一種控制水稻第二和第三葉的葉綠體發育的基因及其檢測方法和應用的制作方法
【專利摘要】本發明涉及植物基因工程【技術領域】，具體公開了一種控制水稻第二和第三葉的葉綠體發育的基因，該基因具有SEQIDNO：1、SEQIDNO：3或SEQIDNO：4所示的核苷酸序列，將所述基因導入苗期白化轉綠的植株，其轉化植株苗期第二葉和第三葉的葉色變綠，將所述基因通過物理或化學的方法進行突變，并將突變基因通過雜交和回交的方式導入不育系，通過葉色差異以及PCR擴增可以方便、快捷的檢測雜交水稻不育系以及與它配制的雜交水稻的純度，從而為水稻育種技術提供理論支持。
【專利說明】一種控制水稻第二和第三葉的葉綠體發育的基因及其檢測方法和應用
【技術領域】
[0001]本發明涉及植物生物【技術領域】，更具體地，涉及一種控制水稻第二和第三葉的葉綠體發育的基因及其檢測方法和應用。
【背景技術】
[0002]葉色變異是比較常見的突變性狀，一般在苗期表達。由于突變基因往往是直接或間接影響葉綠素的合成和降解，改變葉綠素含量，所以葉色突變材料也稱為葉綠素突變材料。高等植物葉綠體是進行光合作用的場所，而葉綠體的發育不僅取決于葉綠體基因組編碼基因的表達，同時受一系列核基因的控制。研究表明控制葉綠體發育的核質基因發生突變可導致葉綠體發育受阻，引起植物葉色發生異常，甚至導致植物白化而無法進行光合作用。
[0003]葉綠體突變材料的來源十分廣泛，包括自然突變、人工誘發突變、插入突變和基因沉默突變。自然突變在自然條件下發生，未經過復雜的生物技術操作手段，將其直接用于常規育種，不存在轉基因安全性的問題。人工誘發突變是創造新種質、選育新品種的有效途徑。
[0004]目前，葉色突變材料已廣泛應用于基礎研究和生產實踐。例如，在種子純度鑒定方面，利用隱性葉色突變性狀可完全克服由于外來花粉的煩擾，確保良種的純度及質量；在雜交育種方面，可將葉色變異性狀導入雜交親本，還可以在苗期(間苗或移栽時)及時剔除親本自交后代，從而大大簡化雜交種生產。
[0005]現在有很多研究工作者利用物理、化學、生物等誘變方法創建水稻葉色突變材料，研究其生理和相關基因功能并作為可視標記應用于水稻的遺傳育種。本研究利用組織培養過程中得到的控制水稻苗期第二和第三葉白化但后期轉綠的突變材料，并通過圖位克隆技術克隆了相關基因。至今尚未有與此基因相關的文獻報道。
【發明內容】
[0006]本發明要解決的技術問題是克服水稻葉綠體基因研究技術的不足，提供一種控制水稻第二和第三葉的葉綠體發育的基因。
[0007]本發明的第二個目的是提供上述控制水稻第二和第三葉的葉綠體發育的基因所編碼的蛋白質。
[0008]本發明的第三個目的是提供含有上述基因的載體。
[0009]本發明的第四個目的是提供含有上述載體的重組體。
[0010]本發明的第五個目的是提供檢測上述控制水稻第二和第三葉的葉綠體發育的基因的特異性引物。
[0011]本發明的第六個目的是提供所述控制水稻第二和第三葉的葉綠體發育的基因的檢測方法。
[0012]本發明的第七個目的是提供上述基因或含有上述基因的載體或重組體在水稻親本或雜交種純度檢測中的應用。
[0013]本發明的目的是通過以下技術方案予以實現的:
一種控制水稻第二和第三葉的葉綠體發育的基因，其核苷酸序列如SEQ ID N0:U SEQID NO:3或SEQ ID NO:4所示；基因的基因組序列如SEQ ID NO:1所示，包括啟動子的基因組序列如SEQ ID N0:3所示；其cDNA序列如SEQ ID NO:4所示，水稻中該控制第二和第三葉的葉綠體發育的基因被破壞，即可導致水稻第二和第三葉白化，而第四葉和更上葉位葉片的葉綠體正常發育，植株正常抽穗結實。
[0014] 申請人:在組織培養中獲得一株苗期第二和第三葉白化轉綠的植株(苗期白化轉綠的植株)，對該植株進行測序，并將其與苗期第二和第三葉葉色為綠的植株的基因進行對t匕，即將該苗期白化轉綠的植株與秈稻“培矮64S”配制雜交組合，構建遺傳群體，利用SSR和InDel分子標記將控制葉綠體發育的基因定位在水稻第7染色體，并將其克隆分離出來。
[0015]本發明還提供了上述基因所編碼的蛋白質，其氨基酸序列如SEQ ID N0:2所示，所述蛋白是一個與在動物中廣泛存在的線粒體轉錄終止因子(mitochondrialtranscript1n terminat1n factor, mTERF)同源的蛋白。
[0016]含有上述控制水稻第二和第三葉的葉綠體發育的基因的載體。
[0017]含有上述載體的重組體，該重組體可以是將上述葉綠體發育基因以任一種方法與任一種載體相結合形成的重組體。
[0018]本發明還提供了一對用于檢測所述控制水稻第二和第三葉的葉綠體發育的基因的特異性引物，其核苷酸引物序列如SEQ ID NO:5和SEQ ID NO:6所示。
[0019]本發明還提供了控制水稻第二和第三葉的葉綠體發育的基因的檢測方法:用上述特異性引物對水稻DNA進行PCR擴增反應，得到長度為3039 bp的核苷酸片段，說明含有SEQ ID NO:3所示的基因。
[0020]本發明還提供了上述基因在水稻雜交種純度檢測中的應用，優選地，用所述基因進行水稻基因型或表型鑒定，并判斷雜交水稻親本和雜交種的純度；其操作可以是通過物理或化學的方法將上述控制水稻第二和第三葉的葉綠體發育的基因進行突變獲得突變基因，經測序該突變基因中的堿基缺失，mRNA不表達，則水稻早期第二和第三葉白化；將上述突變基因通過雜交和回交導入不育系。利用SEQ ID NO:5和SEQ ID NO:6所示的特異引物進行PCR，或播種不育系，在三葉幼苗期觀察水稻葉子的白化率，從而檢測不育系種子的純度，具體為:將攜帶上述突變基因的不育系與父本(含有野生型葉綠體基因)雜交制種。在雜種F1中，所述基因為雜合型，野生型等位基因的功能使真雜種的苗期葉色正常綠色，而由不育系自交產生的種子即假雜種的苗期第二和第三葉表現白化。因此可依此鑒定雜種純度，并可在育秩苗圃拔除白化苗，提聞雜種純度。
[0021]與現有技術相比，本發明具有以下有益效果:
本發明提供了一種新的控制水稻第二和第三葉綠體發育的基因，將所述基因導入苗期白化轉綠的植株，其轉化植株苗期第二葉和第三葉的葉色變綠，將所述基因通過物理或化學的方法進行突變，并將突變基因通過雜交和回交的方式導入不育系，通過葉色差異以及PCR擴增可以方便、快捷的檢測雜交水稻不育系以及與它配制的雜交水稻的純度，從而為水稻育種技術提供理論支持。
【專利附圖】
【附圖說明】
[0022]圖1為臺中65和苗期白化轉綠的植株基因組DNA的PCR擴增檢測圖。
[0023]圖2為臺中65和苗期白化轉綠的植株的基因的RT-PCR結果圖。
【具體實施方式】
[0024]下面結合說明書附圖和具體實施例進一步說明本發明的內容，但不應理解為對本發明的限制。在不背離本發明精神和實質的情況下，對本發明方法、步驟或條件所作的簡單修改或替換，均屬于本發明的范圍。若未特別指明，實施例中所用的技術手段為本領域技術人員所熟知的常規手段。
[0025]實施例1水稻第二和第三葉的葉綠體發育基因的定位本發明用圖位克隆法克隆水稻第二和第三葉綠體發育的基因。
[0026] 申請人:在組織培養過程中獲得了苗期白化轉綠的水稻植株，該植株在水稻苗期第二葉和第三葉白化，后期轉綠， 申請人:將該植株與秈稻“培矮64S”配制雜交組合，構建遺傳群體，選取1356個隱性純合突變F2個體作為遺傳做圖和定位群體，利用SSR和InDel分子標記將目標基因精細定位在第7染色體分子標記724273與724303之間，物理距離約為162
kb ο
[0027]實施例2水稻第二和第三葉的葉綠體發育的基因的分離克隆
1、水稻DNA的提取
根據分子克隆實驗手冊進行操作，包括以下步驟:
(1)取水稻(臺中65)幼苗期葉片約0.5g，把葉片剪碎，放入預冷的研缽中，加入液氮，將葉片研磨成粉末后，放入2 mL離心管中，加入800 μ L 2XCTAB抽提緩沖液，混勻，65°C水浴30min ；
(2)加入等體積的氯仿、異戊醇和無水乙醇(76:4:20)，振蕩10 min，充分混勻；
(3)在12000轉/分的條件下離心12min，將上清液轉移到另一個1.5mL離心管中，加入其0.6倍體積異丙醇或2倍體積無水乙醇，混勻，12000轉/分離心2min，去上清，用0.5ml 70%的乙醇漂洗兩次，風干，溶于100-200 μ L 0.5 X TE緩沖液中；
(4)取Iμ L用于后續的PCR擴增反應。
[0028]2、PCR擴增和基因檢測
(一)獲得控制水稻第二和第三葉的葉綠體發育的基因，具體操作如下:
PCR反應體系包括無菌水16.2μ?, 1Xbuffer 2μ?, 10Mmol/L上下游引物(引物序列如SEQ ID NO:5 和 SEQ ID NO:6 所示)各 0.2μ?，2.5mmol/L dNTPs 0.2μ?,5 υ/μ? Taq DNA 聚合酶0.2μ?, 50ng/^L模板DNA Ιμ?,反應體系的總體積為20 μ I。
[0029]SEQ ID NO:5:5，-CGAGGGTGGTTGGAGAGGAAG-3’
SEQ ID NO:6:5’ - GGAGCCGCACGTTGGTCTGCA-3’
PCR的反應條件為:94°C預變性5min，94°C變性30s，56°C退火30s，72°C延伸180s，30個循環；72°C延伸5min。
[0030]擴增得到的臺中65的PCR產物長度為3.0kb(圖1所示);其核苷酸序列如SEQ IDN0:3所示。由以上結果可知:采用上述特異性PCR引物對水稻所提取的DNA進行PCR擴增反應，得到3039 bp的核苷酸片段，說明含有控制控制水稻第二和第三葉的葉綠體發育的野生型基因(SEQ ID NO:3)，而白化轉綠植株的基因擴增片段為1756bp JBSEQ ID ΝΟ:11所示。所述白化轉綠植株的基因是在野生型基因(SEQ ID NO:3)的-1245bp至+38bp處發生1283bp的缺失。
[0031]參照NCBI網站上獲得的水稻臺中65的ORF序列，設計特異性RT-PCR引物，引物序列如 SEQ ID NO:7 和 SEQ ID NO:8 所示。
[0032]SEQ ID NO:7:5，- ATGGCGCCGCCTCCGCCGC-3，
SEQ ID NO:8:5’ - CTACCGCCTCGATGTTAATG-3’
對提取的正常植株cDNA進行擴增，其目的片段長度為1512bp，并進行測序，如SEQ IDNO:4所示。將測序得到的DNA序列即編碼序列利用DNAStar軟件翻譯成氨基酸序列如SEQID NO:2 所示。
[0033](二)檢測控制水稻第二和第三葉的葉綠體發育的基因和苗期白化轉綠的植株的基因，具體操作如下:
PCR反應體系包括無菌水16.2μ?, 1Xbuffer 2μ?, 10Mmol/L上下游引物(引物序列如SEQ ID NO:9 和 SEQ ID NO: 10 所示)各 0.2μ?，2.5mmol/L dNTPs 0.2μ?,5 υ/μ? Taq DNA聚合酶0.2μ?，模板為0.5μ?臺中65或苗期白化轉綠的植株幼苗葉片總RNA的RT產物，反應體系的總體積為20 μ L。
[0034]SEQ ID NO:9:5’ -GTCTGACTCAGGTGTTGTC-3’
SEQ ID NO:10:5’ -TACCGCCTCGATGTTAATG-3’
PCR反應條件為:94°C預變性5min;94°C變性30s，55°C退火30s，72°C延伸30s，30個循環；72°C延伸5min。
[0035]將得到的擴增產物上樣，于1.5%瓊脂糖凝膠進行電泳，經溴化乙錠染色后并在紫外觀察儀上成像如圖2所示，在臺中65中可以擴增出一條300bp的產物，而白化轉綠植株則無長度為300bp的擴增產物。
[0036]實施例3水稻第二和第三葉的葉綠體發育的基因的功能驗證
采用物理、化學方法誘變并破壞水稻中SEQ ID NO:1的基因序列。經測序該基因中的堿基缺失，其mRNA不表達，水稻早期第二和第三葉白化。該基因的功能互補實驗結果表明含有該正常基因的苗期白化轉綠后代植株第二和第三葉呈綠色，能正常抽穗結實。
[0037]水稻第二和第三葉的葉綠體發育的基因的功能驗證包括以下步驟:
(I)利用SSR和InDel分子標記對苗期白化轉綠植株的突變基因進行定位，通過測序和半定量RT-PCR分析，表明該基因序列發生突變并導致該基因表達沉默。
[0038](2)將SEQ ID NO:1的核苷酸序列以及該基因翻譯起始密碼子ATG上游長度為
2.3kb的啟動子序列和終止密碼子TAG后長度為1.5kb的DNA序列連接到植物轉化載體PCAMBIA1300上，經酶切、測序檢測驗證為該目的基因序列。
[0039](3)利用農桿菌介導的轉基因技術，將上述重組載體轉化苗期白化轉綠植株的愈傷組織，通過PCR擴增方法鑒定第一代陽性轉基因植株，其葉色為綠色。
[0040](4)萌發并種植第一代轉基因植株種子，其第二和第三葉的葉色出現分離，呈現綠色和白化表型，并符合孟德爾遺傳分離比例。
[0041]實驗結果表明，水稻第二和第三葉的葉綠體發育的基因正常表達時，水稻植株葉色呈綠色，將該正常基因導入苗期白化轉綠植株后所得的子代，其葉色性狀發生分離，因此可以通過此表型變化來鑒別水稻品種的真偽，提高種子純度。
【權利要求】
1.一種控制水稻第二和第三葉的葉綠體發育的基因，其特征在于，其核苷酸序列如32010勵:1、3即10勵:3或3即10勵:4所示。
2.權利要求1所述基因編碼的蛋白質，其特征在于，具有3即10勵:2所示的氨基酸序列。
3.含有權利要求1所述基因的載體。
4.含有權利要求3所述載體的重組體。
5.一對用于檢測權利要求1所述基因的特異性引物，其特征在于，其核苷酸序列如820 10勵:5和3即10勵:6所示。
6.權利要求1所述基因的檢測方法，其特征在于，用權利要求5所述引物對水稻0嫩進行？(?擴增反應，若得到長度為3039恥的核苷酸片段，說明含有3即10顯:3所示的基因序列。
7.權利要求1所述基因在水稻親本或雜交種純度檢測中的應用。
【文檔編號】C12N15/29GK104404055SQ201410744218
【公開日】2015年3月11日 申請日期:2014年12月9日 優先權日:2014年12月9日
【發明者】劉耀光, 張群宇, 薛德星, 李曉瑜, 龍云銘 申請人:華南農業大學