專利名稱：平頦海蛇短鏈神經毒素以及編碼該毒素的基因的制作方法
技術領域：
本發明涉及平頦海蛇短鏈神經毒素以及編碼該毒素的基因。
蛇神經毒素廣泛存在于眼鏡蛇科和海蛇科，是蛇毒蛋白的重要組成成分。根據其作用靶位點不同，蛇神經毒素可被分為兩大類型，即突觸前神經毒素和突出觸后神經毒素(Singh，B.R.，Tu，A.T.Overview of snake venom，InNatural Toxin 2Structure，Mechemism of Action and Detection.NewYorkPlenum Press，1996，39137-62)。突觸前神經毒素抑制乙酰膽堿從突觸前運動神經末梢的釋放，而突觸后神經毒素特異性地結合于脊椎動動物肌肉突觸后膜運動終板或魚類發電器官中的煙堿胺型乙酰膽堿受體而阻斷神經傳導，影響肌肉細胞運動終板與煙酰胺型乙酰膽堿結合有關的生理過程(Toru，T.，Satoshi，O.，Eisaku，N.，et al.Complete nucleotide sequencesof cDNAs encoding long chain α-neurotoxins from sea krait，Laticaudasemifasciata.Toxicon.1999，37181-185；覃公平主編，中國毒蛇學，第2版，1998，廣西，廣西科學技術出版社，372-385)。突觸后神經毒素根據分子量大小和二硫鍵數目可以分為短鏈神經毒素和長鏈神經毒素兩種類型。短鏈神經毒素有60-62個氨基酸殘基構成，含4對鏈內二硫鍵；長鏈神經毒素則由66-79個氨基酸殘基構成，含五對鏈內二硫鍵，兩類神經毒素都具有一個共同的三指環結構(Louis，W.C.，Robert，S.D.，Handbook ofNeurotoxicolohy，New YorkMarcel Dekker Inc，1995，637-665.)。
突觸后神經毒素所引起的神經毒癥狀的主要臨床特點是——動物在1小時或更短的時間內產生松弛性的肌肉麻痹，四肢行動緩慢，接著是呼吸困難，最后經過窒息性驚厥死亡。通過人工呼吸可以延遲動物的死亡，有些甚至能因此而得救。
突觸后神經毒素在生物學和醫學領域中應用廣泛，特別是在分子生物學分子藥理學中尤為重要。蛇神經毒素可以制成鎮痛劑，用于風濕性關節痛、三叉神經痛、坐骨神經痛、肋間神經痛、晚期癌腫痛和麻風神經痛等，止痛作用快，效果好，連續用藥不會產生耐藥性，無成癮性，用藥劑量少，一般沒有嚴重的毒副作用。其中，對晚期癌腫痛治療的研究有著很重要的意義(陳汝筑，等眼鏡蛇神經毒素的鎮痛作用，中國藥理學通報，1998，4(2)113-117；郝文學，陳遠聰主編，蛇毒的生化、毒理和應用，北京科學出版社，1980，109-115)。此外突觸后神經毒素因為能與煙酰胺型乙酰膽堿受體結合，親和力高，且有特異性，故可用于研究神經受體。具體表現在作為檢測煙酰胺型乙酰膽堿受體的標記物；用于煙酰胺乙酰膽堿受體的純化；作為研究藥物與受體相互作用的工具；作為研究煙酰胺乙酰膽堿受體結構與性質的工具。另外，在重癥肌無力疾病研究中，突觸后神經毒素也有相當大的作用。重癥肌無力的臨床特征主要是橫紋肌稍有活動即容易疲乏無力，是自體免疫破壞煙酰胺乙酰膽堿受體引起的。目前，有人用放射性碘標記神經毒素和煙酰胺乙酰膽堿受體的方法來測病人血清中的乙酰膽堿受體的抗體含量，從而對重癥肌無力進行診斷。也有人用短鏈神經毒素分離提純出煙酰胺乙酰膽堿受體亞單位，制備抗受體亞單位的單克隆抗體，進一步研究重癥肌無力的發病機制。并著手于動物試用單克隆抗體來中和乙酰膽堿受體的抗體，以探討新的治療途徑(覃公平主編，中國毒蛇學，第2版，1998，廣西，廣西科學技術出版社，495-497)。
目前蛇神經毒素主要采取生化提取方法從蛇毒中獲得，成本高、純度低，所以利用基因工程方法生產蛇神經毒素具有明顯發展優勢。從1995年非洲眼鏡蛇(Dendroaspis angusticeps)毒素基因的克隆與表達開始(Leonard，A.S.，Mark，A.O.，Pierre，J.L.，et al.Cloning and expression of mambatoxins.Toxicon，1995，33(4)439-474)，關于用生物工程方法生產蛇神經毒素和其它毒素多肽的報道不斷出現(Fatemeh，A.，Arunmozhiarasi，A.，Nget，H.T.，et al.Four new postsynaptic neurotoxins fromNaja Naja Sputatrix venomcDNA cloning，protein expression，andphylogenetic analysis.Toxincon.1998，36(12)1871-1885；Nanling，G.，Arunmozhiarasi，A.and Kandiah，J.Postsynaptic short-chain neurotions fromPseudomaja textilis cDNA cloning，expression and proteincharacterization.Eur.J.Biochem.1999，265982-989)。
海蛇廣泛地分布于印度洋和太平洋的較溫暖流域，其中大部分生存在南亞及東印度洋海岸。它們可通過平的、槳狀的尾部得以辨認。海蛇中除了Emydocephalus annulatus外，均有很高的毒性，且比陸地蛇毒性高得多。但在毒素組成上，海蛇又比陸地蛇簡單很多(ChikahisaTakasaki，1998，The Toxinology of Sea Snake Venoms，J.Toxicol.-ToxinReviews，17(3)，361-372；)。蛇毒神經毒素是海蛇毒液中毒性最強的成分，它使動物產生弛緩性麻痹和呼吸衰竭，從而導致動物死亡。國內外對海蛇毒素的研究報道要比陸地蛇少得多，而且大多只停留在蛋白質水平，從事海蛇毒素基因的研究報道并不多。到目前為止Genbank中發表的海蛇毒素氨基酸序列約有100余種，而海蛇毒素編碼基因序列發表還不到50個。
由于海蛇毒的毒性強烈，排毒量甚微，難以采集到足夠的毒液量，因此，給分離提純海蛇毒的組分，研究毒素和酶分子的特性和結構，以及在科學研究和實際應用等各方面帶來一定的困難(宋杰軍，毛慶武主編，海洋生物毒素學，北京，北京科學技術出版社，1996，337-354)。
隨著天然毒素研究的迅速發展，利用天然毒素具有高度專一生物活性而進行的臨床應用已十分廣泛，蛇毒在毒素應用的領域占有顯著地位。科學家們將天然生物活性物質作為尋找新藥的重要向導，蛇毒的利用已引起了藥理、藥物、生化及醫學工作者們的重視，在其臨床應用研究方面也得到了迅速發展。神經毒素主要存在于海蛇科和眼鏡蛇科，蛇神經毒素鎮痛的研究已有很長的歷史，最早發表的這類論文的是Macht(1936)。Steinbrocker1940年用眼鏡蛇毒素治療65例關節炎和神經痛病人，其有效率為59％。Hynson、Westco和Dunning公司用蛇毒制成兩種鎮痛藥Cobroxin和Nyloxin。前者是神經毒素，每安瓿為1.0ml，含量50x106IU，用于治療各種頑固性疼痛和惡性腫瘤疼痛；后者為含有神經毒素3.3x106IU，加入1.5ml硅酸和3.3ml甲酸的生理鹽水溶液，專門用于治療關節痛。這兩種藥物已列入美國藥物局方中。1975年中國科學院昆明動物研究所等單位，利用眼鏡蛇毒素研制成功眼鏡蛇神經毒素注射液，此藥現已由廣西梧州市制藥廠批量生產，商品名稱為“克痛寧注射液”。該注射液是一種新型的鎮痛劑，止痛作用快，效果好，連續用藥不會產生耐藥性，也不會成癮，用藥劑量小，一般沒有嚴重的副作用，可用于風濕關節痛、三叉神經痛、坐骨神經痛、肋間神經痛、晚期癌腫痛和麻風神經痛等。但該藥僅供肌注，且注射部位起硬結，給藥3天至5天后才起作用。中國人民解放軍蛇毒臨床應用研究中心用近代技術將眼鏡蛇毒神經毒素分離純化制備新型鎮痛針劑“新克痛寧”，靜脈給藥或肌注立即其作用。國內外應用眼鏡蛇神經毒素緩解惡性腫瘤疼痛、各種神經痛、關節痛已有60多年的歷史(中國藥理學通報1988年第4卷第2期眼鏡蛇神經毒素的鎮痛作用，陳汝筑吳秀榮)，國內眾多的醫院采用肌注、靜脈注射等給藥方式將其用于臨床治療，給藥劑量為小鼠半致死量的1/2500，{每日給藥一次，每次1--2支，個別每日兩次，每次一支。急性疼痛病例、疼痛消失即停藥，慢性痛則再鞏固用藥3--5次，20d為一療程，必要時重復(克痛寧用藥，每支2ml，含神經毒素70ug)}，安全可靠(蛇志1999年第11卷第1期新克痛寧術后鎮痛效果觀察王興業/吉林省四平市207醫院王鳳學/沈陽軍區總醫院；蛇志1998年第10卷第3期克痛寧配合中藥治療坐骨神經痛182例分析高忠恩/江蘇省蘇州市中醫院；生化藥物新技術應用研討會論文集1996中國生化藥物雜志克痛寧及其復方臨床鎮痛效果比較觀察 曹宜生 程寶全 趙光懷等/廣州軍區后勤部軍事醫學研究所/廣州市第六人民醫院)。蛇神經毒素因其性質也可用于戒毒，臨床上用口服方式達到了良好的治療效果(戒斷醫學 蛇毒膠囊治療海洛因成癮臨床療效觀察 昆明醫學院藥物依賴性研究治療中心 揚良 李紅 吳亞維等)。
蛇神經毒素之間氨基酸的同源性很高。目前應用的神經毒素的來源都是從蛇毒中進行生化提取，在純度和成本方面都存在著較大的缺陷，純度不夠會導致醫療事故，采用基因工程技術生產的蛇神經毒素不但解決目前存在的問題，而且與天然蛇神經毒素具有相同的藥效，有著更大的發展潛力。
本發明的目的就是通過構建平頦海蛇毒素cDNA文庫，從中篩選得到編碼海蛇神經毒素的cDNA克隆，進而利用高效大腸桿菌表達系統表達出具有生物活性的分離的海蛇神經毒素蛋白，用于進一步的功能研究和藥物開發。
本發明所選擇的海蛇是屬于海蛇科平頦海蛇屬的平頦海蛇(Hydrophiinae，Lapemis hardwickii Gray)，采自廣西省北海市。平頦海蛇毒素cDNA文庫的構建首先解剖得到海蛇的毒囊組織，提取總RNA，然后分離出mRNA進行逆轉錄，獲得cDNA，最后將cDNA連接到質粒載體pcDNA3.0上并轉化E.coli.從而構建成平頦海蛇毒素cDNA文庫。
本發明通過對平頦海蛇毒素cDNA文庫克隆的大規模序列測定，從中得到了三個編碼平頦海蛇短鏈神經毒素的cDNA克隆，分別稱為sn12、sn36和sn160。這三個cDNA都編碼81個氨基酸，等電點約為8.7，分子量約為9,000道爾頓，包括21個氨基酸的信號肽和60個氨基酸的成熟肽，具有典型的短鏈神經毒素一級結構的特征，三個蛋白之間只有一個氨基酸殘基的差異，位于成熟肽的第46位，分別為Pro46、His46和Arg46。他們的核苷酸及氨基酸序列如

圖1所示。
本發明通過設計了一對通用引物，將三個編碼平頦海蛇短鏈神經毒素成熟肽的基因用PCR方法擴增出來，克隆到原核融合表達載體pETTRX上，構建成表達質粒pETTRXsn12、pETTRXsn36和pETTRX sn160。經過對培養時間，誘導時間，溫度等條件的摸索和優化，SN12、SN36和SN160融合蛋白的表達量占菌體總蛋白的17％以上，并且基本上處于可溶狀態。
本發明還摸索和優化了SN12、SN36和SN160融合蛋白的純化條件，采用超聲裂解液經Ni2+Chelating Sepharose親和色譜層析和Sephacryl S-100HR凝膠色譜層析兩步純化，重組神經毒素純度可高達98％。
本發明的神經毒素可采用肌注、靜脈注射等給藥方式將其用于臨床治療，給藥劑量為小鼠半致死量的1/2500，{每日給藥一次，每次1--2支，個別每日兩次，每次一支。急性疼痛病例、疼痛消失即停藥，慢性痛則再鞏固用藥3--5次，20d為一療程，必要時重復。
本發明獲得的重組平頦海蛇短鏈神經毒素蛋白是有生物活性的。將經凝膠過濾色譜層析純化的三種重組神經毒素分別腹腔注射NIH小白鼠，小鼠都表現出明顯的神經中毒現象。SN12、SN36和SN160融合蛋白的半致死濃度分別為1.734mg/Kg、2.544mg/Kg和6.557mg/kg。根據Fox，J.W.1977年的研究報道(Fox，J.W.，Elzinga，M.and Tu，A.T.Amino acidsequence of a snake neurotoxin from the venom of Lapemis hardwickii andthe detection of a sulfhydryl group by laser Raman spectroscopy.FEBS Lett.1977，80(1)217-220)，SN12的天然蛋白的LD50是0.2mg/kg，我們的重組蛋白的神經毒活性只約為天然蛋白的1/12。
本發明的重組平頦海蛇短鏈神經毒素蛋白具有明顯的鎮痛作用。注射了重組平頦海蛇短鏈神經毒素蛋白的小鼠痛閾值有了明顯的提高，其中SN160效果最好，痛閾值提高了63.1％。本發明的重組平頦海蛇短鏈神經毒素蛋白可應用于新型鎮靜藥的研制，用于鎮痛、麻醉和戒毒，或臨床上診斷重癥肌無力等等。
由該表達質粒載體經KpnI和NotI酶切，可得到220bp的片段，即為編碼6His與平頦海蛇短鏈神經毒素成熟肽融合蛋白序列的序列，另外的約5.9kb的條帶為pETTRX載體質粒。
本發明的表達質粒載體的復制方法參照Sambrook(Sambrook，etal.1989，Molecular cloing.Cold Spring Harbor Labroratory Press.USA)方法，按CaCl2法在E.Coli.DH5α或BL21(DE3)菌株中轉化質粒，用含氨芐青霉素(100μg/nL)的LB培養基轉化細菌，減法提取質粒。
以下通過實施例和附圖對本發明作進一步說明。
圖1海蛇毒腺總RNA和mRNA電泳結果圖2海蛇毒腺cDNA電泳結果圖3海蛇毒素cDNA文庫總質粒ECORI/NotI雙酶切和PCR檢測電泳結果圖4sn12、sn36和sn160的核苷酸序列及由核苷酸序列推測的氨基酸序列圖5含有sn36基因的重組質粒pBSK-sn36的構建6含基因sn36的重組質粒pPETTrx-sn36的構建7可融性融合表達載體PETTrx的物理圖譜圖8平頦海蛇短鏈神經毒素基因sn36的PCR產物電泳檢測。M100bpDNA ladder 1sn36 PCR擴增產物；2PCR反應陰性對照圖9pBSK-sn36重組質粒酶切鑒定電泳分析。M1100bp DNAladder；M21kb DNA ladder。1重組質粒雙酶切產物/KpnI+BamHI；2載體pBluscript M13(+)雙酶切產物/KpnI+BamHI圖10pETTrx-sn36重組質粒酶切鑒定電泳分析。M1100bp DNAladder；M21kb DNA ladder。1重組質粒雙酶切產物/KpnI+NotI，2載體pETTrx雙酶切產物/KpnI+NotI。
圖11平頦海蛇重組神經毒素SN12的SDS-PAGE分析。1.BL21(pET22b)的總蛋白質；2.BL21(pETTRXsn12)的總蛋白質；3.BL21(pETTRXsn12)的總可溶性蛋白質；4.融合神經毒素SN12，通過Ni2+Chelaing Sepharose純化；5-6.融合神經毒素SN12，通過Sephacryl S-100HR純化；M.Protein marker。
圖12平頦海蛇重組神經毒素SN36的SDS-PAGE分析。1.BL21(pET22b)的總蛋白；2.BL21(pETTRXsn36)的總蛋白；3.BL21(pETTRXsn36)的總可溶性蛋白；4.融合神經毒素SN36，通過Ni2+Chelaing Sepharose純化；5.融合神經毒素SN36，通過Sephacryl S-100HR純化；M.Protein marker。
圖13平頦海蛇重組神經毒素SN160的SDS-PAGE分析。1.BL21(pETTRXsn160)的總蛋白；2.BL21(pET22b)的總蛋白；3.BL21(pETTRXsn160)的總蛋白；4.融合神經毒素SN160，通過Ni2+Chelaing Sepharose純化；5.融合神經毒素SN160，通過Sephacryl S-100HR純化；M.Protein marker圖14重組神經毒素的Ni2+Chelaing Sepharose親和色譜層析15重組神經毒素的Sephacryl S-100HR凝膠過濾層析圖實施例一 平頦海蛇毒素cDNA文庫的構建平頦海蛇毒囊總RNA的提取參考《現代分子生物學實驗技術》[11]的一步快速熱酚抽提法進行；mRNA的提取按Amersham Pharmacia公司的mRNA Purification Kit說明書操作；cDNA的合成按AmershamPharmacia公司的TimeSaverTMcDNA Synthesis Kit說明書操作。
采用異硫氰酸胍一步法提取的毒腺總RNA經1％甲醛變性膠電泳檢測可見清晰的28S、18S和5.8S三條rRNA條帶，和數條特異RNA條帶(見圖1)，表明總RNA完整性良好，而且表現出平頦海蛇毒腺的高分化特點。采用mRNA Purification Kit提取mRNA，電泳結果呈現均勻的smear(見圖1)，表明mRNA的完整性良好。取約5μgmRNA進行逆轉錄，合成雙鏈cDNA，電泳結果顯示cDNA呈現smear狀，大小在200bp到8kb的范圍內，主要是在2kb以下的區域，在500bp附近更為集中(見圖2)，表明所合成的cDNA編碼的蛋白分子量大部分較小，這與海蛇蛇毒中富含小分子多肽的事實相吻合[14]。將cDNA插入質粒載體pcDNA3上構建成cDNA表達文庫，文庫克隆數為9.96x105。提取總文庫質粒進行酶切和PCR分析，結果表明cDNA插入片段大小落在500bp-8k的范圍內，而在在500bp和1kb處出現較亮的泳帶(見圖3)，在其它區域還存在數條弱帶，挑取172個克隆提取質粒，酶切鑒定表明超過95％的克隆為重組子，表明該cDNA表達文庫具有較好的質量。實施例二 平頦海蛇短鏈神經毒素克隆序列的測定和分析隨機挑選500個cDNA克隆PEG純化法[13]提取質粒DNA。以T7和SP6為測序引物，采用ABI377 DNA Sequencer DNA自動序列儀(由大連寶生物工程有限公司提供)，正反向進行序列測定。結果表明平頦海蛇毒腺cDNA表達文庫中毒素基因的豐度很高。其中，有三個編碼短鏈神經毒素的基因，分別稱為sn12、sn36和sn160，它們編碼的蛋白長81個氨基酸，其中信號肽有21個氨基酸殘基，成熟肽有60個氨基酸殘基，具有典型的短鏈神經毒素一級結構的特征，三個蛋白之間只有一個氨基酸殘基的差異，位于成熟肽的第46位，分別為Pro46、His46和Arg46。
將推測的氨基酸序列通過因特網進行BLAST序列相似性查詢，程序為BLASTTP，結果表明sn12編碼的短鏈神經毒素的成熟肽基酸序列與Tu等從平頦海蛇毒素中分離提純的短鏈神經毒素完全一致[1]，而sn36和sn160編碼的蛋白則是新的短鏈神經毒素。另外，在GENEBANK中暫時找不到相同的核苷酸序列。
sn12、sn36和sn160的核苷酸序列及由核苷酸序列推測的氨基酸序列見圖-4，三個基因的序列皆分別由三個以上不同的cDNA克隆通過序列測定而得出，排除了可能由cDNA合成和序列測定帶來的誤差。從圖可看出sn12、sn36和sn160三個基因在非編碼區的核苷酸序列同源性也很高，這與Tamiya等(1999)報道的類似[3]。實施例三 重組平頦海蛇短鏈神經毒素表達質粒的構建根據sn12、sn36和sn160基因編碼的成熟肽兩端序列，合成一對引物，序列如下上游引物，5’CGG GGT ACC GAC GAC GAC GAT AAA ATG ACA TGTTGC AAC CAA CAG TC3’KpnI 腸激酶位點下游引物，5’CGC GGA TCC TTA ATT GTT GCA TTC GTT TGT ATG GC3’BamHIPCR擴增、基因克隆皆按常規方法進行[13]。構建的詳細過程見圖5，圖6。
克隆到本實驗室構建的原核融合表達載體pETTRX上，構建成表達質粒pETTRXsn12、pETTRXsn36和pETTRX sn160。PCR產物約220bp(見圖7)，編碼60個氨基酸殘基。克隆后的目的基因經酶切、測序鑒定正確。
載體pETTRX以T7為啟動子，采用分子伴侶TRX為融合伴體，幫助重組蛋白正確折疊，以可溶的形式表達，TRX的C端有柔鏈區和6×HIS結構，便于利用固定化金屬配體親和層析進行純化。所設計的上游引物含有腸激酶位點，以便外源蛋白單體的獲得。載體pETTRX結構簡圖見圖8。實施例四 重組平頦海蛇短鏈神經毒素融合蛋白的表達將pETTRXsn12、pETTRXsn36和pETTRX sn160轉化大腸桿菌BL21(DE3)。基因工程菌超聲裂解物經SDS-PAGE電泳分析表明基因工程菌經誘導后有明顯的特異表達產物帶，分子量于用軟件PROTEINANALYSIS預測的理論值22.1kD相符。
實驗表明，盡管高溫誘導的重組蛋白表達量很高，而低溫誘導的則相對低，但是低溫誘導的重組蛋白折疊比較充分，可以提高重組蛋白的可溶性，相對而言，重組蛋白的生物活性會高些。經過對培養時間，誘導時間，溫度等條件的摸索，基因工程菌的培養條件為接單菌落于50ml氨卞抗性LB培養基中，37℃，250rpm培養過夜，取過夜培養物20ml接種于2L的氨卞抗性LB培養基中，37℃，250rpm培養至OD600＝0.6，加入100mM IPTG和20％葡萄糖至終濃度分別為1 mM和0.2％，26℃，250rpm誘導培養10h后離心收獲菌體。薄層掃描分析表明，在此條件下SN12、SN36和SN160融合蛋白的表達量占菌體總蛋白的17％以上，基本上處于可溶狀態。實施例五 重組平頦海蛇短鏈神經毒素融合蛋白的純化因為三種重組神經毒素的氨基酸序列非常相象，彼此之間只有一個氨基酸殘基的差異，所以采用完全相同的純化方案。
超聲裂解液經Ni2+Chelating Sepharose親和色譜層析和Sephacryl S-100HR凝膠色譜層析兩步純化，經SDS-PAGE分析和薄層掃描分析表明重組神經毒素純度分別達到70％和98％(圖9；圖10；圖11)。以2L基因工程菌培養物為材料，最終獲得約100mg純化的融合蛋白。
為了提高重組蛋白的得率和濃度，簡化實驗步驟，縮短對重組蛋白的處理時間，在用Ni2+親和色譜層析純化重組蛋白時，我們并沒有采用嚴格的洗脫條件。根據載體質粒pETTRX所表達的外源蛋白與Ni2+親和柱的結合能力較強的特點，我們選用了較簡化的洗脫條件50mMPBS，500mMNaCl，pH7.8(A液)；50mMPBS，500mMNaCl，pH6.0(B液)；150mM咪唑，50mMPBS，500mMNaCl，pH6.0(C液)；400mM咪唑，50mMPBS，500mMNaCl，pH6.0(D液)。重組神經蛋白在D液被洗脫下來(圖12)。將經Ni2+親和柱初步純化的重組蛋白直接上樣Sephacryl S-100HR凝膠色譜層析，用生理鹽水洗脫，根據洗脫峰(圖13)分段收集洗脫液，從SDS-PAGE結果來判斷分離效果最好的部分。凝膠過濾色譜在此起到了很好的脫鹽和進一步純化的作用，用生理鹽水洗脫可以讓純化的蛋白直接進行生物活性測定實驗，避免透析。實施例六 重組平頦海蛇短鏈神經毒素融合蛋白的神經毒性鑒定將100只19g-21g NIH小鼠(雌雄各半)分成5組，每組20只，分別以五種適當的濃度腹腔注射經過濾除菌的重組短鏈神經毒素，以相同條件下表達和純化的pETTrx表達載體表達的分子伴侶TRX蛋白為陰性對照。觀察小鼠的反應并記錄每組小鼠的死亡數目，采用Microsoft Excel的線性回歸軟件，根據對數劑量與經驗概率單位繪制直線，計算LD50。
將經凝膠過濾色譜層析純化的三種重組神經毒素分別腹腔注射NIH小白鼠，小鼠都表現出明顯的神經中毒現象，如豎毛，呆滯，顫抖，翻正反射消失，呼吸困難，排泄系統失控等，最后強烈抽搐，窒息死亡，死亡后十幾分鐘內心跳仍未停止。同時，作為陰性對照的生理鹽水和融合伴體TRX卻無任何神經中毒癥狀。可見三種重組神經毒素在融合狀態下都具有神經毒活性。盡管三種重組神經毒素表只有一個氨基酸殘基的不同，但是它們表現出的神經毒活性卻有強弱差異，從強到弱的次序為SN160，SN12，SN36。
我們在確定了重組神經毒素具有神經毒活性后，以LD50為指標對毒性的大小進行定量描述。先進行數組預實驗，以確定三種毒素求取半致死濃度的五組注射劑量。每種重組神經毒素注將射100只19g-21g的NIH小白鼠。將100只小白鼠隨機分成五組，每組20只，雌雄各半，分別腹腔注射不同濃度的重組神經毒素0.5ml，以注射劑量對數為橫坐標，經驗概率單位為縱坐標作圖，求得對應于概率單位5的劑量對數算出LD50。實驗具體數據見表1。
表1重組神經毒素SN12、SN36和SN160對NIH小白鼠LD50的測定 實施例七 重組平頦海蛇短鏈神經毒素融合蛋白的鎮痛作用鎮痛作用研究采用小白鼠熱板法(參照藥理學實驗方法)，把小白鼠放在預先加熱到55℃的金屬板上，以添后足維常用痛反應指標。實驗前將反應遲鈍或過敏反應的小鼠篩除。
雌性小白鼠150只，體重18～22.5g，隨機分為對照組和不同劑量(1/8LD50、1/4LD50、1/2LD50)給藥組，給藥方式采用腹腔注射，對照組注射生理鹽水0.2mL。
統計結果見表2，鎮痛效果隨著劑量的加大而增強，三種短鏈神經毒素作用有所區別，SN160作用最強、SN12次之、SN36較弱。
表2平頦海蛇短鏈神經毒素的鎮痛作用(小鼠熱板法)
權利要求
1.一種分離的平頦海蛇神經毒素，它具有如下所示的氨基酸序列，其中成熟肽的第46位為Pro46、His46，或者Arg46m t c c n q q s s q p kt t t n c a e s s c y k k t w s d h r gt r i e r g c g c p q v k(p/h/r)gi k l e cc h t n e c n n
2.一種編碼權利要求1所述的神經毒素的基因。
3.按照權利要求2所述的基因，它具有如下的sn12，sn36或者sn160所示的序列sn12 T-GAATTCGGC-CGAGG-------------------------------------------sn36 ----------------------------------------------------sn160 GGCTCCAGAGAAGATCACAAGATGAAAACTCTGCTGCTGACCTTGGTGGTGGTGACAATC 60sn12 ------------------------------------------------------------sn36 ------------------------------------------------------------sn160 GTGTGCCTGGACTTAGGATACACCATGACATGTTGCAACCAACAGTCATCGCAACCTAAA 120sn12 ------------------------------------------------------------sn36 ------------------------------------------------------------sn160 ACCACTACAAATTGTGCAGAGAGCTCTTGCTATAAAAAGACTTGGAGCGATCACCGTGGA 180sn12 ---------------------------------------CCC------------------sn36 ---------------------------------------CAC------------------sn160 ACTAGAATTGAAAGGGGATGTGGTTGCCCTCAGGTGAAGCGCGGTATTAAACTTGAATGT 240sn12 ------------------------------------------------------------sn36 ------------------------------------------------------------sn160 TGCCATACAAACGAATGCAACAATTAGCTCTACGAATGGCTAAATTCCTTGAGCTTTGCT 300sn12 -------------------------------A-------------------C--------sn36 ------------------------------------------------------------sn160 CTCATCCATCAAGGACCATCCTTGAAAATTTGTGCTTCTGGCCTTTACCACTACATGGTC 360sn12 ----------------------------G-------------------------------sn36 ------------------------------------------------------------sn160 CATCATCCCCCTCTCCCCTGCTGTCTTTAACACCTCAACATCTTTCCCTTTTCTCTTGTT 420sn12 -----C------------------------------------------------------sn160 CTGTAAGTTTCCTTCTGCTAGTTCTGTAGTTTGAGAATCAAATAAACCTCAGCATCCAAA 480sn12 ------------------------sn36 ----------------------------------------GCATCTTAGAGsn160 AAAAAAAAAAAAAAAAAAATTCCTGCGGCCGCTCGAGCAT 520其中，“-”表示與sn160的序列相同。
4.權利要求1所述的神經毒素在制備鎮痛藥物和治療神經系統疾病的藥物中的應用。
全文摘要
本發明通過構建平頦海蛇(Lapemis hardwicki)毒腺cDNA文庫和DNA測序,得到三個編碼短鏈神經毒素的基因,分別稱為sn12、sn36和sn160。采用PCR方法改造并擴增該三個cDNA,克隆到表達載體PETTRX上,以BL21－DE3為表達宿主,經IPTG誘導,三種神經毒素基因在大腸桿菌中都得到高效的可溶性融合表達。短鏈神經毒素鎮痛作用實驗表明,sn12、sn36和sn160均能明顯提高小鼠的痛閾值。
文檔編號A61K38/00GK1343689SQ0012483
公開日2002年4月10日 申請日期2000年9月18日 優先權日2000年9月18日
發明者徐安龍, 鐘肖芬, 彭立勝, 衛劍文, 吳文言, 楊文利 申請人:中山大學