專利名稱：生產(chǎn)生物化學產(chǎn)品的方法
本案為DennisD.Pietronigro，JohnL.Sternick，RobertJ.Ruemer及MaryLouMattes所發(fā)明，發(fā)明名稱為檢測生物化學物種的方法及裝置，于1987年10月9日提出申請的共同擁有且共同待審的第107，251號申請案的部分繼續(xù)。
本發(fā)明涉及于極微小體積反應小室內制造化學產(chǎn)品，特別是生物化學產(chǎn)品，尤其是活體狀態(tài)細胞的新穎方法。本發(fā)明也可用來對大量特定化學產(chǎn)品樣品就其對于大量化學產(chǎn)品或化學產(chǎn)品濃度的差異反應進行快速且有效的比較。本發(fā)明又一用途是研究與細胞膜或細胞膜內進行細胞活動相關的細胞性質。
有多種方法可用于在多個反應器內制造包括生物化學產(chǎn)品在內的化學產(chǎn)品。但很少有反應器能夠使產(chǎn)物位于反應器內時可方便地檢測出少量產(chǎn)物，且大部分已知反應器均相當復雜，其他一些則與已知的化學反應器無所差異，某些方法使用了包裹反應物的手段。
Symthe等人在美國第3，479，141號專利申請中描述了一種串連小室加工裝置(但我們相信它未曾用來加工活的，生長與分裂中的細胞或將非生長細胞維持于良好的機械條件下來進行過程評價，或僅加工可利用氣體轉移的化學樣品)。該案中不含無忍受力的交叉污染物的有待分析的化學樣品順著導管而運輸。該專利案中并未提到其中所述的裝置可用作化學反應器或用作透氣性反應器裝置。后來，一篇公開文獻(“高速化學分析的膠囊化學技術”，Cassaday等人，臨床化學，第31卷，第9期，1985年，1453頁)揭示了使用融合技術合并鄰近不同反應物樣品而將該裝置作為反應器。該文獻也提到了對已知的樣品污染無耐受力的分析技術。Cassaday等人的文獻中引用了大量參考文獻，其中包括1.SmithJ，SvenjakD，TurellJ，VlastelicaD.“隨機增加”采樣的創(chuàng)新技術，臨床化學28，1867-1872(1982)。
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5.SnyderLR.AdlerHL.，在連續(xù)-流體分析中以分流通過玻璃管非理想模式。分析化學48，1022-1027(1976)。
6.SnyderLR.在連續(xù)流體分析中樣品分散的預測與控制，自動化分析的進展，ECBarton等人編輯，Mediad公司，塔利鎮(zhèn)，紐約1977年，76-81頁。
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所有這些公開文獻均列于本文的參考文獻。
與上述反應器類別相當無關地，有相當數(shù)量的已知技術是有關制備有用量的例如單克隆抗體的產(chǎn)物的生物化學反應，例如，參考“單克隆抗體原理與實際”J.W.Goding所著一書(第二版，學術出版社，奧蘭多市，佛羅里達州，1986年)。
上述對本發(fā)明背景的論述對了解本發(fā)明來說是必須的。但并不意味申請人相信引述的參考文獻中所揭示的任何技術，或單獨或合并的論述使得人們易知可利用這些技術來解決申請人所面對的問題。
如下所述，申請人將利用可鑒別產(chǎn)品制造上有用的細胞的快速手段來加速生物化學產(chǎn)品的生產(chǎn)。
本發(fā)明的一個目的是提供一種新穎方法，可用于由于某種原因而必須在一系列小室內進行利用氣體的生物化學反應，且隨后小室可于檢測裝置下移動，或至少相對移動。
本發(fā)明的另一個目的是提供一種快速制備樣品的方法，以便于在活細胞及有機體共存之下檢測專一配體-抗配體反應。
本發(fā)明的又一個目的是，提供制備培養(yǎng)樣品的手段，以便快速檢測與收集分泌出來的細胞，例如融合瘤細胞，及其他存在于該樣品內具有特定特性的生物細胞及有機體。
本發(fā)明的還有一個目的是提供一種上述的新穎方法，可能進行功能性氣體轉移進或出反應小室。
本發(fā)明的另一個目的是提供一種用于濃縮由細胞所分泌出來且呈相當濃縮形式的生長因子的裝置。
本發(fā)明的又一個目的是提供一種用于制造有用數(shù)量的融合瘤細胞及由這些細胞所分泌的抗體的改良方法。
本發(fā)明的又一個目的是達到上述目的，同時使每個樣品長期維持合適的條件。
本發(fā)明的還有一個目的是提供一種允許加工培養(yǎng)由細胞快速產(chǎn)生的相當濃度的生物組合物的方法。
本發(fā)明的一個重要的目的是提供一種有助于研究生物化學實體，包括，例如，研案內部細胞活性及研究細胞膜本身及其上特定位置的性質的裝置和方法。
本發(fā)明的其他目的對于本領域的技術人士而言，當閱讀了揭示內容后將變得很明顯。
上述目的大體上可通過下述方法而達到。
對于進行本發(fā)明的方法有用的裝置的基本類型在Smythe等人的美國第3，479.141號專利案中已描述了，該案列入本文以供參考，因為其中對于化學組合物反應小室可被分離且順著試管移動的方式作了概述。Smythe等人在其中發(fā)明背景一節(jié)中談到使用其裝置來運送一系列樣品至試驗裝置中，但未曾提出有關氣體運輸?shù)闹匾曰蚶迷撨\輸以完成本文所述方法的設備。
本發(fā)明方法所用的裝置的管狀導管部分是模仿Smythe等人的裝置，但在很多生物過程中必須采用的下列原理未曾由Smythe等人所認識或利用。
1)載體流體，它覆蓋了管形導管壁，同時在反應小室周圍形成了具有較好透氣性的壁，因此可作為將位于載有樣品的反應小室之間的中間介質流體提供氣體交換或轉移入反應小室內用的方法，該中間介質流體在本文中有時稱為“分離流體”，通常為空氣或由添加補充氣體，例如5%CO2所修飾的空氣。
2)管壁足夠薄以至可將可加速加工的氣體轉移通過其間，因此免除了所有氣體必須順著容納小室的試管內長度方向轉移的需要。
3)導管壁可較佳地充分半透明來允許對反應混合物進行光學檢查。
4)在許多生物化學操作中，例如將生成特定分泌產(chǎn)物，以及對于是否存在有適當分泌細胞有疑問時，業(yè)已發(fā)現(xiàn)提供一種極小的反應小室是極為需要的，這種小室可更快速且有效地鑒別是否存在有所需的分泌產(chǎn)物，因而，可判別是否存在有適合在小室內進一步接受培養(yǎng)的細胞。業(yè)已發(fā)現(xiàn)這種反應小室可小至1微升的幾分之一;盡管本發(fā)明可操作大得很多的樣品。
本文中所用的“液體”是用來說明雖然具有粘性，但可順著管形反應器移動，且基本上不受損害的任何物質。很多種膠體均為合適的“液體”，適合于用作承載細胞的培養(yǎng)組合物，如實施本發(fā)明時，其中最初種子培養(yǎng)要經(jīng)過包裹的微膠囊。
本發(fā)明的大多數(shù)用途中，本發(fā)明的裝置，以及與加工流體接觸的輔助裝置，必須經(jīng)過滅菌以確保細胞承載培養(yǎng)等的安全環(huán)境。
雖然載體流體可以是含氟化學產(chǎn)品等物質，但有助于小室移動的物質也可使用。例如，當使用獨立凝膠型壁來形成小室時，可使用水溶液，這種凝膠型壁包括可將流體包于其中的藻(朊)酸鈉等物質。
此外，必須理解，本揭示內容討論了利用氧氣的方法，然而，我們希期本發(fā)明也包括無氧方法，在該種情況下，分離流體必須為適當?shù)姆茄趸粤黧w，例如氮氣。選用合適的氣體環(huán)境來環(huán)繞加工小室可避免有任何氧氣傳送到小室內。
通常，本發(fā)明的構思是基于可于特定反應小室內極為快速地測知是否存在有合適的分泌細胞。這可使用大量極小的小室與快速評價，例如在檢測裝置中，每小時相對移種過數(shù)百個小室而達到。如此，即使使用極小，甚至次微升小室，在特定小室內即使合適的抗體的生產(chǎn)機率降低，甚至降至極小，但我們仍然能夠獲得很快速的檢測速度，不會有很大量不感興趣的反應液體組分，及在最適當?shù)沫h(huán)境條件下可維持一定量樣品(通過超過1000，典型地超過5000，且經(jīng)常超過20000)共同結合而獲得一種初步檢測及生產(chǎn)所需生物化學產(chǎn)物的最適當方法。
陳述這種優(yōu)點是另一種方式為，雖然分泌產(chǎn)物在特定小室內產(chǎn)生很少，但當在小室內產(chǎn)生時，可以較早地被檢測出來，因為它將以更高，更容易檢測的濃度而存在。
此外，由于使用大量小室，故最初對小室播種的細胞數(shù)目是很低的，典型地低于或等于1個分泌細胞/小室，而不象已有技術常用的10或10個以上細胞/小室。此處的優(yōu)點為所需要的細胞立刻被克隆而無需進行多個費時的亞克隆步驟。
當反應小室是在本文所述的大小及類別的聚合物試管內生成時，有待試驗的生物培養(yǎng)物小室的體積可因為使用載體流體，例如硅酮油或全氟化碳而減少。尺寸小于1微升，實際為約0.2微升或更小。典型地，載體流體的粘度為約25厘沲，且可以商品名GaldenD-25從Ausimont公司(Montedison子公司)及多個其他供應商處而得到。最好選用反應流體以避免任何小室內的蛋白質酶基粘著到管壁上，這一點對于其中必須將氣泡移動通過試管的情況而言尤為重要。
還發(fā)現(xiàn)載體流體可作為“阻塞”試管表面的手段，試管中含有反應小室且包圍于全氟化碳液體覆蓋膜內。這種阻塞中也常用1%的BSA溶液。其他物質也可以使用，但必須不干擾氣體轉移(當需要這種轉移時)。“阻塞”一詞代表在順著試管的反應小室內提供覆蓋膜來避免對物質的交互作用及過度粘著。
分離流體與反應器小室間的載體流體層的特征在于其中有溶解的空氣。常見的溶解度為20-50ml空氣/100ml載體流體。
本發(fā)明的一個主要優(yōu)點為小室內的反應組合物可透過反應器試管的透明或半透明壁而進行光學檢測，例如原地測量表面螢光，而此時反應物仍然保留在可產(chǎn)生有待檢測物質的培養(yǎng)基內。
典型的情況下，反應小室必須被約束在化學惰性管內，較佳地為全氟化碳管(由18號FEP(氟-乙烯聚合物)管所制成，亦即內徑0.042英寸及壁厚0.012英寸)。一種這樣的試管以Zeus商品名，由Zeus工業(yè)產(chǎn)品公司，拉里登市，新澤西州出售。下文所列舉的試管的內徑約0.03-0.04英寸，及壁厚約0.01-0.02英寸。所用的任何試管必須為可滅菌的，無毒，不被水濕潤，且可能(長期反應時)具有足夠透氣性而可用來在試管的內側與富含CO2的空氣外側間至少轉移CO2及O2。不可濕潤的特性可由適當阻塞所提供。
不必使用單晶，無孔隙的試管材料。也使用多孔管，但規(guī)定僅在其適當?shù)睾休d體流體且不會污染樣品時才可使用。污染是否為需要考慮的因素是與特定污染物通過載體流體的活動性及，當然，與小室，加工期間的參數(shù)，特別為時間有關。典型條件下，試管材料對氧的透過性為700cc/100平方英寸-24小時-密耳厚度及對CO2為1670cc/100平方英寸-24時小時-密耳厚度，所有測量均于25℃及大氣壓下進行。
必須了解，管材料的透氣性要求將隨下列因素而有較大的差異，例如反應器小室大小，其中所進行的生物化學反應速度，反應物濃度等。某些情況下，可反應多日而不會有氣體轉移，但發(fā)現(xiàn)用于許多目的時，試管材料為每100平方英寸面積每密耳管厚度每24小時可通過約500cc氧氣及每100平方英寸面積每密耳管厚度每24小時可通過1500ccCO2，這種測量是于溫度(23℃)及壓力14.7磅/平方英寸的標準條件下進行的，載體液體透過性通過是以液體中的“空氣溶解度”來論述的。Fluorinert FC-71可將約20ml空氣溶解于100ml液體中(溫壓標準條件)。具有這種特性的材料顯然完全適合用于本發(fā)明;其他材料可溶解更多空氣且對氣體極為具有透過性;一般而言，當用薄覆蓋膜來阻塞試管且作為載體流體時，在100ml液體中約10ml空氣的“透過度”適合于大多數(shù)令人感興趣的生物化學反應。
這種透過性在典型例中將可使得細胞生長與分裂持續(xù)多日，甚至多周。其中一個典型例子為當反應器維持于37℃在5%CO2/95%空氣的環(huán)境中經(jīng)歷約1周時，2.5微升反應器小室內最初所含的10個融合瘤細胞(舉例)將可于37℃維持且分裂，經(jīng)歷1周時間。
必須注意，小室形狀必須為球形，或甚至更佳者為順著來自檢測裝置的較佳光束方向，亦即沿試管軸垂直的方向略為延長。這種形狀及取向是需要的，因為它可使樣品沿著光束方向濃度更高，從而采用諸如該領域已知的表面反射光不檢測技術來檢測。這種條件對于極小的小室，例如體積小于1微升，特別是小于0.5微升，且有待檢測的物料首先以極小量出現(xiàn)時特別佳。
反應小室于管形反應器內合并，這是該領域已知的一個特性，它使得反應物共同生成一個單一的反應小室，特別可用于本發(fā)明的生物化學方法中。即使當各小室最初含有從同一培養(yǎng)基所取得且顯然具有相同的最初組成的反應混合物時也是如此。然而，事實上，當使用超小室時，通常在一個小室內有一種類型的細胞不會出現(xiàn)在鄰近小室內;如此，在下列條件下，其中(1)具有所需要特性的抗體出現(xiàn)在一個最初小室(如此表明至少存在一個所需要的分泌的細胞，但更可能有這種所需要的細胞的繁殖);及其中(2)鄰近小室并未指出存在有該細胞時，可將鄰近小室合并來對具有適當分泌的細胞的反應器小室內的物質提供附加營養(yǎng)。當然，在許多用途中，例如在克隆用途中，鄰近小室必須不含干擾性細胞物質。
此外，可使用合并小室來添加附加化學試劑，例如，會影響細胞生長，分裂或具有細胞生物化學性質的那些。若干化學試劑為生長抑制劑，生長因子，及對細胞表面受體具有特異性的藥物或化學產(chǎn)品。同時，也可將其他類型細胞加入含有第一類型細胞的培養(yǎng)基中來研究細胞毒性或其他效應，例如一種類型的細胞受到第二種類型的細胞存在時，對其生長及分化的影響。
當進行該方法用于玻璃管內生長多克隆(或單克隆)分泌的融合瘤細胞時，細胞產(chǎn)率極低。這種條件可使用經(jīng)過調整的培養(yǎng)基而略為改善。然而，當使用透氣管及載體流體時，即使使用未經(jīng)調整的培養(yǎng)基也至少可達到更大幅度的細胞生長。
必須了解，裝置的透氣特性在本文所述的短期使用方法中可能不必要;事實上，甚至玻璃也可用作試管，在無需補充氣體或依賴氣體通過反應器軸向轉移但不具有前述的問題的情況下可使用。
“調整介質”一詞代表已經(jīng)被用于在初步方法中生長細胞，特別為融合瘤或骨髓瘤細胞的培養(yǎng)基。然后將該培養(yǎng)基離心而從其中除去固體物質。然后它可用作“經(jīng)調整的”培養(yǎng)基。由于在最初過程中調整的結果，細胞含有一種或多種附加生長促進因子，例如B-細胞生長因子。顯然，可使用經(jīng)過調整的培養(yǎng)基，但使用未經(jīng)調整的培養(yǎng)基并獲得極為良好的結果是該方法的一個特殊優(yōu)點。
用來生產(chǎn)多克隆或單克隆抗體的典型培養(yǎng)基制備時間為10-30日。與檢測設備，及特定培養(yǎng)基是否有導致小室粘連的傾向有關，較佳的是將小室順著試管移動，但其時間相當短，例如至多約20小時等，當然，在較佳實例中，需要將小室維持穩(wěn)定經(jīng)歷一持續(xù)時間，例如數(shù)小時或更多時，即使只需要縮短試管長度時也是如此。
小室內含蛋白質物質，若靜止不動經(jīng)歷一段時間，容易粘著于試管上，而無論是否存在有載體流體皆如此。有多種溶液可免除這種不便，其中之一是維持細胞如上述而移動，但有短時間停止。另一種是選用相當輕質的載體流體，例如填有微汽球例如如玻璃微汽球，且較好為次微米大小的載體流體。這樣可形成低載體流體有效密度的方法。這種微汽球當包含于培養(yǎng)基小室內時，也可用作玻璃珠來形成漂浮片。
通過將管形反應器安裝于以每分鐘一轉的緩慢速度或甚至更慢的速度旋轉的表面上，則可使載體流體的選擇范圍更寬，只要重力不會使得分離培養(yǎng)基相對于反應小室漂上來或沉下去即可。
本發(fā)明方法特別適用于在試管內加工活的分裂中的細胞。但是，加工在試管內不會繁殖的白血球，原發(fā)肝細胞等細胞也是本發(fā)明的一個優(yōu)點，因為其機械作用溫和，因此在檢測之前可于在加工期間保存該細胞;舉例來說，人們希望研究溫度，時間，氣壓等函數(shù)對于這種細胞的若干特性的影響。這種情況下，本發(fā)明的裝置對于在各個不同小室內，加工處理大量細胞樣品特別有價值。
同時，本發(fā)明也可用于其中需要試驗在小室內的反應物對氣體環(huán)境的反應的多種反應中;如此，例如，可研究氧氣對自由基團的影響，例如亞德里亞霉素(adriamycin)基團對四唑鹽的電子轉移的影響。同時，我們也希望研究就氣體介質或熱環(huán)境而言，線粒體(mytochondrin)內的電子運輸。這種情況下，當通過試管及通過檢測器之下被運送時，分析樣品可以被加工。于其中進行反應的氣體環(huán)境可隨時改變，可利用任何適當?shù)臋z測或分析來對該現(xiàn)象進行研究。
當然，試管通常是包圍在其中含有適合研究的環(huán)境的外殼內，因而提供了一種可于試管內獲得適當熱環(huán)境或化學環(huán)境的方式。
有多種方法，其中當試管內負載有小室之后，則無需順著試管移動。這樣，可能希望將不同的生長因子加入不同的細胞小室(選擇其中有同種細胞)以便評價對細胞行為的影響。這只是一種分析方法，其中管形導管(小室仍然放置于其中)可被廢除，因為相當常見，一旦進行分析之后，則無需保留分析材料供進一步使用。事實上，本發(fā)明的一大優(yōu)點是于任何細胞族群進行特定方法之期間將其維持于相容之環(huán)境中。
其他類型研究細胞的方法中有細胞毒性檢定法，其中不同種及/或不同數(shù)量的藥物(或毒素)可放置于試管內的不同小室內，且經(jīng)過一段適當時間之后，可研究不同細胞的影響。使用本發(fā)明也有助于確定人體白血球抗原(HLA)-的類型。將具有不同HLA亞型的各種活性抗血清放置于不同小室內(其中含有相同細胞)。在小室內殺死細胞代表所評價的細胞是對于小室內所含的特定抗血清敏感的。可利用螢光手段或該領域已知的任何其他檢測手段來測定細胞的死亡。
例如對是否存在有特定藥物而評價時，測定細胞死亡的一種方法是利用一種稱為二乙酸羧基螢光(CFD)的物質。僅有活細胞可切斷二乙酸根而發(fā)出螢光。如此，可用CFD將腫瘤細胞進行標記，然后加工，且播種于具有感興趣藥物的培養(yǎng)基內。所有細胞將顯示螢光，但僅有被殺死的細胞允許螢光標記從細胞中露出來，在培養(yǎng)基內變稀，且喪失螢光特性，如此可藉螢光裝置檢測活細胞。
利用本發(fā)明有助于進行細胞內研究，例如，當我們希望測量細胞內的pH，或游離鈣，或特定酶時。pH的測量可使用適宜的pH感性染料，例如螢光物料BCEF(圣地牙哥Calbio化學公司提供)，于細胞內進行，且經(jīng)歷一段適當時間后，將細胞放置于有待評價的物理或化學條件下，可以光學方式評價染料的數(shù)量或色料來指示pH。相似地，可使用FURA-2(奧勒岡州，接頭城，分子探針公司所提供)作標記來研究細胞內環(huán)境的游離鈣。
Ortho診斷劑公司所提供的細胞表面標記也可用來研究細胞膜參數(shù)。
必須指出上述分析技術不僅代表本發(fā)明的一部分，因為這種技術在已有技術中已為人們所知，實例中說明了本發(fā)明的裝置與方法可優(yōu)異地利用的類型，甚至當事實上無需真正回收或收獲細胞產(chǎn)物時也如此。
可測定細胞酶狀態(tài)，例如酸性β-半乳糖苷酶可使用產(chǎn)生螢光的基質螢光素二-β-d-半乳糖哌喃糖苷(細胞學測量，第7期，483-486頁，1986年)來測定。
當然，并非根據(jù)本發(fā)明的純生物化學方法也可進行多種其他費時且無法預測的方法。例如，可小心監(jiān)視所產(chǎn)生的緩慢形成的無機或有機晶體的生長，或其他化學物質的產(chǎn)生。各小室的化學組成可略有不同，因此，例如，可發(fā)現(xiàn)各種催化劑含量的影響。當反應小室極小時，透明壁將可原地進行大多數(shù)光學測量，這是本方法的一個特殊優(yōu)點。發(fā)粘或小室“跳躍”現(xiàn)象通常不存在于這類應用中，因為其不含蛋白質物質。裝置的透氣性有助于對任一種反應選用環(huán)境或研究在一系列氣體環(huán)境下的反應。
簡而言之，本發(fā)明方法是以產(chǎn)生抗體配合基來指示反應小室內存在有所分泌的細胞而加以說明，如此涉及使用單一反配合基，亦即特別可用來檢測該種將產(chǎn)生的抗體的配合基者。
本發(fā)明中描述了本發(fā)明的較佳實施例，且提出了其多種變化例及修改例，但必須理解，這些范例并非將本發(fā)明局限于此，在本發(fā)明的范圍內可作出其他變化及修改。本文所提出的實例的目的是使得該領域的技術人員能更好地理解本發(fā)明及其原理，且可通過對多種不同形式，這些形式分別可能適合于各特例來修改及具體表現(xiàn)本發(fā)明。


圖1為示意圖，顯示了在塑膠管(圖7中顯示得最清楚)內分隔在小室內的含有混成瘤細胞組成的液態(tài)生物培養(yǎng)物。
圖2列舉了當所說的細胞表現(xiàn)出抗體后，如圖1中所示的相同培養(yǎng)物。
圖3指出了抗體及螢光探針二者與磁珠結合后的同一培養(yǎng)物。
圖4、5及6顯示了位于小室側方被拉入不透明貼布內的磁性物質。
圖7列舉了可供操作一系列生物化學組成的典型試管加工裝置的示意圖。
圖8是管形反應器旋轉的示意圖。
圖9是有利的小室形狀的示意圖，其中在加工期間需要對反應小室進行光學檢測時，可在其中最為有利地進行本發(fā)明的方法。
如下實施例與圖1至圖6一起列舉了可供檢測組織培養(yǎng)基內是否存在有融合瘤細胞所分泌的抗體的原地均相檢定法。反應器小室的管性配置類似Smythe等人于美國第3，491，141號專利及在本發(fā)明圖7中所用的。使用前必須對試管及全氟化碳載體流體進行適當消毒。
實施例1本檢定法顯示了大小超過100，000道爾頓的抗體的測定。
由圖1可見，直徑1.75微米且由Seragen公司所提供的聚苯乙烯磁珠20經(jīng)吸附山羊抗小鼠(GAM)Ig G抗體(得自Zymed公司的重鏈與輕鏈類型)而被覆蓋。使用牛血清蛋白(BSA)來阻塞磁珠上的任何其他反應性位置。磁珠20可作為將與磁珠結合的探針的酶基，且最終被拉入不透明貼布內。磁珠分散于一系列容納于試管內的反應器小室例如22內，其中含有組織培養(yǎng)基24;同時也分散于小室22的是所謂的標記化學產(chǎn)品或探針26，它是FITC-標記的山羊抗小鼠多克隆抗體，也是從Zymed公司而得到的，及若干預先選用的融合瘤細胞28(55.2可產(chǎn)生Ig G2a的融合瘤細胞)。使用前，將細胞用Hanks平衡鹽溶液約洗4次以去掉任何游離抗體。準備含有非分泌的653小鼠骨髓瘤細胞作陰性對照或Ig G2a小鼠骨髓瘤蛋白質(ICN公司產(chǎn)品)作陽性抗體對照的其他反應器小室。試管52被容納于其中含有適合維持所需大氣壓的氣體大氣壓的外殼21內。
圖2指出了一種新情況，其中隨著時間的增加，抗體30至少從若干細胞28，亦即從分泌細胞中分泌出來。
磁珠20通過它們的山羊抗小鼠抗體覆蓋層(可稱為MB/GAM)而與新近分泌出的抗體30(可稱為Ab)結合，如同“探針”FITC-標記的山羊抗小鼠多克隆抗體26(可稱為GAM)一樣，所生成的復合體的化學式組成32示于圖3中，使用上述術語MB/GAM-Ab-FITC/GAM探針-抗體26由于上方具有小鼠抗體，故與磁珠結合，圖3中，“B”為磁珠，分泌抗體與探針的結合“組合物”。
從圖4至6可見磁針40(大小約1×1.4×7cm的千高斯磁針)用來將載有磁性粒子的物料拉至小室22周圍小面積上，因而可于如圖6所見的貼布42中提供基本上不透明的磁珠群。
如該領域已知的，與經(jīng)過適當配合的刺激光線相應的發(fā)射出的螢光量必須與細胞28所分泌的抗體量有直接關系，此抗體連接到MB/GAM與FITC/GAM二者上而生成MB/GAM-Ab-FITC/GAM物質。當然，若有任何未連接于抗體上的磁性物質，也將包含于磁性貼布42內，而不會產(chǎn)生螢光。
圖7為典型的依次加工程序的示意圖，一般來說，利用一種已知方法，其中有待進行分析的體積約0.3微升的小室22通過利用氣泡50所隔開的聚四氟乙烯管52而移動。液體物質為一種全氟化碳液體組合物，且以氟林內FC-77的商品名由3M公司出售，可提供一種加速分離的手段，同時也有助于小室順著反應管52內壁作潤滑性漸進移動。試管52構成可使得足夠的營養(yǎng)氣體及CO2滲透通過其間的裝置。小室間的氣體或氣泡構成可運送氣體通過氟林內載體相60的附加表面，載體相環(huán)繞氣泡及含生物培養(yǎng)物的小室二者。其臨床過程如下各小室內含有典型濃度約為1.12×108個珠/毫升的經(jīng)過處理的磁珠。磁珠的濃度還可低很多。探針以375ng FITC/GAM/ml的濃度加入。小室內最初放置4至250個融合瘤或非分泌的骨髓瘤細胞。ICN公司所提供的Ig G2a小鼠骨髓瘤蛋白質也可與磁珠及磁性探針結合而用作陽性對照，以37.5ng/ml的濃度放置于另一反應器內。
試管內部最初被覆蓋以載體流體，亦即以商品名氟林內FC-71出售的一種經(jīng)過滅菌的組合物，此種組合物用來濕潤試管，具有透氣性且必然具有適當透明度而可作光學檢定，使用分支管及注射器泵送系統(tǒng)將反應混合物從不同凹槽內抽吸入Teflon試管內，因而于試管內生成反應器小室;也將足量FC-77泵達入試管內，這樣，它就形成了環(huán)繞生物培養(yǎng)基，亦即反應混合物的小室的障礙物層。如該領域所已知的，將空氣引入試管內來隔開鄰近小室，然后將試管內的小室放置于37℃及5%CO2-95%空氣環(huán)境的培養(yǎng)器內，經(jīng)歷24小時。此時將磁珠拉入不透明貼布內且測定貼布螢光來指示是否存在有所需的配合基。
必須理解，根據(jù)加工機的優(yōu)先順序，當檢測到小室內存在有適當分泌的細胞的有用生物化學指示時，可立刻接著將小室抽吸到出口而回收所需的小室，且由其中分離出細胞，例如從試管內切出該小室，或使用微注射器抽吸出來，或在適當條件下，使得該小室移動通過試管至出口。此外，可采用該領域已知的程序將鄰近的小室融合成為所需的小室。此種取代之道構成了一種可將附加營養(yǎng)帶到所需小室內有用化學產(chǎn)品中的手段;必須注意，當進行融合時，也經(jīng)常可方便地將融合物質移入大直徑管內，因此可維持相對于融合得到的較大小室體積來說，較佳的氣體轉移面積。
所有來自含有分泌的細胞或Ig G2a的凹槽的反應物皆呈陽性螢光，不含分泌的細胞或培養(yǎng)基的小室則呈陰性。
圖8顯示了反應器管52環(huán)繞軸A-A旋轉，以避免固體組分在反應小室內過度漂浮或沉降。通常除非反應小室將靜置數(shù)小時而非通過試管緩慢移動，否則無需進行此種旋轉。
圖9為示意圖，顯示了在塑膠管93內由氣泡92所分隔開的近球形小室91，試管內具有全氟化碳液體94，有助于小室及氣泡的分隔，且有助于氣泡的移動，特別是小室順著試管93而移動。
本發(fā)明的貼布抽拉是由一位共同工作者所發(fā)現(xiàn)的，特別有價值且可用于即使不含標記的貼布凝聚(例如在前面實例中抽拉入螢光貼布內的一般類型)。可利用目視，通常借助于顯微鏡，以例如放大100-200倍而無需借助于標記即可檢測。此種情況下，以使用磁性粒子來進行為最佳，這是基于兩種樣品間質地的差異。由于抗體所獲得的物質(例如前面實例的MB/GAM-Ab-FITC/GAM)的外觀比磁珠尚未與感興趣物質復合之前更稠密，更結實。其中一例為前例中的BM/GAM狀態(tài)。此種程序雖然比標記程序不敏感，但最終證實為簡化本發(fā)明方法的一種較佳方式。
必須理解，下面的權利要求用于覆蓋本發(fā)明所描述的所有本發(fā)明的一般與特定特征，本發(fā)明范圍內的所有描述均將落入所說的范圍內。
權利要求
1.一種在細胞培養(yǎng)基內促進生物化學產(chǎn)物生長與生產(chǎn)的方法，其特征在于該方法包括下列各步驟(a)將一系列細胞培養(yǎng)基樣品以隔開的反應小室形式順著試管放置；(b)使用透氣性載體流體處理管壁；(c)使用中間分隔流體來維持所說的反應小室在試管內分隔開；(d)在細胞培養(yǎng)基小室與分隔流體中間形成載體流體的透氣性障礙物層；(e)培育該一系列細胞培養(yǎng)基且檢查介質來檢測是否存在含有所需生物化學產(chǎn)物的經(jīng)過培育的小室；及(f)至少從若干隔開的反應小室內回收所需的生物化學產(chǎn)物。
2.如權利要求1所述的方法，其特征在于所述的小室在培育步驟中是順著試管而移動的。
3.如權利要求2所述的方法，其特征在于該培養(yǎng)基及回收的生物化學產(chǎn)物各自包括活體細胞。
4.如權利要求1所述的方法，其特征在于它包括將少于約10微升(體積)的細胞培養(yǎng)基放置于反應小室內的步驟。
5.如權利要求2所述的方法，其特征在于反應器小室的大小，小室的大小及形狀，及載體流體的厚度經(jīng)過選擇以在分隔流體與反應器小室間提供足夠的O2及CO2氣體交換來增加細胞的生長比例。
6.如權利要求4所述的方法，其特征在于該管壁足夠薄而可使得氣體通過管壁進入管內，且以可有效促進細胞生長的數(shù)量透過載體流體。
7.如權利要求1所述的方法，其特征在于該液體組合物包括至少一種分泌的細胞及其中所說的回收步驟包括回收分泌的細胞。
8.如權利要求1，2，3，4，5，6或7中所述的方法，其特征在于該方法使用包括未經(jīng)調整的培養(yǎng)基來進行細胞培養(yǎng)。
9.如權利要求1，2，3，4，5，6或7中所述的方法，其特征在于該反應小室的體積小于1微升。
10.如權利要求1所述的方法，其特征在于該試管是透明的且包括當試管相對于光學評價裝置移動時，透過管壁對小室作光學評價的附加步驟。
11.如權利要求1，2，3，7或10所述的方法，其特征在于該反應小室順著管軸方向并未延長。
12.如權利要求1或7所述的方法，其特征在于它包括下述步驟于第1反應器小室內檢測出指示具有適當融合瘤細胞的抗體，且將第1小室內的物質與不含細胞質的至少另一小室融合來促進該適宜的融合瘤細胞具有改良的附加生成速率及促進該細胞分泌抗體的改良速率。
13.如權利要求9所述的方法，其特征在于所述小室的最大體積為0.5微升。
14.如權利要求1，2，3，4，5，7，10或13所述的方法，其特征在于有大量小室各自包括從同一來源組合物中取得的液體。
15.一種在細胞培養(yǎng)基內促進生物化學產(chǎn)物生長的方法，其特征在于該方法包括下列各步驟(a)將一系列細胞培養(yǎng)基以分隔開的反應小室形式順著試管放置;(b)使用載體流體處理管壁作為加速小室順著試管移動的手段;(c)使用中間分隔流體將試管內的反應小室分隔開;(d)培育試管內的培養(yǎng)基;及(e)在導管末端回收至少若干互相隔開的反應小室內的生物化學產(chǎn)物。
16.一種評價氣體及熱環(huán)境對化學反應影響的方法，其特征在于該方法包括下列各步驟(a)將一系列含有化學反應產(chǎn)物的反應介質放置于透氣管中的一系列互相隔開的反應小室內;(b)將該試管依次維持在預先決定了溫度及氣體組成的多個不同環(huán)境內;(c)使用透氣性載體流體來處理管壁作為加速小室順著試管移動的手段;及(d)觀察該環(huán)境對該化學反應的影響。
17.培育培養(yǎng)物用的裝置，其特征在于該裝置包括(1)其中維持有可促進細胞生長的氣體環(huán)境的外殼;(2)于該外殼內的試管，管壁為透氣性的，允許氣體穿透管壁進入試管內;及(3)順著管壁的透氣性載體流體也形成允許氣體滲透通過其間的手段。
18.如權利要求17所述的裝置，其特征在于在試管內還包括一系列由透氣性載體流體所形成的包圍樣品的壁。
19.一種促進和分析細胞培養(yǎng)基內變化的方法，其特征在于該方法包括下列各步驟(a)將該培養(yǎng)基順著試管放置于試管內一系列互相隔開的反應小室內;(b)使用透氣性載體流體處理管壁;(c)使用中間分隔流體而保持反應小室在試管內互相隔開;(d)在小室與分隔流體之間形成由載體流體所構成的透氣性障礙物層;(e)培育該系列細胞培養(yǎng)基;及(f)檢查介質來檢測該細胞內的生物化學組分情況。
20.如權利要求19所述的方法，其特征在于所述的小室的大小小于1微升。
21.如權利要求1，2，3，或6所述的裝置，其特征在于所述的小室是由聚合材料所形成的，它形成了可包裹小室液體的手段。
全文摘要
本方法利用多個含有培養(yǎng)基的小體積小室，各小室可包圍于試管，較好為透明試管內，且于試管內借助于透氣性載體流體而隔開，于特定小室內，流體順著試管移動至檢測站；若發(fā)現(xiàn)特定小室內的流體含有可供進一步加工的所需組分，則可分離出來進行加工。該方法用于單克隆抗體的生產(chǎn)以及在反應小室需要氣體轉移的應用中特別有用。然而，本發(fā)明也有助于在細胞內研究，諸如pH及鈣含量，及細胞膜上各位置。
文檔編號C12M1/34GK1048062SQ8910400
公開日1990年12月26日 申請日期1989年6月13日 優(yōu)先權日1988年2月10日
發(fā)明者丹尼斯·D·皮爾特洛尼格, 羅伯特·J·路馬, 約翰·L·史坦尼克 申請人:奈吉尼股份有限公司