精氨酸在提高發酵培養氨基酸序列含有精氨酸-精氨酸的多肽的表達量中的應用及方法
【專利摘要】本發明涉及蛋白表達領域，特別涉及精氨酸在提高發酵培養含有精氨酸-精氨酸的多肽的表達量中的應用及提高氨基酸序列含有精氨酸-精氨酸的多肽的表達量的方法。該方法通過向發酵培養基或培養液中添加精氨酸，為細胞表達蛋白提供前體物質，從而使重組蛋白產量得到提高。本發明提出在發酵培養基或培養液中加入定量的精氨酸，從而顯著提高重組細胞表達外源蛋白的產量，可提高36%及以上。
【專利說明】精氨酸在提高發酵培養氨基酸序列含有精氨酸-精氨酸的多肽的表達量中的應用及方法
[0001]本申請要求于2012年08月17日提交中國專利局、申請號為201210295925.4、發
明名稱為“精氨酸在提高發酵培養氨基酸序列含有精氨酸-精氨酸的多肽的表達量中的應用及方法”的中國專利申請的優先權，其全部內容通過引用結合在本申請中。
【技術領域】
[0002]本發明涉及蛋白表達領域，特別涉及精氨酸在提高發酵培養氨基酸序列含有精氨酸-精氨酸的多肽的表達量中的應用及提高氨基酸序列含有精氨酸-精氨酸的多肽的表達量的方法。
【背景技術】
[0003]精氨酸，學名為2-氨基-5-胍基-戊酸，是一種脂肪族的堿性的含有胍基的極性α氨基酸，在生理條件下帶正電荷。L-精氨酸是蛋白質合成中的編碼氨基酸，哺乳動物必需氨基酸和生糖氨基酸，D-精氨酸在自然界中尚未發現。精氨酸中，與主鏈最接近的旁鏈部份是較長、有機及疏水的，而另一端的旁鏈則是一個胍基，這個胍基的酸度系數(PKa值)為12.48，在中性、酸性或堿性的環境下都是帶正電荷的。因為在其雙鍵及氮孤立電子對之間的共軛體系，使得其正電極離開原位，這個胍基能形成多重的氫鍵。
[0004]精氨酸的分子結構、電荷分布及形成多重氫鍵的能力，使得它能與帶有負電荷的分子結合。因此，精氨酸在蛋白質的外圍，能在帶電荷的環境下產生相互作用。精氨酸是一氧化氮、尿素、鳥氨酸及肌丁胺的直接前體，是合成肌肉素的重要原素，且被用作聚胺、瓜氨酸及谷氨酰胺的合成。作為一氧化氮的前體，精氨酸可以協助舒張血管。非對稱性二甲基精氨酸(ADMA)會壓抑一氧化氮的化學作用，所以ADMA被認為是血管疾病的標記，就像精氨酸是健康內皮細胞層的象征一樣。細胞培植研究指出當有機體外(試管內)賴氨酸與精氨酸的比例偏向賴氨酸時，可以壓抑病毒的復制。在治療上的成效卻是未知的，但食用精氨酸會影響注射賴氨酸的效用。病人在進行手術(如膽囊切除術)以前，如先補充30g的精氨酸，會使病人維持正氮平衡而易于恢復.對腫瘤病人在進行大手術前鼻飼勻膳時，補充25g的精氨酸比補充同樣氮含量的甘氨酸有效得多，更易于保持氮的正平衡.要使精氨酸發揮上述功效，其劑量較大甚至要達到每千克體重0.5g。
[0005]氨基酸序列含有精氨酸-精氨酸的多肽，例如甘精胰島素前體和豬蛔蟲抗菌肽cecropin P1，序列中含有連續的兩個精氨酸。甘精胰島素，化學名稱為21A —Gly-30Ba-L-Arg-30Bb-L-Arg-人胰島素，分子式為 C267H4tl4N72O78S6,分子量為 6063。甘精胰島素是一種在中性PH液中溶解度低的人胰島素類似物。在胰島素與其受體結合的動力學方面，甘精胰島素同人胰島素極為相似。因此可以認為它與經由胰島素受體而介導胰島素的作用相同，其主要作用是調節糖代謝。通過促進骨骼肌和脂肪等周圍末梢組織攝取葡萄糖、抑制肝葡萄糖的產生而降低血糖的。臨床藥理學的研究表明，靜脈注射等劑量的甘精胰島素和人胰島素，其效價是相同的。像所有的胰島素一樣，甘精胰島素的作用時程可能受體力活動及其他因素的影響。對健康人及I型糖尿病患者的正常血糖鉗夾研究表明，皮下注射甘精胰島素的起效時間比低精蛋白鋅人胰島素(NPH)胰島素慢，但甘精胰島素的作用特性為平穩、無峰值、作用時間長。甘精胰島素前體經過酶切純化后即可獲得甘精胰島素。而甘精胰島素前體的表達，與胰島素的表達方法相似，可以參照專利US5656722、US4916212、CN1614019和CN1854299等。實驗發現，甘精胰島素前體與胰島素前體相比，表達量較低。
[0006]豬蛔蟲抗菌肽cecropin Pl是一種具有廣譜抗菌作用的抗菌肽,能夠有效抑制大腸桿菌、金黃色葡萄球菌的生長。重組豬蛔蟲抗菌肽cecropin Pl有希望在飼料中的獲得應用。
[0007]通常，通用的發酵培養基或培養液中均含有細胞生長以及表達外源蛋白所需的碳源、氮源、無機鹽以及微量元素等成分，但并不一定含有小分子氨基酸。但細胞在大量表達外源蛋白時，如豬蛔蟲抗菌肽cecropin P1、甘精胰島素前體,其對某種特定氨基酸的需求大幅增加，若不能通過現有營養滿足，那么這種氨基酸將可能成為限制蛋白產量的重要因素。例如當生物合成多肽中出現兩個連續的精氨酸時，可能受到供應的限制，從而在一定程度上制約了多肽生物合成的速度，此多肽的常規表達量較低。因此，在培養基或培養液中直接加入精氨酸，作為重組多肽合成的前體物質，有利于提高多肽的合成速率，促進表達水平的提聞。
[0008]目前，重組大腸桿菌中新型溶栓酶(NTA)的發酵與表達優化在采用大腸桿菌表達NTA時，通過添加鋅離子和乳糖提高外源蛋白的表達水平；申請號為200710027210.X、發明名稱為“分泌表達蛋白酶的酵母菌培養方法”的中國專利公開了在發酵過程中流加補料甲醇能夠提高蛋白酶的表達；申請號為201110239375.X、發明名稱為“一種釀酒酵母高密度發酵培養基和釀酒酵母高密度發酵方法”的中國專利公開了在發酵過程中補加蔗糖；申請號為201010166684.4、發明名稱為“一種以重組甲醇酵母發酵制備巴曲酶的方法”的中國專利公開了在發酵過程中補加加鹽培養基。上述技術均在發酵過程中補充碳源、氮源、無機鹽、誘導物來提高蛋白的表達。但是，如何提高氨基酸序列含有精氨酸-精氨酸的多肽的表達量的方法卻未見報導。
`[0009]因此，提供一種提高氨基酸序列含有精氨酸-精氨酸這種特定序列結構的多肽的表達量的方法具有重要意義。

【發明內容】

[0010]有鑒于此，本發明提供精氨酸在提高發酵培養氨基酸序列含有精氨酸-精氨酸的多肽的表達量中的應用及提高氨基酸序列含有精氨酸-精氨酸的多肽的表達量的方法。該方法通過向發酵培養基或培養液中添加精氨酸，為細胞表達蛋白提供前體物質，從而使重組蛋白產量得到提高。
[0011]為了實現上述發明目的，本發明提供以下技術方案:
[0012]本發明提供了精氨酸在提高發酵培養氨基酸序列含有精氨酸-精氨酸的多肽的表達量中的應用。
[0013]多肽，通常由10~100氨基酸通過肽鍵連接起來形成的化合物稱為多肽。它們的分子量低于lOOOODa。
[0014]氨基酸序列含有精氨酸-精氨酸的多肽是指在氨基酸序列中含有連續兩個或更多精氨酸的多肽，例如本發明中舉例的甘精胰島素前體、豬蛔蟲抗菌肽cecropin Pl等，其氨基酸序列中含有連續精氨酸-精氨酸的結構。
[0015]通用的發酵培養基或培養液中均含有細胞生長以及表達外源蛋白所需的碳源、氮源、無機鹽以及微量元素等成分，但并不含有小分子氨基酸。細胞在大量表達外源蛋白時，如豬蛔蟲抗菌肽cecropin P1、甘精胰島素前體,其對某種特定氨基酸的需求大幅增加,若不能通過現有營養滿足，那么這種氨基酸將可能成為限制蛋白產量的重要因素。
[0016]精氨酸側鏈含有3個C，以及一個堿性基團胍基，由于結構相對復雜，生物體合成精氨酸的代謝過程涉及多個步驟，因而其在蛋白質合成過程中很可能成為限制因素。其由α -酮戊二酸在乙酰谷氨酸合成酶作用下合成N-乙酰谷氨酸，與ATP在乙酰谷氨酸激酶作用下形成N-乙酰-Y谷氨酰磷酸，其與NAD (P)H在乙酰谷氨酸脫氫酶作用下形成N-乙酰谷氨酸--半醛，然后在轉氨酶作用下合成N-乙酰鳥氨酸，再由乙酰鳥氨酸脫乙酰基酶作用合成L-鳥氨酸，然后跟氨基甲酰磷酸一起在鳥氨酸氨甲酰轉移酶作用下合成瓜氨酸；再在精氨基琥珀合成酶作用下合成精氨酰琥珀酸；最后在精氨基琥珀酸裂解酶作用下形成精氨酸。該過程須由多個基因共同調節。當生物合成多肽中出現兩個連續的精氨酸時，可能受到供應的限制，從而在一定程度上制約了多肽生物合成的速度，此多肽的常規表達量較低。因此，在培養基或培養液中直接加入精氨酸，作為重組多肽合成的前體物質，可能有利于提高多肽的合成速率，促進表達水平的提高。作為優選，多肽的表達系統為原核表達系統和真核細胞表達系統。
[0017]在本發明的一些實施例中，多肽的表達系統為酵母表達系統和哺乳細胞表達系統。
[0018]在本發明的一些實施例中，多肽的表達系統為酵母表達系統。
[0019]優選地，酵母表達系統中宿主細胞選自畢赤酵母屬。
[0020]優選地，酵母表達系統中宿主細胞選自巴斯德畢赤酵母、甲醇畢赤酵母、釀酒酵母、栗酒裂殖酵母、解脂耶氏酵母、 多形漢森酵母、乳酸克魯維酵母。
[0021]更優選地，酵母表達系統中宿主細胞為巴斯德畢赤酵母。
[0022]更優選地，巴斯德畢赤酵母的菌株為GSl 15或Χ33。
[0023]作為優選，多肽為甘精胰島素前體或豬蛔蟲抗菌肽cecropin Pl0
[0024]優選地，多肽為甘精胰島素前體。
[0025]本發明還提供了一種提高氨基酸序列含有精氨酸-精氨酸的多肽的表達量的方法，包括如下步驟:
[0026]取菌株經第一接種到種子培養基中，經第一培養獲得種子液；
[0027]取種子液經第二接種到發酵培養基中，經第二培養獲得培養液，經誘導表達蛋白，即得；
[0028]發酵培養基中添加精氨酸。
[0029]作為優選，本發明提供一種提高氨基酸序列含有精氨酸-精氨酸的多肽的表達量的方法中，多肽的表達系統為原核表達系統、酵母表達系統或動物細胞表達系統。
[0030]在本發明的一些實施例中，多肽的表達系統為酵母表達系統。
[0031 ] 優選地，酵母表達系統中宿主細胞選自畢赤酵母屬。
[0032]優選地，酵母表達系統中宿主細胞選自巴斯德畢赤酵母、甲醇畢赤酵母、釀酒酵母、栗酒裂殖酵母、解脂耶氏酵母、多形漢森酵母、乳酸克魯維酵母。
[0033]更優選地，酵母表達系統中宿主細胞為巴斯德畢赤酵母。
[0034]更優選地，巴斯德畢赤酵母的菌株為GSl 15或X33。
[0035]作為優選，多肽為甘精胰島素前體或豬蛔蟲抗菌肽cecropin Pl0
[0036]優選地，多肽為甘精胰島素前體。
[0037]甘精胰島素前體蛋白一般由人胰島素B鏈(末端增加兩個精氨酸)+連接肽(即C肽，甘精胰島素前體蛋白可以無C肽)+人胰島素A鏈(A21位置為甘氨酸)組成，其中所述A鏈和B鏈氨基酸序列固定，而C肽序列可存在多種，這些為本領域技術人員公知。本發明選取本領域5種不同C肽序列作為連接肽以及不采用連接肽(即B鏈末端精氨酸和A鏈起始的甘氨酸直接通過酰胺鍵相連)，用以驗證所述提高表達量的方法能夠適用于不同C肽序列的甘精胰島素前體蛋白發酵液。
[0038]作為優選，所述甘精胰島素前體蛋白的C肽序列為SEQ ID N0:1所示氨基酸序列、SEQ ID NO: 2所示氨基酸序列、SEQ ID NO: 3所示氨基酸序列、SEQ ID NO:4所示氨基酸序列或SEQ ID N0:5所示氨基酸序列。
[0039]本發明的培養基配方均采用質量體積比，如精氨酸0.87%為100ml培養基中含精氨酸為0.87g，如酵母粉1%為100ml培養基中含酵母粉Ig等。
[0040]在本發明的一些 實施例中，以g/mL計，精氨酸與發酵培養基的質量體積比為0.087 ~1.74:100。
[0041]在本發明的另一些實施例中，以g/mL計，精氨酸與發酵培養基的質量體積比為0.17 ~1.39:100。
[0042]在本發明的另一些實施例中，以g/mL計，精氨酸與發酵培養基的質量體積比為0.61 ~1.13:100。
[0043]作為優選，種子液占發酵培養基的體積百分數為2~15%。
[0044]本發明還提供了一種提高甘精胰島素前體表達量的方法，包括如下步驟:
[0045]取含有甘精胰島素前體序列的畢赤酵母菌株接種到種子培養基中，振蕩培養獲得種子液；
[0046]取所述種子液接種到添加了精氨酸的發酵培養基中，振蕩培養，加入無水甲醇誘導表達蛋白，即得。
[0047]具體的，本發明還提供了一種提高甘精胰島素前體表達量的方法，包括如下步驟:
[0048]取含有甘精胰島素前體序列的畢赤酵母菌株接種到BMGY種子培養基中，振蕩培養獲得種子液，種子液的OD6tltl為2~22，2~6，6~12，12~17或17~22。
[0049]取種子液接種到添加了精氨酸的BMMY發酵培養基中，振蕩培養，加入無水甲醇誘導表達蛋白，即得。
[0050]其中，種子培養基的配方為酵母粉1%，蛋白胨2%，YNB1.34%，生物素4X 10_5%，甘油1%。
[0051]發酵培養基的配方為:酵母粉1%，蛋白胨2%，YNB1.34%，甘油1%，精氨酸0.87%，0.1M pH6.0磷酸鉀溶液。
[0052]作為優選，本發明提供的一種提高甘精胰島素前體表達量的方法，包括如下步驟:
[0053]取含有甘精胰島素前體序列的畢赤酵母菌株接種到BMGY種子培養基中，于30°C、220r/min振蕩培養獲得種子液，種子液的OD6tltl為2~22，2~6，6~12，12~17或17~22。
[0054]取種子液接種到添加了精氨酸的BMMY發酵培養基中，于30°C、220r/min振蕩培養14~24h后，按每12h加入無水甲醇開始誘導表達蛋白，誘導96h后，即得。
[0055]本發明還提供了一種提高豬蛔蟲抗菌肽cecropin Pl表達量的方法,包括如下步驟:
[0056]取含有豬蛔蟲抗菌肽cecropin Pl序列畢赤酵母接種到種子培養基中,振蕩培養獲得第一種子液；
[0057]取所述第一種子液接種到發酵培養基中，振蕩培養獲得第二種子液；
[0058]取所述第二種子液加入精氨酸獲得培養液，振蕩培養，即得；
[0059]以g/mL計，所述精氨酸與所述培養液的質量體積比為0.5%。
[0060]具體的，本發明還提供了一種提高豬蛔蟲抗菌肽cecropin Pl表達量的方法，包括如下步驟:
[0061]取含有豬蛔蟲抗菌肽cecropin Pl序列的畢赤酵母菌株接種到BMGY種子培養基中，振蕩培養獲得種子液，種子液的OD6tltl為2~22，2~6，6~12，12~17或17~22。
[0062]取種子液接種到添加了精氨酸的BMMY發酵培養基中，振蕩培養，加入無水甲醇誘導表達蛋白，即得。
`[0063]其中，種子培養基的配方為酵母粉1%，蛋白胨2%，YNB1.34%，生物素4X 10_5%，甘油1%。
[0064]發酵培養基的配方為:酵母粉1%，蛋白胨2%，YNB1.34%，甘油1%，精氨酸0.87%，0.1M pH6.0磷酸鉀溶液。
[0065]作為優選，本發明提供的一種提高豬蛔蟲抗菌肽cecropin Pl表達量的方法，包括如下步驟:
[0066]取含有豬蛔蟲抗菌肽cecropin Pl序列的畢赤酵母菌株接種到BMGY種子培養基中，于30°C、220r/min振蕩培養獲得種子液，種子液的OD600為2~22，2~6，6~12，12~17 或 17 ~22。
[0067]取種子液接種到添加了精氨酸的BMMY發酵培養基中，于30°C、220r/min振蕩培養14~24h后，按每12h加入無水甲醇開始誘導表達蛋白，誘導96h后，即得。
[0068]以g/mL計，精氨酸與培養液的質量體積比為0.5%。
[0069]本發明還提供了一種提高甘精胰島素前體表達量的方法，包括如下步驟:
[0070]取含有甘精胰島素前體質粒的動物細胞，復蘇、稀釋后接種于培養液中獲得細胞液；
[0071]取所述細胞液振蕩培養，獲得第一培養液；
[0072]取所述第一培養液接種于添加精氨酸的培養液中傳代培養，即得。
[0073]具體的，本發明還提供了一種提高甘精胰島素前體表達量的方法，包括如下步驟:
[0074]取含有甘精胰島素前體質粒的CHO DG44克隆細胞，復蘇、稀釋后接種于CDOptiCHO培養液中獲得細胞液，細胞液的細胞密度為4X IO5活細胞/mL ；
[0075]取細胞液振蕩培養，獲得第一培養液，第一培養液中活細胞密度為1.0~1.5 X IO6活細胞/mL ；
[0076]取第一培養液接種于添加精氨酸的CD OptiCHO培養液中傳代培養,即得。
[0077]作為優選，本發明提供的一種提高甘精胰島素前體表達量的方法，包括如下步驟:[0078]取含有甘精胰島素前體質粒的CHO DG44克隆細胞，復蘇、稀釋后接種于CDOptiCHO培養液中獲得細胞液，細胞液的細胞密度為4X IO5活細胞/mL ；
[0079]取細胞液于37°C、8%C02、130r/min振蕩培養，獲得第一培養液，第一培養液中活細胞密度為1.0~1.5 X IO6活細胞/mL ；
[0080]取第一培養液經300 Xg離心5min后接種于添加精氨酸的⑶OptiCHO培養液中傳代培養10d，即得。
[0081]基于上述本發明提供的一種提高甘精胰島素前體表達量的方法，本領域技術人員也可以通過一個或者幾個氨基酸殘基的取代、缺失或者添加，提供一種提高也含有連續精氨酸的甘精胰島素前體類似物多肽表達量的方法。
[0082]本發明提供精氨酸在提高發酵培養氨基酸序列含有精氨酸-精氨酸的多肽的表達量中的應用及提高氨基酸序列含有精氨酸-精氨酸的多肽的表達量的方法。該方法通過向發酵培養基或培養液中添加精氨酸，為細胞表達蛋白提供前體物質，從而使重組蛋白產量得到提高。本發明提出在發酵培養基或培養液中加入定量的精氨酸，從而顯著提高重組細胞表達外源蛋白的廣量，可提聞36%及以上。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0083]圖1示實施例1中對照組獲得的發酵上清液甘精胰島素前體的HPLC譜圖；
[0084]圖2示實施例1中試驗組獲得的發酵上清液甘精胰島素前體的HPLC譜圖；
[0085]圖3示實施例1中甘精胰島素前體標準品的HPLC譜圖。
【具體實施方式】
[0086]本發明公開了精氨酸在提高發酵培養氨基酸序列含有精氨酸-精氨酸的多肽的表達量中的應用及提高氨基酸序列含有精氨酸-精氨酸的多肽的表達量的方法，本領域技術人員可以借鑒本文內容，適當改進工藝參數實現。特別需要指出的是，所有類似的替換和改動對本領域技術人員來說是顯而易見的，它們都被視為包括在本發明。本發明的方法及應用已經通過較佳實施例進行了描述，相關人員明顯能在不脫離本
【發明內容】
、精神和范圍內對本文所述的方法和應用進行改動或適當變更與組合，來實現和應用本發明技術。
[0087]本發明提供的精氨酸在提高發酵培養氨基酸序列含有精氨酸-精氨酸的多肽的表達量中的應用及提高氨基酸序列含有精氨酸-精氨酸的多肽的表達量的方法中所用菌株、細胞、氨基酸、制劑均可由市場購得。其中，精氨酸由深圳尚能生物科技有限公司提供。
[0088]本發明有關畢赤酵母GS115的重組菌株參考“Mult1-copy Pichia ExpressionKit”操作獲得；有關畢赤酵母X33的重組菌株參考“EasySelect Pichia Expression Kit”操作獲得；有關大腸桿菌BL21的重組菌株參考“原核蛋白表達寶典一大腸桿菌表達系統操作手冊，Novagen”操作獲得；有關CHO DG44克隆細胞參考“Freedom DG44Kit”操作獲得。
[0089]下面結合實施例，進一步闡述本發明:
[0090]實施例1
[0091]本實驗組甘精胰島素前體不含C肽序列。
[0092]試驗組:
[0093]將甘油管保存的含有甘精胰島素前體基因(無C肽)的重組畢赤酵母GS115菌株接種于250ml搖瓶的BMGY種子培養基中，裝瓶量25ml，30°C，220r/min振蕩培養至20h，結束培養。
[0094]將培養得到的種子液5ml接種于500ml搖瓶的含有0.87%精氨酸的BMMY發酵培養基中，裝瓶量50ml，30°C，220r/min振蕩培養12h。
[0095]30°C，220r/min振蕩培養，加入500 μ I無水甲醇誘導表達蛋白，每12小時添加一次，至發酵培養結束。
[0096]誘導96h后結束發酵。
[0097]對照組:
[0098]將甘油管保存的含有甘精胰島素前體基因(無C肽)的重組畢赤酵母GS115菌株接種于裝有BMGY種子培養基的250ml培養瓶中，裝瓶量25ml，30°C，220r/min振蕩培養至20h，結束培養。
[0099]將培養得到的種子液5ml接種于裝有BMMY發酵培養基的500ml培養瓶中，裝瓶量50ml ο 30°C，220r/min 振蕩培養 12h。
[0100]30°C，220r/min振蕩培養，加入500 μ I無水甲醇誘導表達蛋白，每12小時添加一次，至發酵培養結束。
[0101]誘導96h后結束發酵。
[0102]結果檢測:
[0103]HPLC檢測發酵上清液甘精胰島素前體含量0.070g/L,不加精氨酸對照發酵瓶甘精胰島素前體含量0.0520g/L，提高34.62%。
[0104]實施例2
[0105]本實驗組甘精胰島素C肽序列:SEQ ID N0:2所示氨基酸序列。
[0106]試驗組:
[0107]取經復蘇的含有甘精胰島素前體的CHO DG44克隆細胞，稀釋細胞，接種于完全125ml的細胞培養搖瓶中，⑶OptiCHO培養液裝量40ml，使最終細胞密度為4X IO5活細胞/ml。
[0108]細胞于125ml細胞培養搖瓶(裝瓶量1/3)中37°C、8%C02，130rpm培養，當活細胞密度達到1-1.5XCD OptiCHO培養液106cells/ml時，傳代細胞。
[0109]300Xg離心 5分鐘，更換新鮮的含0.3%精氨酸的完全⑶OptiCHO培養液，細胞密度為3X105cells/ml，連續培養10天，停止培養。
[0110]對照組:
[0111]取經復蘇的含有甘精胰島素前體的CHO DG44克隆細胞，稀釋細胞，接種于完全125ml的細胞培養搖瓶中，⑶OptiCHO培養液裝量40ml，使最終細胞密度為4X IO5活細胞/ml。[0112]細胞于125ml細胞培養搖瓶(裝瓶量1/3)中37°C、8%C02，130rpm培養，當活細胞密度達到1-1.5XCD OptiCHO培養液106cells/ml時，傳代細胞。
[0113]300Xg離心5分鐘，更換新鮮的完全⑶OptiCHO培養液細胞密度為3 X IO5Cells/ml，連續培養10天，停止培養。
[0114]結果檢測:培養結束，分別取試驗組和對照組的培養液經12000rpm離心IOmin,HPLC檢測上清液甘精胰島素前體含量為20.25mg/L,不加精氨酸的對照上清液甘精胰島素前體含量為16.47mg/L，提高了 22.95%。
[0115]實施例3
[0116]本實驗組甘精胰島素C肽序列:SEQ ID N0:3所示氨基酸序列。
[0117]試驗組:
[0118]取甘油管保存的含有甘精胰島素前體基因的重組大腸桿菌BL21菌株，接種100 μ I于25ml搖瓶的LB培養基中，裝瓶量5ml。37°C，220rpm振蕩培養過夜，0D600約0.5。
[0119]將培養得到的培養液取1.5ml接種于250ml搖瓶的含有100 μ g/ml的LB培養基中，裝瓶量 50ml。37。。，220rpm 振蕩培養 2h，OD600 約 0.9。
[0120]加入240mg/ml的IPTG50ul，使終濃度為1禮，再加入精氨酸至終濃度0.5% (質量體積比)。370C，250rpm振蕩培養4h，結束培養。
[0121]對照組:
[0122]取甘油管保存的含有甘精胰島素前體基因的重組大腸桿菌BL21菌株，接種100 μ I于25ml搖瓶的LB培養基中，裝瓶量5ml。37。。，220rpm振蕩培養過夜，OD600約0.5。
[0123]將培養得到的培養液取1.5ml接種于250ml搖瓶的含有100 μ g/ml的LB培養基中，裝瓶量 50ml。37。。，220rpm 振蕩培養 2h，OD600 約 0.9。
[0124]加入240mg/ml的IPTG50ul，使終濃度為ImM。37°C，250rpm振蕩培養4h，結束培養。
[0125]結果檢測:
[0126]分別取對照組的培養液和試驗組培養液各三組50ml，以4000rpm離心15min以獲得大腸桿菌細胞沉淀。
[0127]收集菌體，分別加入Iml去離子水，采用超聲破碎方法，超聲4s (120W),間隔4s，99次，兩個循環。破碎結束后，離心，將細胞壁等雜質除去，得到包涵體。包涵體用蒸餾水按照I:15比例,洗漆30min,8000rpm離心5min,去上清液。
[0128]將初步純化好的包涵體按照1:60比例加入磺酸化試劑(7M尿素、pH9.0Tris-HCl 15mM, EDTAlmM、Na2SO30.4M、CuSO4.5H205mM、甘氨酸 ImM)，室溫，輕輕攪拌10h，離心棄沉淀，上清用去離子水稀釋至尿素終濃度2M，置于磁力攪拌器上緩慢攪拌的同時，加入0.5M鹽酸調整溶液pH至等電點左右，沉淀，離心，收集沉淀。沉淀用去離子水沖洗2 次，然后復溶于 8M 尿素(pH9.0Tris-HCl 15mM, EDTAIM)0
[0129]用HPLC檢測，補加精氨酸上清液甘精胰島素前體的三組含量平均為0.587g/L，未加精氨酸的對照上清液甘精胰島素前體的三組含量平均為0.429g/L，提高了 36.8%。
[0130]實施例4
[0131]本實驗組甘精胰島素C肽序列:SEQ ID NO:1所示氨基酸序列。
[0132]試驗組:[0133]取甘油管保存的含有甘精胰島素前體基因的重組畢赤酵母GS115菌株接種于250ml搖瓶的BMGY種子培養基中，裝瓶量25ml，30°C，220r/min振蕩培養至20h，結束培養。
[0134]將培養得到的種子液5ml接種于500ml搖瓶的含有0.17%精氨酸的BMMY發酵培養基中，裝瓶量50ml，30°C，220r/min振蕩培養12h。
[0135]30°C，220r/min振蕩培養，加入500 μ I無水甲醇誘導表達蛋白，每12小時添加一次，至發酵培養結束。
[0136]誘導96h后結束發酵。
[0137]對照組:
[0138]取甘油管保存的含有甘精胰島素前體基因的重組畢赤酵母GS115菌株接種于250ml搖瓶的BMGY種子培養基中，裝瓶量25ml，30°C，220r/min振蕩培養至20h，結束培養。
[0139]將培養得到的種子液5ml接種于500ml搖瓶的BMMY發酵培養基中，裝瓶量50ml，30°C，220r/min 振蕩培養 12h。
[0140]30°C，220r/min振蕩培養，加入500 μ I無水甲醇誘導表達蛋白，每12小時添加一次，至發酵培養結束。
[0141]誘導96h后結束發酵。
[0142]結果檢測:
[0143]HPLC檢測發酵上清液甘精胰島素前體含量0.0549g/L,不加精氨酸對照發酵瓶甘精胰島素前體含量0.0513g/L，提高7.02%。
[0144]實施例5`
[0145]本實驗組甘精胰島素C肽序列:SEQ ID NO:1所示氨基酸序列。
[0146]試驗組:
[0147]取甘油管保存的含有甘精胰島素前體基因的重組畢赤酵母GS115菌株接種于250ml搖瓶的BMGY種子培養基中，裝瓶量25ml，30°C，220r/min振蕩培養至20h，結束培養。
[0148]將培養得到的種子液5ml接種于500ml搖瓶的含有0.61%精氨酸的BMMY發酵培養基中，裝瓶量50ml，30°C，220r/min振蕩培養12h。
[0149]30°C，220r/min振蕩培養，加入500 μ I無水甲醇誘導表達蛋白，每12小時添加一次，至發酵培養結束。
[0150]誘導96h后結束發酵。
[0151]對照組:
[0152]取甘油管保存的含有甘精胰島素前體基因的重組畢赤酵母GS115菌株接種于250ml搖瓶的BMGY種子培養基中，裝瓶量25ml，30°C，220r/min振蕩培養至20h，結束培養。
[0153]將培養得到的種子液5ml接種于500ml搖瓶的BMMY發酵培養基中，裝瓶量50ml，30°C，220r/min 振蕩培養 12h。
[0154]30°C，220r/min振蕩培養，加入500 μ I無水甲醇誘導表達蛋白，每12小時添加一次，至發酵培養結束。
[0155]誘導96h后結束發酵。
[0156]結果檢測:
[0157]HPLC檢測發酵上清液甘精胰島素前體含量0.0647g/L,不加精氨酸對照發酵瓶甘精胰島素前體含量0.0505g/L，提高28.12%。[0158]實施例6
[0159]本實驗組甘精胰島素C肽序列:SEQ ID NO:1所示氨基酸序列。
[0160]試驗組:
[0161]取甘油管保存的含有甘精胰島素前體基因的重組畢赤酵母GS115菌株接種于250ml搖瓶的BMGY種子培養基中，裝瓶量25ml，30°C，220r/min振蕩培養至20h，結束培養。
[0162]將培養得到的種子液5ml接種于500ml搖瓶的含有0.087%精氨酸的BMMY發酵培養基中，裝瓶量50ml，30°C，220r/min振蕩培養12h。
[0163]30°C，220r/min振蕩培養，加入500 μ I無水甲醇誘導表達蛋白，每12小時添加一次，至發酵培養結束。 [0164]誘導96h后結束發酵。
[0165]對照組:
[0166]取甘油管保存的含有甘精胰島素前體基因的重組畢赤酵母GS115菌株接種于250ml搖瓶的BMGY種子培養基中，裝瓶量25ml，30°C，220r/min振蕩培養至20h，結束培養。
[0167]將培養得到的種子液5ml接種于500ml搖瓶的BMMY發酵培養基中，裝瓶量50ml，30°C，220r/min 振蕩培養 12h。
[0168]30°C，220r/min振蕩培養，加入500 μ I無水甲醇誘導表達蛋白，每12小時添加一次，至發酵培養結束。
[0169]誘導96h后結束發酵。
[0170]結果檢測:
[0171]HPLC檢測發酵上清液甘精胰島素前體含量0.0533g/L,不加精氨酸對照發酵瓶甘精胰島素前體含量0.0498g/L，提高7.03%。
[0172]實施例7
[0173]本實驗組甘精胰島素C肽序列:SEQ ID N0:5所示氨基酸序列。
[0174]試驗組:
[0175]取經復蘇的含有甘精胰島素前體的CHO DG44克隆細胞，稀釋細胞，接種于完全125ml的細胞培養搖瓶中，⑶OptiCHO培養液裝量40ml，使最終細胞密度為4 X IO5活細胞/ml。
[0176]細胞于125ml細胞培養搖瓶(裝瓶量1/3)中37°C、8%C02，130rpm培養，當活細胞密度達到1-1.5XCD OptiCHO培養液106cells/ml時，傳代細胞。
[0177]300Xg離心5分鐘，更換新鮮的完全⑶OptiCHO培養液(含精氨酸1.0%，)，細胞密度為3X 105，連續培養10天，停止培養。
[0178]對照組:
[0179]取經復蘇的含有甘精胰島素前體的CHO DG44克隆細胞，稀釋細胞，接種于完全125ml的細胞培養搖瓶中，⑶OptiCHO培養液裝量40ml，使最終細胞密度為4X IO5活細胞/ml。
[0180]細胞于125ml細胞培養搖瓶(裝瓶量1/3)中37°C、8%C02，130rpm培養，當活細胞密度達到1-1.5XCD OptiCHO培養液106cells/ml時，傳代細胞。
[0181]300Xg離心5分鐘，更換新鮮的完全⑶OptiCHO培養液(不含精氨酸)，細胞密度為3X 105，連續培養10天，停止培養。[0182]結果檢測:培養結束，分別取試驗組和對照組的培養液經12000rpm離心lOmin，HPLC檢測上清液甘精胰島素前體含量為21.76mg/L,不加精氨酸的對照上清液甘精胰島素前體含量為16.28mg/L，提高了 33.66%。
[0183] 實施例8
[0184]本實驗組甘精胰島素C肽序列:SEQ ID N0:4所示氨基酸序列。
[0185]試驗組:
[0186]取甘油管保存的含有甘精胰島素前體基因的重組畢赤酵母x33菌株接種于250ml搖瓶的BMGY種子培養基中，裝瓶量25ml，30°C，220r/min振蕩培養至20h，結束培養。
[0187]將培養得到的種子液5ml接種于500ml搖瓶的含有0.5%精氨酸的BMMY發酵培養基中，裝瓶量50ml，30°C，220r/min振蕩培養12h。
[0188]30°C，220r/min振蕩培養，加入500 μ I無水甲醇誘導表達蛋白，每12小時添加一次，至發酵培養結束。
[0189]誘導96h后結束發酵。
[0190]對照組:
[0191]取甘油管保存的含有甘精胰島素前體基因的重組畢赤酵母x33菌株接種于250ml搖瓶的BMGY種子培養基中，裝瓶量25ml，30°C，220r/min振蕩培養至20h，結束培養。
[0192]將培養得到的種子液5ml接種于500ml搖瓶的BMMY發酵培養基中，裝瓶量50ml，30°C，220r/min 振蕩培養 12h。
[0193]30°C，220r/min振蕩培養，加入500 μ I無水甲醇誘導表達蛋白，每12小時添加一次，至發酵培養結束。
[0194]誘導96h后結束發酵。
[0195]結果檢測:
[0196]HPLC檢測發酵上清液甘精胰島素前體含量0.0601g/L,不加精氨酸對照發酵瓶甘精胰島素前體含量0.0509g/L，提高18.07%。
[0197]實施例9
[0198]本實驗組甘精胰島素C肽序列:SEQ ID NO:1所示氨基酸序列。
[0199]試驗組:
[0200]取甘油管保存的含有甘精胰島素前體基因的重組畢赤酵母GS115菌株接種于250ml搖瓶的BMGY種子培養基中，裝瓶量25ml，30°C，220r/min振蕩培養至20h，結束培養。
[0201]將培養得到的種子液5ml接種于500ml搖瓶的含有1.13%精氨酸的BMMY發酵培養基中，裝瓶量50ml，30°C，220r/min振蕩培養12h。
[0202]30°C，220r/min振蕩培養，加入500 μ I無水甲醇誘導表達蛋白，每12小時添加一次，至發酵培養結束。
[0203]誘導96h后結束發酵。
[0204]對照組:
[0205]取甘油管保存的含有甘精胰島素前體基因的重組畢赤酵母GS115菌株接種于250ml搖瓶的BMGY種子培養基中，裝瓶量25ml，30°C，220r/min振蕩培養至20h，結束培養。
[0206]將培養得到的種子液5ml接種于500ml搖瓶的BMMY發酵培養基中，裝瓶量50ml，30°C，220r/min 振蕩培養 12h。[0207]30°C，220r/min振蕩培養，加入500 μ I無水甲醇誘導表達蛋白，每12小時添加一
次，至發酵培養結束。
[0208]誘導96h后結束發酵。結果檢測:
[0209]HPLC檢測發酵上清液甘精胰島素前體含量0.0651g/L,不加精氨酸對照發酵瓶甘精胰島素前體含量0.0499g/L，提高30.46%。
[0210]實施例10 [0211]本實驗組甘精胰島素C肽序列:SEQ ID N0:1所示氨基酸序列。
[0212]試驗組:
[0213]取甘油管保存的含有甘精胰島素前體基因的重組畢赤酵母GS115菌株接種于250ml搖瓶的BMGY種子培養基中，裝瓶量25ml，30°C，220r/min振蕩培養至20h，結束培養。
[0214]將培養得到的種子液5ml接種于500ml搖瓶的含有1.39%精氨酸的BMMY發酵培養基中，裝瓶量50ml，30°C，220r/min振蕩培養12h。
[0215]30°C，220r/min振蕩培養，加入500 μ I無水甲醇誘導表達蛋白，每12小時添加一次，至發酵培養結束。
[0216]誘導96h后結束發酵。
[0217]對照組:
[0218]取甘油管保存的含有甘精胰島素前體基因的重組畢赤酵母GS115菌株接種于250ml搖瓶的BMGY種子培養基中，裝瓶量25ml，30°C，220r/min振蕩培養至20h，結束培養。
[0219]將培養得到的種子液5ml接種于500ml搖瓶的BMMY發酵培養基中，裝瓶量50ml，30°C，220r/min 振蕩培養 12h。
[0220]30°C，220r/min振蕩培養，加入500 μ I無水甲醇誘導表達蛋白，每12小時添加一次，至發酵培養結束。
[0221]誘導96h后結束發酵。
[0222]結果檢測:
[0223]HPLC檢測發酵上清液甘精胰島素前體含量0.0578g/L,不加精氨酸對照發酵瓶甘精胰島素前體含量0.0517g/L，提高12%。
[0224]實施例11
[0225]本實驗組甘精胰島素C肽序列:SEQ ID NO:1所示氨基酸序列。
[0226]試驗組:
[0227]取甘油管保存的含有甘精胰島素前體基因的重組畢赤酵母GS115菌株接種于250ml搖瓶的BMGY種子培養基中，裝瓶量25ml，30°C，220r/min振蕩培養至20h，結束培養。
[0228]將培養得到的種子液5ml接種于500ml搖瓶的含有1.74%精氨酸的BMMY發酵培養基中，裝瓶量50ml，30°C，220r/min振蕩培養12h。
[0229]30°C，220r/min振蕩培養，加入500 μ I無水甲醇誘導表達蛋白，每12小時添加一次，至發酵培養結束。
[0230]誘導96h后結束發酵。
[0231]對照組:
[0232]取甘油管保存的含有甘精胰島素前體基因的重組畢赤酵母GS115菌株接種于250ml搖瓶的BMGY種子培養基中，裝瓶量25ml，30°C，220r/min振蕩培養至20h，結束培養。[0233]將培養得到的種子液5ml接種于500ml搖瓶的BMMY發酵培養基中，裝瓶量50ml，30°C，220r/min 振蕩培養 12h。
[0234]30°C，220r/min振蕩培養，加入500 μ I無水甲醇誘導表達蛋白，每12小時添加一次，至發酵培養結束。
[0235]誘導96h后結束發酵。
[0236]結果檢測:
[0237]HPLC檢測發酵上清液甘精胰島素前體含量0.0559g/L,不加精氨酸對照發酵瓶甘精胰島素前體含量0.0511g/L,提高9.39%。
[0238]實施例12
[0239]本實驗組甘精胰島素C肽序列:SEQ ID NO:1所示氨基酸序列。
[0240]試驗組:
[0241]取甘油管保存的含有甘精胰島素前體基因的重組畢赤酵母GS115菌株接種于250ml搖瓶的BMGY種子培養基中，裝瓶量25ml，30°C，220r/min振蕩培養至20h，結束培養。
[0242]將培養得到的種子液5ml接種于500ml搖瓶的含有1.0%精氨酸的BMMY發酵培養基中，裝瓶量50ml，30° C，220r/min振蕩培養12h。
[0243]30°C，220r/min振蕩培養，加入500 μ I無水甲醇誘導表達蛋白，每12小時添加一次，至發酵培養結束。
[0244]誘導96h后結束發酵。
[0245]對照組:
[0246]取甘油管保存的含有甘精胰島素前體基因的重組畢赤酵母GS115菌株接種于250ml搖瓶的BMGY種子培養基中，裝瓶量25ml，30°C，220r/min振蕩培養至20h，結束培養。
[0247]將培養得到的種子液5ml接種于500ml搖瓶的BMMY發酵培養基中，裝瓶量50ml，30°C，220r/min 振蕩培養 12h。
[0248]30°C，220r/min振蕩培養，加入500 μ I無水甲醇誘導表達蛋白，每12小時添加一次，至發酵培養結束。
[0249]誘導96h后結束發酵。
[0250]結果檢測:
[0251]HPLC檢測發酵上清液甘精胰島素前體含量0.071g/L,不加精氨酸對照發酵瓶甘精胰島素前體含量0.0522g/L,提高36.01%。
[0252]實施例13
[0253]試驗組:
[0254]取甘油管保存的含有cecropin Pl基因的重組畢赤酵母GS115菌株接種于250ml搖瓶的BMGY種子培養基中，裝瓶量25ml，30°C，220r/min振蕩培養至20h，結束培養。
[0255]將培養得到的種子液5ml接種于500ml搖瓶的含有0.5%精氨酸的BMMY發酵培養基中，裝瓶量50ml，30°C，220r/min振蕩培養12h。
[0256]30°C，220r/min振蕩培養，加入500 μ I無水甲醇誘導表達蛋白，每12小時添加一次，至發酵培養結束。
[0257]誘導96h后結束發酵。
[0258]對照組:參照文獻中所記載方法。詳見(李巍，仲飛，李秀錦等.重組豬蛔蟲抗菌肽.[J].中國獸醫學報，2011,31 (8):1133-1137.)。
[0259]取甘油管保存的含有cecropin Pl基因的重組畢赤酵母GSl 15菌株接種于250ml搖瓶的BMGY種子培養基中，裝瓶量25ml，30°C，220r/min振蕩培養至20h，結束培養。
[0260]將培養得到的種子液5ml接種于500ml搖瓶的BMMY發酵培養基中，裝瓶量50ml，30°C，220r/min 振蕩培養 12h。
[0261]30°C，220r/min振蕩培養，加入500 μ I無水甲醇誘導表達蛋白，每12小時添加一次，至發酵培養結束。
[0262]誘導96h后結束發酵。
[0263]結果檢測:
[0264]HPLC檢測發酵上清液豬蛔蟲抗菌肽cecropin Pl含量0.142g/L，不加精氨酸對照發酵瓶豬蛔蟲抗菌肽cecropin Pl含量0.117g/L，提高17.61%。
[0265]以上所述僅是本發明的優選實施方式，應當指出，對于本【技術領域】的普通技術人員來說，在不脫離本發明原理的前提下，還可以做出若干改進和潤飾，這些改進和潤飾也應視為本發明的保護范圍。
【權利要求】
1.精氨酸在提高發酵培養氨基酸序列含有精氨酸-精氨酸的多肽的表達量中的應用。
2.根據權利要求1所述的應用，其特征在于，所述多肽的表達系統為原核表達系統和真核表達系統。
3.根據權利要求2所述的應用，其特征在于，所述多肽的表達系統為酵母表達系統或哺乳動物細胞表達系統。
4.根據權利要求3所述的應用，其特征在于，所述多肽的表達系統為酵母表達系統。
5.根據權利要求4所述的應用，其特征在于，所述酵母表達系統中宿主細胞選自畢赤酵母屬。
6.根據權利要求5所述的應用，其特征在于，所述畢赤酵母的菌株為GS115或X33。
7.根據權利要求1所述的應用，其特征在于，所述多肽為甘精胰島素前體或豬蛔蟲抗菌月太 cecropin Pl0
8.根據權利要求1所述的應用，其特征在于，所述多肽為甘精胰島素前體。
9.根據權利要求8所述的應用，其特征在于，所述甘精胰島素前體的C肽序列為SEQIDNO:1所示氨基酸序列、SEQ ID NO: 2所示氨基酸序列、SEQ ID NO: 3所示氨基酸序列、SEQID NO:4所示氨基酸序列或SEQ ID N0:5所示氨基酸序列。
10.根據權利要求8所述的應用，其特征在于，所述甘精胰島素前體無C肽。
11.一種提高氨基酸序列含有精氨酸-精氨酸的多肽的表達量的方法，其特征在于，包括如下步驟:· 取基因工程構建菌株經第一接種到種子培養基中，經第一培養獲得種子液； 取所述種子液經第二接種到發酵培養基中，經第二培養獲得培養液，經誘導表達蛋白，即得； 所述發酵培養基中添加精氨酸。
12.根據權利要求11所述的方法，其特征在于，以g/mL計，所述精氨酸與所述發酵培養基的質量體積比為0.087~1.74:100。
13.根據權利要求11所述的方法，其特征在于，以g/mL計，所述精氨酸與所述發酵培養基的質量體積比為0.17~1.39:100。
14.根據權利要求11所述的方法，其特征在于，以g/mL計，所述精氨酸與所述發酵培養基的質量體積比為0.61~1.13:100。
15.一種提高甘精胰島素前體表達量的方法，其特征在于，包括如下步驟: 取基因工程構建甘精胰島素前體序列的畢赤酵母菌株接種到種子培養基中，振蕩培養獲得種子液； 取所述種子液接種到添加了精氨酸的發酵培養基中，振蕩培養，誘導表達蛋白，即得。
16.—種提高豬蛔蟲抗菌肽cecropin Pl表達量的方法,其特征在于,包括如下步驟: 取基因工程構建cecropin Pl的大腸桿菌接種到種子培養基中，振蕩培養獲得第一種子液； 取所述第一種子液接種到發酵培養基中，振蕩培養獲得第二種子液； 取所述第二種子液加入精氨酸獲得培養液，振蕩培養，即得； 以g/mL計，所述精氨酸與所述培養液的質量體積比為0.5%。
17.一種提高甘精胰島素前體表達量的方法，其特征在于，包括如下步驟:取基因工程構建甘精胰島素前體序列的動物細胞，復蘇、稀釋后接種于培養液中獲得細胞液； 取所述細胞液振蕩培養，獲得第一培養液； 取所述第一培養液接 種于添加精氨酸的培養液中傳代培養，即得。
【文檔編號】C12R1/84GK103589767SQ201310361852
【公開日】2014年2月19日 申請日期:2013年8月19日 優先權日:2012年8月17日
【發明者】陳小鋒, 李利佳, 李曉平, 鄭翔芳, 張均, 李文佳 申請人:宜昌長江藥業有限公司