一組可提高sod耐熱溫度和熱穩定性的氨基酸序列及其應用的制作方法
【專利摘要】本發明涉及一組可提高SOD耐熱溫度和熱穩定性的氨基酸序列及其應用，它是一組來源于 Geobacillus 屬的13個特殊嗜熱Fe/Mn-SOD的N端氨基酸序列。這組氨基酸序列具有以下特征：1）位于Fe/Mn-SOD蛋白的sodA功能域之前，序列長度為101-344個氨基酸，功能未知；2）其相互之間具有85-100%的同源性；3）均包含1或2個特殊的共有重復序列Geo-N-repeat。這組氨基酸序列對 Geobacillus 屬的Fe/Mn-SOD的耐熱溫度和熱穩定性具有決定性作用，可廣泛應用于其它SOD（特別是常溫SOD）的改造，顯著提高其耐熱溫度和熱穩定性。
【專利說明】一組可提高SOD耐熱溫度和熱穩定性的氨基酸序列及其應 用

【技術領域】
[0001] 本發明涉及一組可提高S0D耐熱溫度和熱穩定性的氨基酸序列及其應用。

【背景技術】
[0002] 超氧化物歧化酶（Superoxide dismutase，簡稱S0D)，是唯一能夠特異性清除自由 基〇2*^的抗氧化金屬酶，是生物體防御氧毒性的關鍵。該酶廣泛存在于自然界的生物體 內，自1969年從牛紅細胞發現并正式命名以來，科學家已從細菌、真菌、原生動物、藻類、昆 蟲、魚類、植物和哺乳動物等生物體內都分離得到了S0D。由于S0D的特殊功效，其在醫藥、 日用化工、食品、農業以及環保等領域具有廣泛的應用價值。目前，S0D臨床應用主要集中 在抗炎癥方面（以類風濕以及放射治療后引起的炎癥病人為主)，此外對某些自身免疫性疾 病(如紅斑狼瘡、皮肌炎)、肺氣腫、抗癌和氧中毒等都有一定療效；在食品工業主要用作食 品添加劑和重要的功能性基料；在化妝品行業里主要用作抗炎、抗衰老的重要功能性成分。
[0003]基于金屬輔基不同，該酶可分為Cu/Zn-S0D、Mn-S0D、Fe-S0D、Ni-S0D四種類型。 Mn-S0D與Fe-SOD主要存在于原核生物中，二者序列及結構同源性很高，進化上相近；而Cu/ Zn-S0D存在于真核生物中，屬于進化上的另一個分支。目前已開發的SOD產品絕大部分都 是Cu/Zn-S0D，最早是從動物的血、肝中分離提取的，近年來植物來源的S0D也有了大量相 關報道。微生物來源的S0D，尤其嗜熱菌中分離的S0D由于具有耐高溫、穩定性好的特點， 使其在化工應用中比常溫酶具有更好的適用性，而越來越受到更多關注。嗜熱S0D具有極 高的熱穩定性、耐受物理、化學變性劑的優良特性，在工農業生產中具有巨大的應用價值， 主要來源與自然界分離，原料受限，難以滿足工業化需要。目前對S0D進行生產加工以提高 其熱穩定性的方法主要有基因工程方法、研究S0D模擬物、化學修飾、酶固定化等，但普遍 存在改造手段技術繁瑣，操作困難，適應性差，且其效果并不太明顯等弊端和局限性，這些 問題已嚴重影響到了嗜熱S0D的工業化進程。本專利涉及的一組可提高S0D耐熱溫度和熱 穩定性的氨基酸序列為實現S0D的耐熱性改造提供了一種全新思路和方法，該方法操作簡 便、可行性強、適應性好，可實現傳統工業用S0D的升級換代，具有重要的應用價值和前景。


【發明內容】

[0004]本發明的一個目的是提供一組來源于屬的13個特殊嗜熱Fe/Mn-S0D的N端氨基酸序列，這13個N端氨基酸序列具有以下特征：（1)位于Fe/Mn-SOD蛋白的sodA 功能域之前，序列長度為101-344個氨基酸，不能獨立行使SOD的功能；（2)其相互之間具 有85-100%的同源性；（3)都包含特殊的共有重復序列Geo-N-r印eat(圖2)，其中9個N端 序列含有2個重復序列，另外4個N端序列含有1個重復序列。
[0005]本發明的另一目的是提供一組來源于屬的13個特殊嗜熱Fe/Mn-S0D的N端氨基酸序列，這一組N端氨基酸序列對foo知ciBys屬的Fe/Mn-SOD的耐熱溫度和 熱穩定性具有決定性作用，除去這一組N端氨基酸序列后的屬的Fe/Mn-S0D 耐熱溫度和熱穩定性大幅降低(實施例1所示)。
[0006] 本發明的另一目的是提供一組來源于屬的13個特殊嗜熱Fe/Mn-SOD 的N端氨基酸序列，這組N端氨基酸序列可廣泛應用于其它SOD (不僅限于S0D)，特別是常 溫S0D的耐熱溫度和熱穩定性改造。通過一定方法，將這段N端氨基酸序列添加到其它S0D 的N端或sodA功能域的N端，可以顯著提高SOD的耐熱溫度和熱穩定性(實施例2所示)。
[0007] 本發明的另一目的是提供一種能表達重組超氧化物歧化酶（N端氨基酸序列添加 到其它S0D的N端或sodA功能域的N端）的重組質粒。
[0008] 本發明的再一目的是提供一種能產生上述重組超氧化物歧化酶（N端氨基酸序列 添加到其它S0D的N端或sodA功能域的N端）的重組菌。
[0009] 本發明的再一目的是提供了 SEQIDN0:1-13氨基酸序列在提高S0D的耐熱溫度、 提高S0D的熱穩定性方面的應用。
[0010] 為了實現上述目的，本發明采用如下技術方案： 本發明提供一組來源于屬的13個特殊嗜熱Fe/Mn-S0D的N端氨基酸序 列，如 SEQ ID N0:1-13 所示。
[0011] 上述一組來源于屬的13個特殊嗜熱Fe/Mn-S0D的N端氨基酸序列， 其特征在于：（1)位于Fe/Mn-SOD蛋白的sodA功能域之前，序列長度為101-344個氨基酸； (2)其相互之間具有85-100%的同源性；（3)都包含特殊的共有重復序列Geo-N-r印eat (圖 2)，其中SEQ ID N0:1-9的9個N端序列都含有2個重復序列，SEQ ID N0:10-13的4個N 端序列都含有1個重復序列。
[0012] 上述一組來源于屬的13個特殊嗜熱Fe/Mn-S0D的N端氨基酸序列， 其具有與SEQ ID N0:1-13所示的氨基酸序列至少70%的同源性。
[0013]上述一組來源于屬的13個特殊嗜熱Fe/Mn-S0D的N端氨基酸序列， 其具有SEQ ID N0:1-13所示的氨基酸序列中缺失、替換、或插入的多個氨基酸序列為2-100 個。
[0014]上述一組來源于屬的13個特殊嗜熱Fe/Mn-S0D的N端氨基酸序列， 其特征在于，這組N端氨基酸序列可廣泛應用于其它S0D (不僅限于S0D)，特別是常溫S0D 的耐熱溫度和熱穩定性改造。通過一定方法，將這段N端氨基酸序列添加到其它SOD的N 端或sodA功能域的N端，可以顯著提高S0D的耐熱溫度和熱穩定性。
[0015] 本發明提供的SEQ ID N0:1-13氨基酸序列如下：

【權利要求】
1. 一組可提高SOD耐熱溫度和熱穩定性的氨基酸序列，其特征在于它是來源于 屬的13個特殊嗜熱Fe/Mn-SOD的N端氨基酸序列，如SEQ ID NO: 1-13所示。
2. 權利要求1所述的一組可提高SOD耐熱溫度和熱穩定性的氨基酸序列，其特征在 于： (1) 這組N端氨基酸序列來源于foo如屬的13個菌株，其中，SEQ ID N0:1 來源于 (Aerffioofeflitri/ycafls NG80_2;SEQ ID 腸^來源于^⑶知以^狀 從￡?/7?〇?〇即，<3/7>5〇：8_舊3_皿5 ;5￡〇10吣：3來源于^〇如以7^/>5 577.611]\06;5￡〇10 勵：4來源于化〇如以7^/>5 577.056-13;5￡0 10勵：5來源于化〇如以7^/>5 577.￥4121?：52;SEQ ID N0:6 來源于 Geobacillus sp. GHH01;SEQ ID N0:7 來源于 feo如ciBtts 5/7. 丫4121?：61;5￡0 10勵：8來源于化〇如以7^/>5々拙>^〇/^以狀肌4426;5￡0 10勵：9來源 于^〇如以7^/>5 577.?0了5;5￡0 10勵：10來源于^〇如以7^/>5 577.1〇170;5￡0 10勵：11 來源于 (Aerffio^wciosit/afl^TNO-Og.C^C^SEQ ID 腸：口來源于^⑶知以^狀 從6?/--〇1§7此〇>5/￡/<3>5/" >5〇56-'^93;3￡(>)10腸：13來源于（?(9〇知<^7/">5 577.￥4.1]\0; (2) 這組N端氨基酸序列位于Fe/Mn-SOD蛋白的sodA功能域之前，序列長度分別為244 個氨基酸（SEQ ID NO: 1)、344個氨基酸（SEQ ID N0:2)、244個氨基酸（SEQ ID N0:3)、235 個氨基酸（SEQ ID N0:4-7)、209個氨基酸（SEQ ID N0:8-9)、146個氨基酸（SEQ ID N0:10)、 101 個氨基酸（SEQ ID NO: 11-13); (3) 這組N端氨基酸序列相互之間具有85-100%的同源性； (4) 這組N端氨基酸序列都包含特殊的共有重復序列Geo-N-r印eat (圖2)，其中SEQ ID NO: 1-9的9個N端序列都含有2個重復序列，SEQ ID NO: 10-13的4個N端序列都含有 1個重復序列。
3. 權利要求1所述的一組可提高SOD耐熱溫度和熱穩定性的氨基酸序列，其中所述N 端多肽序列具有與SEQ ID NO: 1-13所示的氨基酸序列至少70%的同源性；SEQ ID NO: 1-13 所示的氨基酸序列中缺失、替換或插入一個或多個氨基酸后的氨基酸序列，并且具有該序 列的蛋白質有對屬的Fe/Mn-SOD的耐熱溫度和熱穩定性具有決定性作用。
4. 根據權利要求1至3中任一項所述的一組可提高SOD耐熱溫度和熱穩定性的氨基酸 序列，其特征在于，這組N端氨基酸序列可廣泛應用于其它SOD，特別是常溫SOD的耐熱溫度 和熱穩定性改造；通過一定方法，將這段N端氨基酸序列添加到其它SOD的N端或sodA功 能域的N端。
5. 根據權利要求1至3中任一項所述的一組可提高SOD耐熱溫度和熱穩定性的氨基酸 序列，其特征在于將編碼N端氨基酸序列的核苷酸與編碼其它SOD或sodA功能域的核苷酸 連接后經過克隆表達重組S0D，可顯著提高SOD的耐熱溫度和熱穩定性。
6. 權利要求1所述的SEQ ID NO: 1-13氨基酸序列在提高SOD的耐熱溫度、熱穩定性方 面的應用。
【文檔編號】C12N9/02GK104450632SQ201410675057
【公開日】2015年3月25日 申請日期:2014年11月24日 優先權日:2014年11月24日
【發明者】王威, 張寶亮 申請人:南開大學