副雞嗜血桿菌pyrG基因PCR檢測試劑盒的制作方法
【專利摘要】一種副雞嗜血桿菌pyrG基因PCR檢測試劑盒，包括由盒本體(1)，在本體(1)內從上至下依次設置有第一海綿墊(2)、隔離硬紙板(3)、第二海綿墊(4)，第一海綿墊(2)上設有4個放試劑管的小孔，分別放置：10×PCR?Buffer(含Mg2+)試劑管(5)、dNTP試劑管(6)、引物pyrGA試劑管(7)、引物pyrG?B試劑管(8)，第二海綿墊(4)上設有4個放試劑管的小孔，分別放置：TaqDNA聚合酶試劑管(9)、Marker?DL-2000試劑管(10)、陰性對照試劑管(11)、陽性對照試劑管(12)，盒本體(1)底層放置說明書(13)。本試劑盒設計合理，不僅保持了PCR的高靈敏性，而且使得被檢測基因的特異性大大提高，使用方便、成本低而且能夠快速診斷病原。
【專利說明】副雞嗜血桿菌pyrG基因PCR檢測試劑盒
【技術領域】
[0001]本實用新型屬于生物【技術領域】，涉及副雞禽桿菌pyrG基因檢測試劑盒，是通過PCR技術擴增出939bp的基因片段，檢測發病雞群中病雞的眶下竇分泌物中存在的副雞嗜血桿菌的PCR檢測試劑盒。
【背景技術】
[0002]雞傳染性鼻炎(infectious coryza IC)是由副雞嗜血桿菌(Haemophilusparagal I inarum Hp g)引起的一種雞的急性上呼吸道感染及毒素作用疾病。造成的最大損失是蛋雞產蛋率的下降(10% -40% )及育成雞和肉雞的生長不良和淘汰率增加，給養雞業造成了較大的經濟損失。按Page的分型方法，可將副雞嗜血桿菌分為A、B和C三個血清型，各血清型之間沒有交叉保護，B型的免疫保護有一定的型特異性，所以了解病原的血清型分布可以更好的預防和控制本病。
[0003]已采用的幾種血清學方法中，血凝抑制試驗幾乎是早期診斷傳染性鼻炎最合適的方法，三個血清型中有些共同抗原，所以用單一血清型制備的抗原仍有可能檢出不同型的凝集素。HI抗體的產生晚于凝集抗體和瓊擴抗體，所使用的HI抗原主要用于A血清型菌株的測定；(:型菌株作HI試驗時，抗原需用硫氰化鉀處理，超聲波裂解，紅細胞需要用戊二醛處理稀釋液為含0.1%牛血清白蛋白的PBS。但此法不適于早期感染或免疫雞的抗體水平。
[0004]目前比較成功的是DNA探針和PCR技術，陳小玲等于1996年從其建立的HpgDNA文庫中篩選出了 4個種特異性片斷并用地高辛進行標記，可檢測純化DNA量均在7.8-31.25ug之間.通過對最小探針部分序列的測定，設計了兩對PCR引物，建立了兩種PCR診斷方法，在對41個Hpg分離株測定時，結果均為陽性，而對26個非Hpg的測定.結果均為陰性，并均能檢測出Hpg的DNAlO3-1O3個菌細胞。該方法良好的特異性和敏感性使之可以用來直接檢測Hpg，用于臨床上直接樣品的檢測，從而提高了診斷的敏感性，但不能夠應用于血清型的分類。而宋敏訓等在2001年建立的aroA-PCR的敏感性更是進了一大步。他們利用aroA基因設計了 I對引物.分別對10株標準副雞嗜血桿菌(Hpg)菌株、14株分離的Hpg菌株進行PCR擴增.結果均得到了與預期大小一致的片段.而對10株非Hpg菌株和3株病毒進行擴增則無相應片段產生；該PCR能檢到出10個菌細胞。
[0005]細菌分離是檢測病雞病料中副雞禽桿菌常用的方法，但副雞禽桿菌的生長依賴NAD，對細菌的分離培養可按常規操作將病料接種于鮮血瓊脂培養基(在金黃色葡萄球菌劃線附近生長)，補充NAD的雞肉湯培養基。細菌的分離培養對確診是十分有必要的，但往往不能成功，這是因為副雞禽桿菌十分嬌嫩，難以滿足其生長需要。而PCR技術以其特異性強，所需病料組織少，敏感，方便等優點已得到世界公認，廣泛應用于各種微生物、病原體等多種動物病原的臨床檢測和病原確診。

【發明內容】

[0006]本實用新型的目的是為克服細菌分離鑒定分離率成功率不高，無法確診，檢測成本高的不足之處，采用PCR技術，提供一種副雞禽桿菌pyrG基因檢測試劑盒。
[0007]本實用新型試劑盒包括由盒本體，在本體內從上至下依次設置有第一海綿墊、隔離硬紙板、第二海綿墊，第一海綿墊上設有4個放試劑管的小孔，分別放置:10XPCRBuffer (含Mg2+)試劑管、dNTP試劑管、引物pyrG A試劑管、引物pyrG B試劑管，第二海綿墊上設有4個放試劑管的小孔，分別放置=TaqDNA聚合酶試劑管、Marker DL-2000試劑管、陰性對照試劑管、陽性對照試劑管，盒本體I底層放置說明書。
[0008]檢測用引物有兩對:上游，pyrG A ;下游:pyrG B。
[0009]pyrG A 上游 5-GCGGGACACGATGTGGCTAT-3
[0010]pyrG B 下游 5-TGGCGATGACGTTCCTCAAT-3
[0011]對照品分為陽性對照和陰性對照，陰性對照為陽性對照，陽性對照為副雞禽桿菌Apg-8標準株(CVCC254)購自中國獸藥監察所。
[0012]本試劑盒保存于4°C，盡量減少反復凍融。
[0013]本實用新型主要用于在病雞眶下竇組織中檢測細菌來對雞群進行疫病診斷和病原確診，從而指導臨床病雞群的臨床用藥和飼養管理，預防副雞禽桿菌的發病和健康雞死亡，減少養殖場和養殖戶的損失。
[0014]本實用新型建立了利用PCR技術檢測副雞禽桿菌的方法，并經檢測病雞框下竇分泌物標本證實該方法切實可行。PCR檢測靈敏度很高。但是引物二聚體、單鏈二級結構以及錯誤的擴增產物引起的假陽性會影響定量的精確性。在本檢測項目中，通過優化引物和PCR反應液，避免了非特異性的擴增，同時保持了 PCR的高靈敏性，而且使得被檢測基因的特異性大大提高。與病料分離細菌法及探針法相比較，方便且便宜。
[0015]本試劑盒使用方法:
[0016]每次檢測均應設立陽性和陰性對照。
[0017]模板DNA的制備
[0018]挑眶下竇分泌物少許，加入20μ L水中，95°C加熱lOmin，然后_20°C存放10分鐘后做PCR，
[0019]PCR 擴增
[0020]25 μ L 反應體系(2.5μ LlOXbuffer,2.Ομ L dNTP、引物 A 和引物 B 各 1.0 μ L、模板 0.5 μ L、rTaq 酶 0.5 μ L、超純水 17 μ L)于 95°C變性 5min，然后 25 個循環(94°C lmin，53.9°C lmin，72°C 2min)最后72°C延伸lOmin。將電泳產物按膠回收試劑盒說明書進行回收。
[0021]本實用新型具有的特點是:本實用新型通過優化PCR的引物和PCR的條件，避免了非特異性的擴增，并保持了 PCR的高靈敏性，使得被檢測基因的特異性大大提高。本實用新型設計合理，與現有培養法相比較，不需要病料分離提取細菌，使用方便而且成本低。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0022]圖1為本實用新型試劑盒結構示意圖。
【具體實施方式】
[0023]本實用新型結合具體實施例和附圖作進一步說明。應理解，這些實施例僅用于說明目的，而不用于限制本發明范圍。
[0024]實施例1
[0025]參見圖1，本實用新型試劑盒包括由盒本體1，在本體I內從上至下依次設置有第一海綿墊2、隔離硬紙板3、第二海綿墊4，第一海綿墊2上設有4個放試劑管的小孔，分別放S =IOXPCR Buff er (含Mg2+)試劑管5、dNTP試劑管6、引物pyrG A試劑管7、引物pyrGB試劑管8，第二海綿墊4上設有4個放試劑管的小孔，分別放置=TaqDNA聚合酶試劑管9、Marker DL-2000試劑管10、陰性對照試劑管11、陽性對照試劑管12，盒本體I底層放置說明書13。
[0026]實施例2
[0027]副雞禽桿菌河南株pyrG基因PCR技術檢測及應用
[0028]I材料及方法
[0029]1.1菌種及培養基
[0030]副雞禽桿菌Apg-8標準株(CVCC254)購自中國獸藥監察所，疑似副雞禽桿菌待鑒定河南濮陽分離株編號為HN-1，其他對照菌株具由濱州職業想學院重點實驗室提供，副雞禽桿菌培養基參照資料自制。
[0031]1.2 病料
[0032]河南省濮陽送檢疑似傳染性鼻炎病死蛋雞，剖檢鼻腔和鼻竇粘膜卡他性炎癥，表面有大量粘液，鼻竇、眶下竇和眼結膜囊內有干酪樣物，用無菌棉拭子采集典型發病雞的眶下竇
[0033]1.3主要試劑和工具酶
[0034]IOXBuffer (含 Mg2+)、dNTP、TaqDNA 聚合酶、pMD18_T Vector, DNA 凝膠回收試劑盒，均購自大連寶生物工程有限公司。感受態細胞DH5a，由本院重點實驗室提供。
[0035]1.4病料鏡檢及分離培養
[0036]分別取病雞的眶下竇分泌物涂片，革蘭氏染色后鏡檢。并將采取的50只雞的眶下竇病料分別劃線接種于雞鮮血瓊脂、雞肉湯瓊脂、麥康凱瓊脂培養基上，以燭缸法置37°C條件下培養24h至48h，挑選灰白色、半透明、針尖大小菌落進行純培養，同時涂片，革蘭氏染色，鏡檢。
[0037]1.5模板DNA的制備
[0038]挑幾個菌落加入20 μ L水中，95°C加熱lOmin，然后_20°C存放10分鐘后做PCR。
[0039]1.6引物設計
[0040]參照GenBank中已知副雞禽桿菌pyrG部分基因序列,借助Primer5.0引物設計軟件設計I對引物，送上海生工合成，引物的序列如下:
[0041]pyrG A:5-GCGGGACACGATGTGGCTAT_3
[0042]pyrG B: 5-TGGCGATGACGTTCCTCAAT-3
[0043]1.7PCR 擴增
[0044]25 μ L 反應體系(2.5μ L10Xbuffer、2.0μ LdNTP、A和 B 各 1.0 μ L、模板 0.5 μ L、rTaq 酶 0.5 μ L、超純水 17 μ L)于 95°C變性 5min,然后 25 個循環(94°C lmin, 53.9V lmin,72 °C 2min)最后 72°C 延伸 IOmin。
[0045]1.8PCR產物的純化及克隆鑒定[0046]將電泳產物按膠回收試劑盒說明書進行回收。然后按文獻操作，將回收產物插入PMD18-T克隆載體內，并轉化大腸桿菌DH5a中，菌液全部均勻涂到含有Amp抗生素的LB固
體培養基上。
[0047]1.9質粒的提取和酶切鑒定
[0048]挑取單克隆菌落于含1.0mg/mL Amp的LB液體培養基中，37°C振蕩過夜培養，通過堿裂解法小量提取質粒，經BamH I和psk I雙酶切鑒定重組質粒，反應體系為:模板6ul，IOXKbufferl μ L, BamH0.5 μ L, pst 10.5 μ L,超純水 2 μ L,反應過程為:37°C，2 個小時。
[0049]1.10序列測定與分析
[0050]取酶切鑒定陽性的質粒，送上海生工測序。序列分析采用DNAStar軟件對所測基因序列與我們設計引物所用的序列進行比較，分析其核苷酸的同源性。
[0051]2 結果
[0052]2.1病料涂片鏡檢和分離結果
[0053]鏡檢可見分泌物中有大量的單個、成對或短璉的兩極濃染的革蘭氏陰性細小桿菌。在麥康凱瓊脂、鮮血瓊脂平板上，均無菌生長。在雞肉湯瓊脂上生長出圓形、灰白色、半透明、凸起的小菌落，挑取菌落涂片，染色、鏡檢，仍可見到與病雞病料中相同的細菌。
[0054]2.2生長因子試驗
[0055]在葡萄球菌落周圍生長出衛星狀的菌落。用沾取I %輔酶I溶液直接在培養基劃線，也出現相同的現象，這符合副雞禽桿菌在輔酶I存在條件下生長時出現的“衛星現象”。
[0056]2.3PCR 結果
[0057]將副雞禽桿菌Hpg-8，分離株HN-1，禽多殺性巴氏桿菌C48-1，豬傳染性胸膜肺炎放線桿菌265，副豬嗜血桿菌，雞葡萄球菌。雞沙門氏菌，雞大腸桿菌(O1) 8株細菌提取的DNA為模板進行擴增，結果Hpg-8，分離株HN-1均擴增出一條分子量約Ikb的條帶。而其他細菌對照和超純水對照均未擴增出任何條帶。
[0058]2.4PCR產物的純化及克隆鑒定
[0059]將所獲得PCR產物進行純化回收，與pMD18-T載體進行連接，轉化E.coli DH5a。經氨芐青霉素篩選，采用BamH I和psk I雙酶切，表明篩選出陽性重組質粒
[0060]2.5PCR產物的克隆及序列測定
[0061]將酶切鑒定陽性的質粒送樣測序，測序結果如下:
[0062]CTGTGGGCGATATTGAATCATTGCCGTTCTTAGAAGCGTTACGCCAGTTAGCTGTTGATGTTGGGCGTGAGCGAACCATTTTTATGCATTTGACCCTTGTGCCTTATATTCCGACTGCGGGCGAGGTGAAAACTAAGCCAACTCAGCATTCAGTGAAAGAGTTGTTGTCTATCGGTATTCAGCCTGATGTGTTGATTTGTCGTTCAGATCGTATGATACCACCAAATGAGCGAAGCAAAATTGCACTGTTCTGTAATGTGCCAGAGCGTGCGGTAATTTCTTTAAAAGATGTGAATTCTATTTATCAAATTCCAGCCTTATTGAAATCCCAAGGCTTAGATGAATTTATTTGTCAGCGTTTTCGTTTAGCTTGTCCAGAAGCTGATTTAAGCGAATGGGAACAAGTGCTTTATCAACAAGCTAACCCAACAGGCGAAGTTACTATTGGTATGGTAGGGAAATATACAGAATTGCCTGATGCTTATAAATCGGTTAATGAAGCATTGAAACACGGCGGGTTAAAAAATCGTTTGAATGTAAATATTAAATATATCGATTCTGAAGATGTAGAAAGTAAAGGCACGGAGGTGTTAGCTGGATTAGATGGAATTTTAGTGCCGGGAGGCTTTGGATATCGTGGTGTAGAGGGTAAAATTCGTACAGCACAATATGCCCGTGAGAACAATATTCCTTACTTAGGGATTTGTTTGGGAATGCAGGTGGCATTAATTGAATATGCACGTCATAAAGCGGGATTAACGGAAGCTAACTCCACGGAATTTGATAAAGACTGTAAACAACCTGTGGTAGGTTTAATTACTTGAATGGCAAGATGCGGAAGGCAAGATTGAAACCCGTAGTGATAAGTCTGATCTGGGTGGTACAATGCGTTTAGGAGCTCAACAATGCCACCTTG
CTGAGGGTAGTCTTGCACGCGAA
[0063]2.6序列對比分析
[0064]測序報告結果表明，從BZ-1中擴增出的片斷長度為939bp，與預期大小完全一致，該序列與Genbank上收錄的3株其他Hpg的序列同源性98%。從分子水平表明我們分離的河南株確定為副雞嗜血桿菌。
【權利要求】
1.一種副雞嗜血桿菌pyrG基因PCR檢測試劑盒，包括由盒本體(I)，其特征在于:在本體(I)內從上至下依次設置有第一海綿墊(2)、隔離硬紙板(3)、第二海綿墊(4)，第一海綿墊⑵上設有4個放試劑管的小孔，分別放置:10XPCR Buffer (含Mg2+)試劑管(5)、dNTP試劑管(6)、引物pyrGA試劑管(7)、引物pyrG B試劑管(8)，第二海綿墊(4)上設有4個放試劑管的小孔，分別放置:TaqDNA聚合酶試劑管(9)、Marker DL-2000試劑管(10)、陰性對照試劑管(11)、陽性對照試劑管(12)，盒本體⑴底層放置說明書(13)。
【文檔編號】C12M1/34GK203768362SQ201420065510
【公開日】2014年8月13日 申請日期:2014年2月14日 優先權日:2014年2月14日
【發明者】吳憶春, 苗立中, 李金霞, 趙自國, 吳彬, 趙霞 申請人:濱州職業學院