAAet計算相對表達量； 7) 取不同時間的水樣重復上述步驟1)?6)，以時間為橫坐標，步驟6) Aet的值為 縱坐標繪制曲線，根據曲線確定越冬藍藻越冬復蘇期界限。
2. 根據權利要求1所述的判別越冬藍藻越冬復蘇期界限的方法，其特征在于：步驟2) 中微囊藻為微囊藻 (is aerygifliosa 。
3. 根據權利要求1所述的判別越冬藍藻越冬復蘇期界限的方法，其特征在于：步驟 2)中室內培養微囊藻的培養基為BG-11，培養溫度為28?35 °C，光照強度為20?60 ii E ? (m2 ? s) \光照周期為 9 h:15 h ?12 h:12 h。
4. 根據權利要求1所述的判別越冬藍藻越冬復蘇期界限的方法，其特征在于：引物 序列為：g^7d5' -TGCTTTGCGTCAGTCTTTCC-3'， gvpC-R^ -TCCTTCACCTGTTTGGCTCT-3, 〇
5. 根據權利要求1所述的判別越冬藍藻越冬復蘇期界限的方法，其特征在于：引物 #icr 引物序列為 -GCCGCRAGGTGAAAMCTAA-3、 Micr431R^ -AATCCAAARACCTTCCTCCC-3, 〇
6. 根據權利要求1所述的判別越冬藍藻越冬復蘇期界限的方法，其特征在于：熒光定 量PCR的反應程序為：95°C 3min，緊接著40個循環，每個循環包括95°C 15s、55°C 30s和 72°C 45s〇
【文檔編號】C12R1/89GK104388544SQ201410587421
【公開日】2015年3月4日 申請日期:2014年10月29日 優先權日:2014年10月29日
【發明者】虞龍, 張金麗, 李玉燕, 于洋, 杜明勇 申請人:南京工業大學