納米硒霉菌毒素解毒劑及其制備方法和用圖
【技術領域】
[0001 ]本發明涉及一種納米砸霉菌毒素解毒劑及其制備方法和用途。
【背景技術】
[0002]霉菌毒素是一類在霉菌生長過程中產生的有毒次級代謝物，目前大約有300多種霉菌代謝產物對人類和動物具有毒性，其中對人類和動物健康影響最大的霉菌毒素有黃曲霉毒素、玉米赤霉稀酮、赭曲霉毒素、T-2毒素、伏馬毒素和嘔吐毒素等。在農作物和飼料生產、加工、貯存和運輸過程中，由于霉菌及其毒素的污染導致飼料霉變、消化率降低、動物霉菌毒素中毒等危害，給飼料業和養殖業造成巨大經濟損失，更為重要的是霉菌毒素不僅可以直接對動物造成毒害，還可以通過食物鏈從動物轉移到人體中，危害人類健康。飼料被霉菌及其毒素污染一直是飼料業和畜牧業生產普遍存在的事件，當前飼料及原料霉菌毒素污染范圍更廣，污染程度更高，且多種霉菌毒素共存的現象更為普遍，高達96.48%的飼料及原料受到2種及以上霉菌毒素污染(杜妮.2015年上半年飼料及原料霉菌毒素污染及調查報告[J].今日養豬業，2015，7:48-51)，動物采食了主要含嘔吐毒素、玉米赤霉烯酮和黃曲霉毒素BI的自然霉變飼料可導致氧化損傷，免疫功能降低，生長受到抑制(朱祖賢，朱風華，王友令等.霉菌毒素對肉雞抗氧化和免疫功能的影響[J].中國畜牧雜志，2014，50(19):78-83)，因此如何預防和控制飼料中的霉菌毒素，降低其危害，已成為當前農業、環境、衛生及食品等領域迫切需要解決的問題。在實際生產中，目前國內外防控飼料霉菌及其毒素污染的主要方法是使用防霉脫霉劑。常用的防霉脫霉劑主要為有機酸及其鹽類、硅鋁酸鹽及其衍生物類、酵母細胞壁類、微生物類、酶類和中草藥類等等。大部分脫霉劑作用的機理是依靠其較強的吸附毒素的性能，減少霉菌毒素被機體吸收，減輕其對機體的毒害作用，從而達到脫毒的效果。但總有少量霉菌毒素不被吸附并被機體吸收，對機體產生毒害作用。

【發明內容】

[0003]本發明的目的在于提供一種能高效吸附霉菌毒素的納米砸霉菌毒素解毒劑及其制備方法和用途。
[0004]本發明的技術解決方案是:
一種納米砸霉菌毒素解毒劑，其特征是:由納米砸、殼聚糖配比復合制成。
[0005]—種納米砸霉菌毒素解毒劑的制備方法，其特征是:步驟如下:
(1)在活化的飼用益生菌培養液中加入砸鹽溶液進行培養；
(2)收集培養液，超聲破碎洗滌后，即得紅色的納米砸；
(3)透射電子顯微鏡觀察納米砸的表征；
(4)測定納米砸含量及其抗氧化活性；
(5)將納米砸、殼聚糖混合均勻制得納米砸霉菌毒素解毒劑。
[0006]使用的飼用益生菌為地衣芽孢桿菌。
[0007]使用的砸鹽為亞砸酸鈉或二氧化砸中的任意一種。
[0008]步驟(I)的培養條件為30-37°C，100-200RPM培養24-48h。
[0009]納米砸與殼聚糖配比為1:0.1-10。
[0010]一種納米砸霉菌毒素解毒劑在制備吸附霉菌毒素和消除霉菌毒素毒害制劑中的應用。
[0011]本發明制備的納米砸霉菌毒素解毒劑具有以下優點:
A.利用飼用益生菌制備的納米砸具有抗氧化、免疫調節和抗霉菌毒素等多種功能，功能納米砸的使用可以發送動物機體的免疫功能，強化肝臟解毒功能，緩解霉菌毒素中毒的臨床癥狀；
B.生物多聚物殼聚糖是由甲殼動物外殼提取的一種高效物質，具有較強的抗細菌、真菌活性，其多孔徑的結構可以大面積的吸附霉菌毒素；
C.將納米砸與殼聚糖集成制備的納米砸霉菌毒素解毒劑，使解毒劑在高效吸附霉菌毒素的同時，提高動物機體的免疫機能和抗氧化能力，從體內和體外兩個方面減輕或消除霉菌毒素對畜禽健康和生產性能的影響，在納米砸霉菌毒素解毒劑抗霉菌毒素應用效果試驗中，添加納米砸霉菌毒素解毒劑可以完全消除霉菌毒素DON對蛋雞體重、產蛋率、非正常蛋比例和血清總抗氧化能力等的影響，解毒效果極顯著；
D.納米砸霉菌毒素解毒劑制備工藝簡單，條件溫和，易于實現規模化生產。
【附圖說明】
[0012]圖1為利用飼用益生菌制備的紅色納米砸圖。圖中A在地衣芽孢桿菌培養液中加入一定量的亞砸酸鈉溶液，30-37°C、100-200 r / min振蕩繼續培養24-48 h，亞砸酸鈉被地衣芽孢桿菌還原為紅色單質砸;B正常的衣芽孢桿菌培養液對照。。
[0013]圖2為利用飼用益生菌制備的紅色納米砸的電鏡觀察圖。將飼用益生菌制備的紅色納米砸滴于銅網，染色后透射電子顯微鏡下觀察，純化后的紅色納米砸顆粒粒徑大小為100 nm左右。
【具體實施方式】
[0014]下面結合具體實施例詳細闡述本發明，但并不將本發明限制在所述的【具體實施方式】的范圍中。如無特別說明，實施例所用方法和實驗材料均為常規方法和實驗材料。
[0015]實施例1紅色納米砸的生物合成
從保存管中吸取一定量的飼用益生菌地衣芽孢桿菌(Bacillus Licheniformis.)，劃LB瓊脂板，37°C培養過夜，挑取單菌落接種4mL LB液體培養基中，37°C、150 r / min振蕩培養過夜，按1%接種100 mL LB液體培養基中，37°C、150 r / min振蕩培養4h，使0D600值達0.4-0.8，加入終濃度為2 mmol/L經過濾除菌的亞砸酸鈉溶液，37°C、150 r / min振蕩繼續培養24h，地衣芽孢桿菌將亞砸酸鈉還原為紅色單質砸(圖1)。
[0016]實施例2紅色納米砸的生物合成
從保存管中吸取一定量的飼用益生菌地衣芽孢桿菌(Bacillus Licheniformis.)，劃LB瓊脂板，37°C培養過夜，挑取單菌落接種4mL LB液體培養基中，37°C、150 r / min振蕩培養過夜，按1%接種100 mL LB液體培養基中，37°C、150 r / min振蕩培養4h，使0D600值達0.4-0.8，加入終濃度為I mmol/L經過濾除菌的亞砸酸鈉溶液，37°C、100 r / min振蕩繼續培養24h，地衣芽孢桿菌將亞砸酸鈉還原為紅色單質砸。
[0017]實施例3紅色納米砸的生物合成
從保存管中吸取一定量的飼用益生菌地衣芽孢桿菌(Bacillus Licheniformis.)，劃LB瓊脂板，37°C培養過夜，挑取單菌落接種4mL LB液體培養基中，37°C、150 r / min振蕩培養過夜，按1%接種100 mL LB液體培養基中，37°C、150 r / min振蕩培養4h，使0D600值達0.4-0.8，加入終濃度為5 mmol/L經過濾除菌的亞砸酸鈉溶液，37°C、200 r / min振蕩繼續培養48 h，地衣芽孢桿菌將亞砸酸鈉還原為紅色單質砸。
[0018]實施例4紅色納米砸的生物合成
從保存管中吸取一定量的飼用益生菌地衣芽孢桿菌(Bacillus Licheniformis.)，劃LB瓊脂板，37°C培養過夜，挑取單菌落接種4mL LB液體培養基中，37°C、150 r / min振蕩培養過夜，按1%接種100 mL LB液體培養基中，37°C、150 r / min振蕩培養4h，使0D600值達0.4-0.8，加入終濃度為2 mmol/L經過濾除菌的亞砸酸鈉溶液，30°C、150 r / min振蕩繼續培養48h，地衣芽孢桿菌將亞砸酸鈉還原為紅色單質砸。
[0019]實施例5納米砸的提取與純化
收集培養后的菌液，4000 r / min離心15min，棄去上清，沉淀用生理鹽水清洗三次后使用一定量的去離子水重懸，超聲震蕩破碎(100kV，間歇58，301^11)。4000 r / min離心15min，沉淀后用含1% SDS的1.5 mol/L Tris-HCl緩沖液(pH8.3)洗滌3次，取4mL重懸液和2mL仲辛醇于1mL試管中，充分混勾。2000 r / min離心10min，4°C沉淀24h，沉淀依次通過氯仿、乙醇、和無菌水洗滌后于4°C保存備用，按照GB5009.93-2010中的方法測定砸濃度。
[0020]實施例6納米砸的表征觀察
透射電子顯微鏡觀察發現，純化后的紅色納米砸顆粒粒徑基本在50?200 nm，絕在部分處于100 nm以下(圖2)。納米級紅色單質砸具有毒性小，抗氧化和免疫調節活性高，能夠充分被機體吸收等優點。本發明提供的利用飼用益生菌地衣芽孢桿菌還原亞砸酸鹽得到活性單質砸的方法，操作簡便，易于擴大化，在工業上具有廣闊的應用前景。
[0021]實施例7納米砸的抗氧化活性
對合成的紅色納米砸進行DPPH試驗。紫色的DPPH具有自由基，遇到抗氧化劑的時候會變成黃色，在517nm處具有吸收峰，因此常作為抗氧化劑的鑒定指示劑。DPPH自由基清除率的大小可以作為評價抗氧化劑抗氧化能力大小的一個重要指標。將納米砸配制成10個等差濃度，取ImL納米砸與ImL DPPH溶液(溶于無水乙醇，50yg/mL)充分混勻，再加入3mL甲醛充分混合，室溫避光處反應30min以上。同時，配置與納米砸同樣濃度的Na2Se03和Mm式劑(常用抗氧化劑)做對照進行試驗。所有樣品和對照均重復三次。自由基清除率計算公式:
自由基清除率(％)=[l-(Aa-Ab)/Ac] X 100%
Aa:樣品和DPPH混合溶液在517nm處吸光度。
[0022]Ab:樣品在517nm處吸光度。
[0023]Ac:去離子水和DPPH混合液在517nm處的吸光度。
[0024]結果表明，SeNPs與Na2Se03均具有清除自由基的能力，且SeNPs清除自由基的能力高于Na2Se03s清除自由基的能力，這改變了人們傳統上認為砸單質(SeO)無生物活性的認識，這也正是紅色單質砸有別于灰色或黑色等其它一般單質砸的重要特性。
[0025]實施例8納米砸霉菌毒素解毒劑的配制
按重量配比計，依次向反應器內加入IKg納米砸和IKg殼聚糖，并不停攪動，攪動時間1分鐘得納米砸霉菌毒素解毒劑。本納米砸霉菌毒素解毒劑在飼料中建議添加量為I g/t。
[0026]實施例9納米砸霉菌毒素解毒劑的配制
按重量配比計，依次向反應器內加入IKg納米砸和IKg殼聚糖，并不停攪動，攪動時間30分鐘得納米砸霉菌毒素解毒劑。本納米砸霉菌毒素解毒劑在飼料中建議添加量為I g/t。
[0027]實施例10納米砸霉菌毒素解毒劑抗霉菌毒素應用效果
將購買的20周左右蛋雞32只(平均產蛋率維持在95%以上)，隨機分成4組，每組8只蛋雞，第一組為空白對照組，第二組為霉菌毒素DON組，第三組霉菌毒素DON+納米砸霉菌毒素解毒劑組，第四組為納米砸霉菌毒素解毒劑組。試驗期28天，通過體重、產蛋率、血液生化等指標的檢測評估納米砸霉菌毒素解毒劑對霉菌毒素DON的解毒效果。
[0028]應用效果，霉菌毒素DON組的蛋雞在試驗周期內產蛋率、體重和血清總抗氧化能力均顯著(P〈0.05)低于其它三組，說明霉菌毒素DON可顯著引起產蛋雞體重和產蛋率的下降，DON+納米砸霉菌毒素解毒劑組蛋雞的體重、產蛋率和血清總抗氧化能力與正常組無顯著差異，說明添加納米砸霉菌毒素解毒劑可以顯著改善DON造成的蛋雞體重、產蛋量和血清總抗氧化能力下降的情況。DON組非正常蛋比例顯著(P〈0.05)高于其余三組，添加納米砸霉菌毒素解毒劑可以顯著(P〈0.05)降低非正常蛋(血斑蛋、雀斑蛋、軟殼蛋)比例。以上結果證明，本發明制備的納米砸霉菌毒素解毒劑可以有效的吸附霉菌毒素，降低和消除霉菌毒素引起的體重下降、產蛋率降低、非正常蛋增加、總抗氧化能力下降等毒害作用，在抗霉菌毒素毒性作用方面取得非常好的應用效果，具有廣闊的開發應用前景。
【主權項】
1.一種納米砸霉菌毒素解毒劑，其特征是:由納米砸、殼聚糖配比復合制成。2.—種權利要求1所述的納米砸霉菌毒素解毒劑的制備方法，其特征是:步驟如下: (1)在活化的飼用益生菌培養液中加入砸鹽溶液進行培養； (2)收集培養液，超聲破碎洗滌后，即得紅色的納米砸； (3)透射電子顯微鏡觀察納米砸的表征； (4)測定納米砸含量及其抗氧化活性； (5)將納米砸、殼聚糖混合均勻制得納米砸霉菌毒素解毒劑。3.根據權利要求2所述的納米砸霉菌毒素解毒劑的制備方法，其特征是:使用的飼用益生菌為地衣芽孢桿菌。4.根據權利要求2或3所述的納米砸霉菌毒素解毒劑的制備方法，其特征是:使用的砸鹽為亞砸酸鈉或二氧化砸中的任意一種。5.根據權利要求2或3所述的納米砸霉菌毒素解毒劑的制備方法，其特征是:步驟(I)的培養條件為30-37 °C，100-200RPM培養24-48h。6.根據權利要求2或3所述的納米砸霉菌毒素解毒劑的制備方法，其特征是:納米砸與殼聚糖配比為1:0.1-10。7.—種權利要求1所述的納米砸霉菌毒素解毒劑在制備吸附霉菌毒素和消除霉菌毒素毒害制劑中的應用。
【專利摘要】本發明公開了一種納米硒霉菌毒素解毒劑及其制備方法和用途，由納米硒、殼聚糖配比復合制成。本發明利用飼用益生菌制備的納米硒具有抗氧化、免疫調節和抗霉菌毒素等多種功能，功能納米硒的使用可以發送動物機體的免疫功能，強化肝臟解毒功能，緩解霉菌毒素中毒的臨床癥狀；納米硒霉菌毒素解毒劑制備工藝簡單，條件溫和，易于實現規?；a。
【IPC分類】A23L5/20
【公開號】CN105707659
【申請號】CN201610126546
【發明人】繆德年, 屈汶輝, 廖學文, 郭佳宏, 王秀花, 鄒笑天
【申請人】南通海康生物科技有限公司, 上海市農業科學院