本發明屬于青貯飼料技術領域，具體涉及一種專用于狼尾草的青貯添加劑。
背景技術：
狼尾草（chinesepennisetum）為多年生禾本科牧草，具有產量高、耐刈割、適口性好等特點，是草食家畜的優質青飼料。由于其抗旱和耐濕性強，對土壤要求不高，近年來在南方紅壤山地得到了廣泛的推廣和應用。狼尾草的盛產期集中在夏季，在夏季對狼尾草進行青貯有利于狼尾草季節性均衡供應并提高其利用效率。
青貯發酵一般包括、好氧呼吸期、乳酸發酵期及穩定保存期。經青貯發酵后，狼尾草青貯料中所有的生物過程和化學過程幾乎完全停止，從而可使青貯飼料可以長期保存下去。近年來科技工作者對狼尾草的青貯技術開展了大量的研究，主要集中在狼尾草低水分青貯、混合青貯和添加劑青貯等方面。目前，狼尾草青貯應用較多的青貯添加劑是乳酸菌制劑，市場上乳酸菌制劑是通用型的青貯添加劑，所用乳酸菌主要分離自外界環境，這些菌株由于生活環境與狼尾草生長環境相差甚遠，致使乳酸菌在狼尾草青貯料中的適應力不強、生長性能差，導致對狼尾草的青貯效果并不理想，因此篩選出價格便宜并可以改善狼尾草青貯品質的專用青貯添加劑，對狼尾草在南方畜牧業中的高效利用具有重要的意義。
技術實現要素：
本發明的目的在于提供一種專用于狼尾草的青貯添加劑，其不僅能夠抑制狼尾草青貯過程中好氧微生物的生長，縮短青貯的好氧呼吸期，還能夠促進狼尾草自身乳酸菌的快速繁殖，克服添加外源乳酸菌在狼尾草青貯料中的適應力不強、生長性能差的問題，從而顯著改善狼尾草青貯發酵品質的效果。
為實現上述目的，本發明采用如下技術方案：
一種專用于狼尾草的青貯添加劑，其含五味子提取液1.00wt%、黃芪提取液2.00wt%、金銀花提取液1.00wt%。
所述五味子提取液、黃芪提取液、金銀花提取液的制備方法為：將五味子、黃芪或金銀花于60℃烘干至恒重，然后稱取25g，用250ml去離子水浸泡30min后進行煎煮，沸后文火煎煮30min，用孔徑為1mm的4層紗布進行第一次過濾，得到第一次濾液和藥渣；然后在藥渣中加入150ml去離子水，文火煎煮30min后進行第二次過濾，棄掉濾渣；將兩次所得濾液合并后，文火煎煮濃縮至藥液終濃度為1g/ml，經高壓滅菌后置于4℃冰箱保存。
現有研究表明，中草藥對乳酸菌的影響非常復雜，不僅不同種類的中草藥對乳酸菌的影響不同，即使是同一種類的中草藥在不同的濃度對同一菌種的影響也不同。這可能是由于：一、中草藥成分極其復雜，其中的活性物質可能同時存在對乳酸菌的促生長因子和抑制因子，這些因子在不同條件下的相互作用，表現出對乳酸菌生長的不同影響；二、與不同乳酸菌對中草藥的耐受程度有關；三、中草藥的活性成分受不同的浸提方法的影響，從而影響其對微生物的作用效果。
本發明以五味子、黃芪、金銀花為中草藥原料，采用水煎法提取其活性成分，并通過適當配比，制備得到一種復方中草藥型青貯添加劑。該青貯添加劑能在不添加外源乳酸菌的情況下，促進狼尾草自身乳酸菌的快速繁殖，又能抑制青貯過程中好氧微生物的生長，從而能達到顯著改善狼尾草青貯發酵品質的效果。
具體實施方式
為了使本發明所述的內容更加便于理解，下面結合具體實施方式對本發明所述的技術方案做進一步的說明，但是本發明不僅限于此。
1.狼尾草乳酸菌的提取純化：稱取生長旺盛、新鮮的“閩牧6號”狼尾草葉片5g，用剪刀將其剪成長1cm左右的小段，放入50ml的mrs液體培養基中37℃靜止培養72h，然后取mrs發酵液0.5ml接種于9.5ml的mrs液體培養基中，室內厭氧培養。連續培養5代后將ph值高于4.0的菌液淘汰，之后繼續繼代培養，隨時淘汰ph值高于4.0的菌液。經過10代左右的繼代培養，選出一個菌系，其ph值繼代培養值低且穩定。取該菌系0.5ml生長旺盛的菌液，轉入裝有4.5ml無菌水的試管中，充分混勻，然后反復操作稀釋至10-8倍，再取稀釋液0.1ml在含有瓊脂的mrs培養基平板上涂皿，30℃靜止厭氧培養。從平板中選擇典型的菌落在同樣的平板上劃線分離培養，直到得到純的單個菌株，保存備用。
經鑒定，從狼尾草葉片表面分離的該菌株革蘭氏染色為陽性、過氧化氫酶試驗為陰性、硝酸鹽還原試驗為陰性、不液化明膠、不產生硫化氫、無運動性、能在15℃和45℃條件下生長，根據乳酸菌定義（郭本恒,2003），確定為乳桿菌屬。
2.中草藥提取液的制備：將藥材置于60℃干燥箱中烘至恒重，然后稱取25g，用250ml去離子水浸泡30min后進行煎煮，沸后文火煎煮30min，用孔徑為1mm的4層紗布進行第一次過濾，得到第一次濾液和藥渣；然后在藥渣中加入150ml去離子水，文火煎煮30min后進行第二次過濾，棄掉濾渣；將兩次所得濾液合并后，文火煎煮濃縮至25ml，使藥液終濃度為1g/ml，即得。所得中草藥提取液經高壓滅菌后置于4℃冰箱保存備用。
3.中草藥添加劑的組方確定
3.1單因素試驗
以補益類中草藥黃芪、五味子、枸杞、當歸、熟地及清熱解毒類中草藥金銀花、青蒿、瓜蔞、魚腥草、決明子的提取液為添加劑，分別進行單因素試驗，以對狼尾草乳酸菌生長的促進率為指標，研究不同添加劑在不同濃度（0.25%、0.50%、1.00%、1.50%、2.00%）下對狼尾草葉片表面乳酸菌增殖的影響。
其具體操作方法為：從斜面上挑取適量狼尾草乳酸菌菌苔，于mrs平板上劃線活化，倒置于37℃培養箱中培養，至菌體生長。挑取平板上的單菌落，接入mrs液體培養基中，靜置于37℃培養箱中培養至菌液渾濁，用生理鹽水對菌液進行106倍稀釋后，置于磁力攪拌器上攪拌30-40min，得工作菌液。用2×mrs液體培養基將受試藥物進行梯度稀釋，獲得4.00%、3.00%、2.00%、1.00%、0.50%的梯度溶液。在96孔板上加入梯度溶液100μl（以2×mrs液體培養基為對照，藥物濃度為0.00%），并加入100μl的工作菌液，使各藥物終濃度為0.00%、0.25%、0.50%、1.00%、1.50%、2.00%，每個濃度點設5個平行。由于有些中草藥提取液的顏色很深，恐有干擾，故另取一個96孔板，以100μl生理鹽水代替工作菌液，用于對各濃度點的體系進行監控，并對各濃度體系的本底值進行檢測，各設2平行。將96孔板靜置于37℃培養箱中培養48h后，經震蕩混勻，用酶標儀檢測od600值。
將實驗組及對照組的od600值扣除對應濃度點的本底值，即為各濃度點的od600值。以促進率表征中草藥提取液對乳酸菌生長的影響，促進率的計算方法為：促進率（%）＝（實驗組od600/對照組od600－1）×100，所得結果分別見表1、2。單因素試驗數據采用minitab16單因子方差分析，使用tukey法對各組間平均數進行多重比較，結果表示為平均值+標準差。
表1補益類中草藥添加劑對乳酸菌生長的促進率(%)
表2清熱解毒類中草藥添加劑對乳酸菌生長的促進率(%)
結果表明，不同類型的中草藥提取液對狼尾草乳酸菌的作用不同，即使是同一種中草藥提取液在不同濃度下對乳酸菌的作用也不盡相同。
5種補益類中草藥提取液中，各濃度的五味子、黃芪、當歸提取液均表現出對狼尾草乳酸菌體外生長有促進作用，當濃度越大時，黃芪、當歸提取液對乳酸菌的促進作用越強，而五味子提取液則存在一個峰值，達到峰值以后，隨著濃度的提高，對乳酸菌的促進作用反而下降。枸杞提取液對狼尾草乳酸菌體外生長的作用不明顯，低濃度對乳酸菌生長有輕微的促進作用，高濃度對乳酸菌生長有輕微的抑制作用；熟地提取液在各濃度均表現出對狼尾草乳酸菌體外生長的抑制作用，濃度越大抑制作用越強。因此，在試驗設定的濃度范圍內，5種補益類中草藥中，1.00%的五味子提取液對乳酸菌生長的促進作用最強，促進率為15.60%；2.00%的黃芪提取液次之，對乳酸菌生長的促進率為13.88%。
5種清熱解毒類中草藥中，除決明子提取液外，各濃度的中草藥提取液均表現出對狼尾草乳酸菌體外生長的抑制作用，且濃度越大對乳酸菌的抑制作用越強；而決明子提取液則存在一個峰值，達到抑制作用峰值以后，隨著濃度的提高，對乳酸菌的抑制作用反而下降。在添加1.00%濃度時，金銀花提取液對乳酸菌的抑制作用最小，為1.73%。
3.2正交優化試驗
在單因素試驗的基礎上，從補益類中草藥中篩選出促進乳酸菌生長的黃芪、五味子，從清熱解毒類中草藥中篩選出對好氧微生物有抑制作用的金銀花組成復方中草藥型青貯添加劑。采用正交試驗對各組分濃度進行優化。試驗采用三因素三水平5重復的正交設計進行，各因素水平如表3，正交實驗,結果及相關分析依次見表4-6。正交試驗數據的方差分析采用minitab16的一般線性模型，使用tukey法配對比較，檢驗中使用校正的ss。
表3正交試驗因素水平表
表4正交試驗方案及結果
表5對乳酸菌生長的促進率均值響應
表6對乳酸菌生長促進率的方差分析
由表5直觀分析可知，復方中草藥青貯添加劑中各組分對狼尾草乳酸菌體外生長影響的主次順序為黃芪＞金銀花＞五味子，即黃芪提取液為主要影響因素，其次為金銀花提取液，再次為五味子提取液，最佳配方為黃芪3金銀花2五味子2，即五味子、黃芪、金銀花提取液的添加濃度分別為1.00%、2.00%、1.00%。由表6方差分析可知，添加劑中各組分對狼尾草乳酸菌體外生長的促進率有顯著影響。
經驗證試驗測定，按上述最佳配方組成的青貯添加劑對狼尾草乳酸菌生長的促進率為16.51%，優于其他方案。
4.在狼尾草青貯中的使用效果評價
表7狼尾草青貯料發酵品質和營養成分分析
由表7可知，與不添加青貯添加劑的對照組相比，添加本發明青貯添加劑進行狼尾草青貯45天后，青貯料的ph、氨態氮/總氮、ndf、adf均有所降低，粗蛋白含量提高，差異均達到顯著水平(p＜0.05)。證明本發明青貯添加劑的使用可提高狼尾草的青貯品質。
以上所述僅為本發明的較佳實施例，凡依本發明申請專利范圍所做的均等變化與修飾，皆應屬本發明的涵蓋范圍。