單管聯合測定乙醛脫氫酶2基因與亞甲基四氫葉酸還原酶基因突變位點的試劑盒的制作方法
【專利摘要】單管聯合測定乙醛脫氫酶2基因與亞甲基四氫葉酸還原酶基因突變位點的試劑盒，屬于分子生物學檢驗領域。包括全血基因組DNA提取試劑、多重PCR擴增引物、多重PCR擴增反應試劑、單鏈DNA分離和純化試劑、焦磷酸測序引物、焦磷酸測序試劑和盒體，全血基因組DNA提取試劑、多重PCR擴增引物、多重PCR擴增反應試劑、單鏈DNA分離和純化試劑、焦磷酸測序引物、焦磷酸測序試劑設在盒體內。用途：希望了解個體對乙醇和葉酸代謝能力情況的健康體檢者；預測個體對硝酸甘油代謝能力和療效，指導心梗患者合理選擇和備用血管舒張急救藥物；預測個體對葉酸的代謝能力，指導孕產婦和兒童補充適合劑量的葉酸補充劑等。
【專利說明】單管聯合測定乙醛脫氫酶2基因與亞甲基四氫葉酸還原酶 基因突變位點的試劑盒

【技術領域】
[0001] 本實用新型屬于分子生物學檢驗領域，尤其是涉及一種單管聯合測定乙醛脫氫酶 2 (ALDH2)基因與亞甲基四氫葉酸還原酶（MTHFR)基因突變位點的試劑盒。該技術可應用到 臨床的檢測，流行病學的篩查以及種群基因組差異的研宄。尤其是其可應用于臨床體檢與 藥物基因組學檢測。

【背景技術】
[0002] 隨著高通量測序的普及以及人類基因組計劃的完成，個體化診療技術正逐步邁向 日常臨床診斷與治療工作，并正逐漸影響著臨床診療思維和個人健康管理的方式。單核苷 酸多態性分析（SNP)是個體化診療的重要組成部分，目前主要應用于患者的藥物基因組學 檢測中，對患者的用藥劑量與用藥周期進行指導。實際上，SNP分析不僅僅能作為有效的藥 物基因組學標志物，其亦可作為一種優良的疾病篩查與防治標志物在體檢中進行應用。
[0003] 1、ALDH2基因的臨床研宄進展
[0004] 乙醛脫氫酶ALDH是酒精代謝中將乙醛轉化為乙酸的關鍵酶，位于12號染色體的 ALDH2基因是線粒體乙醛脫氫酶的主要編碼基因。當ALDH2基因發生錯意SNP突變時，其編 碼合成的ALDH酶活性將發生不同程度的降低。ALDH酶活性的降低將引起機體對乙醛代謝 能力的下降，導致大量攝入酒精后血清乙醛濃度的急劇升高，最終導致對肝臟功能的急性 損害，并與肝臟、胃、食管等消化系統癌癥的發生相關 [14]。同時，ALDH酶已被證明在重要的 急性心血管藥物一一硝酸甘油的代謝活化通路中扮演著重要的角色，其活性的降低乃至喪 失將引起硝酸甘油的療效降低甚至完全失效 [5]。根據美國國立生物信息技術中心NCBI數 據庫的數據，ALDH2基因的Glu504Lys突變在中國人群中所占比例高達30 %，為中國人群最 常見的ALDH2點突變。近年來研宄[6'7]還表明，該突變可能與漢族人群中的二型糖尿病和 冠心病的發病相關。
[0005] 2、MTHFR基因的臨床研宄進展
[0006] 亞甲基四氫葉酸還原酶MTHFR是葉酸代謝中的關鍵酶之一，可將還原型輔酶 I (NADPH)相關的5, 10-亞甲基四氫葉酸還原為5-甲基四氫葉酸。前者生物學作用為細 胞內一碳基團的傳遞體，參與嘌呤和嘧啶的合成及DNA修復過程；而5-甲基四氫葉酸作 為甲基供體，在甲硫氨酸合成酶的催化下將甲基基團提供給同型半胱氨酸生成蛋氨酸，并 進一步復甲基化為S-腺苷甲硫氨酸，而參與體內廣泛的甲基化反應。當MTHFR基因發生 SNP錯意突變時，其活性下降將導致體內葉酸代謝過程障礙從而引發多種疾病，包括導致唐 氏綜合征風險增高和新生兒發育異常 [84°]，伴高同型半胱氨酸血癥的梗阻性腦卒中[11]，還 與深靜脈血栓的發生密切相關 [12]。根據美國國立生物信息技術中心NCBI數據庫的數據， MTHFR基因的C677T單核苷酸SNP多態性在中國人群中最為普遍，漢族人口攜帶者比率約為 27% -46% 〇
[0007] 3、焦磷酸測序方法學的優點
[0008] 目前，對于單核苷酸多態性SNP的檢測技術主要包括基于等位基因特異性雜交的 Taqman探針技術，分子信標技術等；基于核酸內切酶的限制性長度多態性技術，引物入侵 分析技術等；基于高度特異性DNA連接酶的寡核苷酸連接分析技術；基于引物延伸的直接 測序法和等位基因特異性延伸法等。但這些方法大多操作復雜，成本昂貴，因而沒有在大規 模SNP檢測中得到應用。焦磷酸測序法由于其良好的定量性能，無需電泳或熒光標記，易于 自動化等優點已成為SNP檢測最主要的方法。但是，由于以往的焦磷酸測序中各個位點的 擴增反應需要單獨進行，這意味著需要檢測的項目有幾個突變位點，則需要相應數量的擴 增反應。這無形中大大的提高了焦磷酸測序檢測作為臨床檢測的成本和價格，被動地將大 量需要進行該檢測的患者拒之門外。本實用新型將ALDH2基因與MTHFR基因兩個突變點進 行單管的多位點擴增反應進行焦磷酸測序的檢測，降低了檢測的成本、簡化了技術流程，從 而降低了檢測的費用與成本，降低了個體化醫學的門檻。
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【發明內容】

[0022] 本實用新型的目的在于提供一種單管聯合測定乙醛脫氫酶2 (ALDH2)基因與亞甲 基四氫葉酸還原酶（MTHFR)基因突變位點的試劑盒。
[0023] 本實用新型包括：
[0024] (1)全血基因組DNA提取試劑：所述全血基因組DNA提取試劑來源于商品化的血 液基因組提取試劑盒，購自天根生化科技（北京）有限公司，由緩沖液GD、緩沖液GB、蛋白 酶K、吸附柱CB3、漂洗液PW和洗脫緩沖液TB組成全血基因組DNA提取試劑。
[0025] (2)多重PCR擴增引物：由PCR引物UPCR引物2、PCR引物3、PCR引物4組成多 重PCR擴增引物；
[0026] PCR 引物 l(Seq N01):
[0027] ALDH2Glu504Lys(rs671)上游引物 5' -CAGTCACCCTTTGGTGGCTACA-3' ；
[0028] PCR 引物 2(Seq N02):
[0029] ALDH2Glu504Lys(rs671)下游引物 5' -CCAGCAGGTCCCACACTCAC-3' ；
[0030] PCR 引物 3(Seq N03):
[0031] MTHFR C677T(rsl801133)上游引物 5' -GGCTGACCTGAAGCACTTGAA-3' ；
[0032] PCR 引物 4 (Seq N04):
[0033] MTHFR C677T(rsl801133)下游引物 5' -CAAGTGATGCCCATGTCGGT-3'。
[0034] 其中引物1和引物3的5'端均進行生物素標記。
[0035] (3)多重PCR擴增反應試劑：所述多重PCR擴增反應試劑名為"2X PyroMark PCR Master Mix"，來自德國QIAGEN公司的PyroMark PCR Kit試劑盒。由熱啟動TaqDNA聚 合酶、脫氧核糖核苷三磷酸dNTPs、鎂離子Mg2+、鈉離子Na +以及擴增反應特異性增強劑 Q-Solution組成多重PCR擴增反應試劑。
[0036] (4)單鏈DNA分離和純化試劑：所述單鏈DNA分離和純化試劑，由購自美國通用健 康公司GE Healthcare的高性能鏈霉親和素瓊脂糖、購自德國QIAGEN公司的PyroMark結 合緩沖液、PyroMark變性溶液和PyroMark洗脫緩沖液10X濃縮液組成單鏈DNA分離和純 化試劑。
[0037] (5)焦磷酸測序引物：由測序引物1、測序引物2組成焦磷酸測序引物；
[0038] 測序引物 l(Seq N05):
[0039] ALDH2Glu504Lys(rs671)測序引物 5' -CACACTCACAGTTTTCACTT-3' ；
[0040] 測序引物 2(Seq N06):
[0041] MTHFR C677T(rsl801133)測序引物 5' -TGCGTGATGATGAAAT-3'。
[0042] (6)焦磷酸測序試劑：所述焦磷酸測序試劑為DNA焦磷酸測序的常規試劑，購自德 國QIAGEN公司，由PyroMark退火緩沖液、酶復合物、底物復合物和脫氧核糖核苷三磷酸復 合物dNTP組成焦磷酸測序試劑，其中dATP為人工修飾的α -硫代脫氧腺苷三磷酸，其余 脫氧胞苷三磷酸、脫氧鳥苷三磷酸、脫氧胸苷三磷酸未修飾；所述酶復合物包括焦磷酸測序 所有需要的酶，即DNA聚合酶、ATP硫酸化酶、熒光素酶、腺苷三磷酸雙磷酸酶；所述底物復 合物為腺苷-5' -磷酸硫酸酐。
[0043] (7)盒體：全血基因組DNA提取試劑、多重PCR擴增引物、多重PCR擴增反應試劑、 單鏈DNA分離和純化試劑、焦磷酸測序引物、焦磷酸測序試劑設在盒體內。
[0044] 本實用新型的使用方法如下：
[0045] (1)人類全血基因組DNA提取：采用本實用新型的全血基因組DNA提取部分試劑， 包括利用緩沖液GB和蛋白酶K溶解外周血白細胞，緩沖液GD和漂洗液PW去除蛋白成分， 最后以洗脫液TB洗脫得到DNA成分，整個提取反應以吸附柱CB3為DNA與細胞碎片和DNA 與蛋白質分離的介質。
[0046] (2)多重PCR擴增反應：采用本實用新型的多重PCR引物和多重PCR擴增反應試 劑，具體的反應體系和反應條件如表1和表2所示。
[0047] 表1多重PCR擴增反應體系
[0048]

【權利要求】
1.單管聯合測定乙醛脫氫酶2基因與亞甲基四氫葉酸還原酶基因突變位點的試劑盒， 其特征在于包括： 全血基因組DNA提取試劑瓶、多重PCR擴增引物瓶、多重PCR擴增反應試劑瓶、單鏈DNA 分離和純化試劑瓶、焦磷酸測序引物瓶、焦磷酸測序試劑瓶、盒體；全血基因組DNA提取試 劑瓶內裝有全血基因組DNA提取試劑，多重PCR擴增引物瓶內裝有多重PCR擴增引物，多重 PCR擴增反應試劑瓶內裝有多重PCR擴增反應試劑，單鏈DNA分離和純化試劑瓶內裝有單鏈 DNA分離和純化試劑，焦磷酸測序引物瓶內裝有焦磷酸測序引物，焦磷酸測序試劑瓶內裝有 焦磷酸測序試劑；全血基因組DNA提取試劑瓶、多重PCR擴增引物瓶、多重PCR擴增反應試 劑瓶、單鏈DNA分離和純化試劑瓶、焦磷酸測序引物瓶、焦磷酸測序試劑瓶設在盒體內。
【文檔編號】C12Q1/68GK204162727SQ201420084983
【公開日】2015年2月18日 申請日期:2014年2月27日 優先權日:2014年2月27日
【發明者】葉輝銘, 蘇曉崧, 張忠英 申請人:廈門大學附屬中山醫院, 葉輝銘