專利名稱：一種眼鏡蛇蛇毒神經毒素的提純方法、提取物及其制劑的制作方法
技術領域：
本發明屬于生物醫藥提取技術領域，特別是涉及一種眼鏡蛇蛇毒神經毒素的提純方法、提取物及其制劑。
背景技術：
蛇毒是毒蛇從毒腺中分泌出來的一種液體，主要成份是毒性蛋白質，約占干重的 90%至95%。酶類和毒素約含二十多種。此外，還含有一些小分子肽、氨基酸、碳水化合物、 脂類、核苷、生物胺類及金屬離子等。蛇毒成分十分復雜，不同蛇毒的毒性、藥理及毒理作用各具特點。就眼鏡蛇蛇毒而言，含有細胞毒素(Cytotoxin，CTX)、神經毒素(neurotoxin， NT)，神經生長因子(Nerve growth factor, NGF)和多種酶類等。神經毒素(neurotoxin, NT)在蛇毒中含量較高，一般在20% 50%之間，毒性極強，是該類毒蛇咬傷致死的主要成分之一。蛇毒神經毒素種類多、活性強、性質穩定、結構相對簡單，因此一直備受人們的關注。近年來隨著生化技術的發展及分子生物學方法的應用，已經從不同的蛇毒中分離純化出許多的神經毒素。其中僅突觸后神經毒素就有100多種。蛇毒神經毒素根據作用機制可分為四類突觸前神經毒素(presynaptically-acting neurotoxin或 β α 一 neurotoxin)、突角蟲后神經毒素(postsy-naptically-acting neurotoxin 或 a-neurotoxin)、抗膽喊酉旨Bl類神經毒素(anticholinesterase neurotoxin)禾口離子通道型神經毒素(ion-charmel neurotoxin)。目前發現的鎮痛成分幾乎都是突觸后神經毒素。科學研究表明，突觸后神經毒素是一條由60 80個氨基酸殘基組成的多肽鏈，氨基酸殘基的組成及相對位置具有很大的同源性，分子量約為6000 8000道爾頓。突觸后神經毒索有長鏈和短鏈之分，短鏈含60 62個氨基酸，四個二硫鍵.長鏈含66 74個氨基酸，五個二硫鍵。分子中的二硫鍵聚集在一起形成一個致密的內核，由此核心伸展出三個肽鏈環就象三個手指，故其又被形象地稱為三指蛋白(three-ringer protein) 0突觸后神經毒素幾乎全部是堿性蛋白，等電點在9 10之間。由于分子量很小但二硫鍵很多，這類毒素的理化性質十分穩定，對熱及化學試劑都有抗性。1936年Macht提出肌肉注射微量眼鏡蛇毒具有類似嗎啡的中樞鎮痛作用。美國 Hynson,ffestcott&Dunning公司對眼鏡蛇粗毒進行初步分離，制成Cobroxin和Nyloxin兩種神經毒素制劑，用于治療頑固性疼痛、惡性腫瘤疼痛和關節痛，這兩種藥物已列入美國藥物局方中。我國自1952年起開展對蛇毒神經毒素的鎮痛作用研究，開發了一些制劑用于臨床治療疼痛，其中中國科學院昆明動物研究所研制的“克痛靈”注射劑(現名為科博肽注射液)，用于治療坐骨神經痛、三叉神經痛、神經血管性頭痛以及風濕痛等頑固性疼痛，療效顯著且副作用少。NT的鎮痛作用有別于阿片類藥物，表現為作用效價高，維持時間久，無耐受性和成癮性，是一種很有潛力的新型鎮痛藥。同時，NT還能戒除嗎啡毒癮，在戒毒方面有獨特的治療作用。目前，獲取眼鏡蛇蛇毒中的神經毒素主要是通過捕蛇或養蛇取毒，對粗毒進一步純化提取而得到，主要利用離子交換層析和凝膠層析。現有技術中，中國專利申請 CN101845089A(
公開日期2010年9月四日)公開了“一種適合規模化生產眼鏡蛇蛇毒神經毒素并降低神經毒性的方法”，該方法將蛇毒層析洗脫后再過分子量為3K的超濾膜最后采用過氧化氫修飾神經毒素，步驟較繁瑣，容易引入雜質，在實際生產中，蛇毒神經毒素在層析洗脫后仍存在一部分分子量大于神經毒素的至敏物質，且采用過氧化氫修飾神經毒素后對眼鏡蛇神經毒素的長期穩定性并未作考察，規模化生產出的成品距離產品實際運用中仍然需要一定的考察時間。李范珠等在文獻“浙江眼鏡蛇蛇毒中神經毒素的分離純化及其鎮痛作用研究”(中國藥師，2004年09期，P659 661)中公開的浙江眼鏡蛇蛇毒中神經毒素的分離純化方法為將蛇毒直接進行三次柱層析，耗時長，提取成本高，神經毒素的收率較低。龔潮梁等在“一種分離提純眼鏡蛇經毒素的簡便方法”(動物學研究，第2卷第4期增刊，1981年11月)一文中公開了采用CM-纖維柱層析分離神經毒素， 70°C保溫熱變性處理雜質，低溫冷丙酮提純，然后用kphadex G-IO脫鹽的方法獲得純化的眼鏡蛇毒神經毒素，但是高溫保溫容易引起神經毒素大量變性沉淀，導致產物的生物活性降低，另外，由于鹽在目標產物中的量較少且不會影響其活性，脫鹽會導致有效成分損失， 且操作繁瑣，實際生產中耗費人力物力，使生產周期變長。以上幾種工藝獲得NT的成本高，生產周期長，質量難以控制，收率較低，獲得純品技術難度較大，并且由于天然蛇毒含有理化性質與神經毒素較為接近的其他大分子毒素如磷脂酶A2等，會干擾神經毒素的生物活性，應用于臨床會出現多種不良反應，在使用過程中容易產生安全隱患。因此，對眼鏡蛇蛇毒神經毒素的提取方法作進一步的深入研究，以期獲得含量高、 純度高、性質穩定且藥效良好的科博肽產品，是對科博肽的又一開發，也是我們研究人員的職責所在。

發明內容
本發明所要解決的技術問題是克服現有眼鏡蛇蛇毒神經毒素的提取方法中存在的生產周期長，質量難以控制，純度較低等缺點，提供一種工藝簡單、安全、質量可控的眼鏡蛇蛇毒神經毒素提取方法。本發明進一步要解決的技術問題是提供一種由上述方法制備得到的具有含量高、 療效好的更適合于工業化大生產的眼鏡蛇蛇毒神經毒素提取物及其制劑。為解決上述問題，提供的眼鏡蛇毒神經毒素提取方法為1)將眼鏡蛇粗毒溶于磷酸鹽緩沖液中，離心，上清液過微孔濾膜；2)對濾液進行超濾并交換為分離緩沖液，采用截留分子量為IOKDa的超濾膜進行；3)所得到的蛇毒液采用陽離子柱進行純化，用含Nacl的磷酸鹽緩沖液線性洗脫， 收集神經毒素粗品，冷凍，加丙酮沉淀，濾去丙酮，真空干燥，得眼鏡蛇毒神經毒素即科博肽。具體的，本發明采用如下的技術方案1)將眼鏡蛇粗毒溶于pH7. 8-8. 0,0. OlM的磷酸鹽緩沖液中，離心，取上清液，將上清液過0. 22 μ m濾膜；
2)對濾液進行超濾并交換為分離緩沖液，采用截留分子量為IOKDa的超濾膜進行；3)所得到的蛇毒液上樣到已用pH7. 8-8. 0,0. OlM磷酸鹽緩沖液平衡的CM-纖維素層析柱，用磷酸鹽緩沖液進行洗脫，洗脫流速為30-50ml/h，用自動部分收集器收集洗脫液， 用紫外分光光度計在^Onm處進行檢測。4)洗脫液吸光度降至0. 2以下，用含0. 03-0. 05M Nacl的磷酸鹽緩沖液洗脫，待洗脫液吸光度降至0. 2以下，用含0. 08-0. 09M Nacl磷酸鹽緩沖液洗脫；洗脫液吸光度降至 0. 2以下后，取最強吸收部分進行收集，量收集液體積，測吸光值；5)將前述步驟4)的收集液集中，放入冰柜，冷至5°C以下，加入經過預冷至5°C的丙酮，沉淀，過濾，真空干燥，得眼鏡蛇毒神經毒素即科博肽。優選的，前述步驟4)中洗脫流速為30_50ml/h，最強吸收部分為在^Onm處測吸光值大于0. 1的最大部分；步驟5)中丙酮用量為收集液體積的2. 5-3倍，沉淀時間為 80-120min。在本發明的提取方法中，采用微孔濾膜對離心后的蛇毒上清液進行過濾，去除溶液中的細菌和顆粒。由于天然蛇毒含有理化性質與神經毒素較為接近的其他大分子毒素如磷脂酶A2等，采用截留分子量為IOKDa的超濾膜，可以濾除分子量大于神經毒素的至敏物質，在后續的陽離子純化中，節約時間和成本，極大地簡化了提取工藝，增加產品的安全性。 針對眼鏡蛇毒含堿性蛋白質較多的特點，采用陽離子交換劑CM-纖維素作固定相，采用較高的PH和離子強度的磷酸緩沖液平衡CM-纖維素，既可以使等電點較高的毒性多肽吸附在交換劑上，同時使許多等電點偏低的組分不經吸附而流出，改善了神經毒蛋白的分離。最后采用丙酮直接從溶液中沉淀眼鏡蛇神經毒素，除去最終產品中的雜質，提高產品收率。本發明的另一個目的在于提供一種由上述提取方法制備而得的眼鏡蛇毒神經毒素，該物質的純度大于95%，純神經毒素的含量大于70%。本發明還提供了包含上述眼鏡蛇毒神經毒素加入輔料，按常規制劑工藝制成藥物學意義上的各種制劑，包括注射制劑、口服液制劑，如小容量注射劑、凍干粉針劑、普通片、 口腔崩解片及分散片劑、硬膠囊劑、軟膠囊劑、微囊劑、舌下片劑等。優選為小容量注射劑和凍干粉針劑。本發明所稱的常規制劑工藝以及輔料等是指在教科書、國家標準、地方標準上已經公開的方法、技術及輔料。其中小容量注射劑和凍干粉針劑的制備方法如下取70mg科博肽原料，加入配制藥液總量80%的注射用水，使其溶解，加入氯化鈉， 加入配制藥液總量0. 06 %的針用活性炭，充分攪拌，過濾，調節PH值至5-8，再加注射用水至全量2000ml，垂熔濾球過濾，灌封，115°C熱壓滅菌30分鐘，制備成小容量注射制劑1000 支，每支規格2ml: 70 μ g。取70mg科博肽原料，加入配制藥液總量80 %的注射用水溶解，再加入甘露醇，攪拌均勻，加注射用水至全量2000ml，攪勻，調節pH值至5_8，無菌濾過，濾液分裝于滅菌西林瓶中，冷凍干燥，制備成凍干粉針制劑1000瓶，每瓶規格70 μ g。本發明的眼鏡蛇毒神經毒素及其制劑，主要用于治療各種慢性疼痛、血管性頭痛、 三叉神經痛、坐骨神經痛、晚期癌疼痛、關節痛及麻風反應神經痛。
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為了使本領域普通技術人員更好的理解本發明，本申請人進行了一系列實驗研究，以證明本發明的效果實驗例1、工藝研究在眼鏡蛇毒神經毒素提取過程中，本發明人對提取工藝進行了設計和選擇，以最終提取物的性狀、水分、有效成分含量、純度以及純神經毒素收率(IOOg蛇毒中純神經毒素重量)為考察指標，進行了一系列的選擇試驗。樣品A 按照文獻“一種分離提純眼鏡蛇_Na jana jaatra_神經毒素的簡便方法”(龔潮梁等，動物學研究，第2卷第4期增刊，1981年11月)中眼鏡蛇毒神經毒素提取純化方法制備；樣品B 按照中國專利申請“一種適合規模化生產眼鏡蛇蛇毒神經毒素并降低神經毒性的方法”CN101845089A(
公開日期2010年9月四日)中實施例的方法制備；樣品C:按照文獻“浙江眼鏡蛇蛇毒中神經毒素的分離純化及其鎮痛作用研究”(李范珠等，中國藥師，2004年09期，P659 661)中公開的浙江眼鏡蛇蛇毒中神經毒素的分離純化方法制備；樣品D 按照本發明實施例1方法制備；樣品E 按照本發明實施例1方法，去除超濾步驟2)制備；樣品F 按照本發明實施例1方法，增加脫鹽步驟6)，具體如下6)將按照實施例1中步驟1) -5)方法得到的目的物用葡聚糖G-IO凝膠柱層析進行脫鹽和純化，溶液凍干即得純化的眼鏡蛇神經毒素。樣品G 按照本發明實施例1方法，增加70°C保溫步驟，具體如下5)將按照實施例1中步驟1)-4)方法得到的收集液集中，調PH到6. 5，在70°C恒溫水浴中保溫半小時，進行選擇性熱變性處理。冷卻后離心除去變性蛋白的沉淀，清液冷卻到4°C，加入經過預冷至5°C的丙酮，丙酮用量為收集液體積的2. 8倍，沉淀lOOmin，濾去丙酮，真空干燥，得眼鏡蛇神經毒素。上述方法得到的目的產物的考察結果，見表1。表1工藝選擇實驗結果
性狀水分(%)有效成分含量(％)收率(g/100g 蛇毒)純度(％)樣品A白色粉末4.057.66. 3595. 1樣品B白色粉末4. 362. 35. 1091.5樣品C白色粉末4.254. 76. 5493.2樣品D白色粉末3.880. 19. 4297.4樣品E白色粉末4.670.48. 1390.2樣品F白色粉末4.472. 15. 429.^3· 2樣品G白色粉末4. 163.67.7193.0 以上數據表明，按照上述方法提取的眼鏡蛇毒神經毒素性狀一致，均為白色粉末， 水分均未超過5. O%，滿足法定標準的要求。有效成分含量方面，樣品B、D、E、F、G的含量均較理想，但是樣品D、F、G的純度較高，綜合收率來看，樣品F的收率較低，可能是因為提純過
7程中增加了脫鹽步驟，造成一定量有效成分的損失。故選擇樣品D和G進一步考察神經毒素活性。實驗例2、神經毒素活性考察方法參照Bulbring法制備大鼠膈神經-膈肌標本，置入盛有Kreb液25ml，恒溫 30°C浴槽中，通氧氣，標本肋骨端固定于浴槽底部，中心腱接于張力換能器。用0.5ms超強方波，每15秒交替刺激神經和肌肉，待標本收縮穩定后，向浴槽中加入受試樣品D和G，每份樣品量不超過Kreb液容量的5%，觀察樣品對標本收縮的影響。結果在電刺激誘發大鼠離體膈神經-膈肌標本收縮實驗中，上述兩種樣品均能抑制間接刺激引起的膈肌收縮，但不影響直接刺激膈肌引起的肌肉收縮，說明能抑制神經-肌肉接頭的傳遞，對肌肉組織無影響，但樣品D抑制作用強于樣品G，這可能與在大生產的純化過程中，增加了保溫步驟，使得神經毒素變性沉淀，降低了神經毒素的生物活性。故選擇樣品D的提取方法，進一步考察各參數對產品的含量等的影響。實驗例3、工藝參數選擇超濾膜的大小，柱層析過程中洗脫液的濃度和流速，沉淀過程中丙酮的用量和沉淀時間等均是影響提取物質量的關鍵因素，本發明人對提取工藝進行了參數的設計和選擇，以最終提取物的性狀、水分、有效成分含量、純度和收率為考察指標進行考察。3.1超濾選擇藥物1 按照本發明實施例1的方法制備，其中步驟幻中超濾膜更換為截留分子量為6KDa的超濾膜；藥物2 按照本發明實施例1的方法制備；結果表2超濾膜大小對產物的影響
權利要求
1.一種眼鏡蛇蛇毒神經毒素提取物，由眼鏡蛇蛇毒提取純化制備而成，其特征在于 提純方法為1)將眼鏡蛇粗毒溶于磷酸鹽緩沖液中，離心，上清液過微孔濾膜；2)對濾液進行超濾并交換為分離緩沖液，采用截留分子量為IOKDa的超濾膜進行；3)所得到的蛇毒液采用陽離子柱進行純化，用含Nacl的磷酸鹽緩沖液線性洗脫，收集神經毒素粗品，冷凍，加丙酮沉淀，濾去丙酮，真空干燥，即得目的產物。
2.如權利要求1所述的眼鏡蛇蛇毒神經毒素提取物，其特征在于提純方法為1)將眼鏡蛇粗毒溶于PH7.8-8. 0,0. OlM的磷酸鹽緩沖液中，離心，取上清液，將上清液過0. 22 μ m濾膜；2)對濾液進行超濾并交換為分離緩沖液，采用截留分子量為IOKDa的超濾膜進行；3)所得到的蛇毒液上樣到已用pH7.8-8. 0,0. OlM磷酸鹽緩沖液平衡的CM-纖維素層析柱，用磷酸鹽緩沖液進行洗脫，洗脫流速為30-50ml/h，用自動部分收集器收集洗脫液，用紫外分光光度計在^Onm處進行檢測；4)洗脫液吸光度降至0.2以下，用含0. 03-0. 05M Nacl的磷酸鹽緩沖液洗脫，待洗脫液吸光度降至0. 2以下，用含0. 08-0. 09M Nacl磷酸鹽緩沖液洗脫；洗脫液吸光度降至0. 2 以下后，取最強吸收部分進行收集，量收集液體積，測吸光值；5)將前述步驟4)的收集液集中，放入冰柜，冷至5°C以下，加入經過預冷至5°C的丙酮， 沉淀，過濾，真空干燥，即得目的產物。
3.如權利要求2所述的眼鏡蛇蛇毒神經毒素提取物，其特征在于前述步驟4)中洗脫流速為30-50ml/h，最強吸收部分為在^Onm處測吸光值大于0. 1的最大部分；步驟5)中丙酮用量為收集液體積的2. 5-3倍，沉淀時間為80-120min。
4.如權利要求1-3任一所述眼鏡蛇蛇毒神經毒素提取物，其特征在于提取物的含量大于70%、純度大于95%。
5.一種包含權利要求4所述眼鏡蛇蛇毒神經毒素提取物以及藥學上可接受的輔料的制劑。
6.如權利要求5所述的制劑，其特征在于所述制劑為注射制劑、口服制劑，具體為小容量注射劑、凍干粉針劑、普通片、口腔崩解片及分散片劑、硬膠囊劑、軟膠囊劑、微囊劑、舌下片劑。
7.如權利要求6所述的制劑，其特征在于所述制劑為小容量注射劑和凍干粉針劑。
8.如權利要求7所述的眼鏡蛇蛇毒神經毒素提取物制劑，其特征在于1)將眼鏡蛇粗毒粉IOOg溶于pH7.9,0. OlM的磷酸鹽緩沖液中至^Oml,攪拌下溶解， 以3000r/min的速度離心lOmin，取上清液，將上清液過0. 22 μ m濾膜；2)所得到的上清液進行超濾并交換為分離緩沖液，采用截留分子量為IOKDa的超濾膜；3)所得到的蛇毒液上樣到已用pH7.9,0. OlM磷酸鹽緩沖液平衡的CM-纖維素層析柱， 用磷酸鹽緩沖液進行洗脫，洗脫流速為40ml/h，用自動部分收集器收集洗脫液，用紫外分光光度計在^Onm處進行檢測；4)洗脫液吸光度降至0.2以下，用含0. 04mol/L的Nacl磷酸鹽緩沖液洗脫，待洗脫液吸光度降至0. 2以下，用含0. 08mol/LNacl磷酸鹽緩沖液洗脫；洗脫液吸光度降至0. 2以下后，取吸光度大于0. 1的最強吸收部分進行收集，量收集液體積，測吸光值；洗脫流速為 40ml/h,收集液取280nm處吸光值大于0. 1的最大部分；5)將前述步驟4)的收集液集中，放入冰柜，冷至5°C以下，加入經過預冷至5°C的丙酮， 丙酮用量為收集液體積的2. 8倍，沉淀lOOmin，濾去丙酮，真空干燥，得眼鏡蛇毒神經毒素即科博肽；6)取70mg科博肽原料，加入配制藥液總量80%的注射用水，使其溶解，加入氯化鈉，加入配制藥液總量0. 06 %的針用活性炭，充分攪拌，過濾，調節PH值至5-8，再加注射用水至全量200Gml，垂熔濾球過濾，灌封，115°C熱壓滅菌30分鐘，制備成小容量注射制劑1000支， 每支規格:2ml: 70 μ g0
9.如權利要求7所述的眼鏡蛇蛇毒神經毒素提取物制劑，其特征在于1)將眼鏡蛇粗毒粉IOOg溶于pH7.9,0. OlM的磷酸鹽緩沖液中至^Oml,攪拌下溶解， 以3000r/min的速度離心lOmin，取上清液，將上清液過0. 22 μ m濾膜；2)所得到的上清液進行超濾并交換為分離緩沖液，采用截留分子量為IOKDa的超濾膜；3)所得到的蛇毒液上樣到已用pH7.9,0. OlM磷酸鹽緩沖液平衡的CM-纖維素層析柱， 用磷酸鹽緩沖液進行洗脫，洗脫流速為40ml/h，用自動部分收集器收集洗脫液，用紫外分光光度計在^Onm處進行檢測；4)洗脫液吸光度降至0.2以下，用含0. 04mol/L的Nacl磷酸鹽緩沖液洗脫，待洗脫液吸光度降至0. 2以下，用含0. 08mol/LNacl磷酸鹽緩沖液洗脫；洗脫液吸光度降至0. 2以下后，取吸光度大于0. 1的最強吸收部分進行收集，量收集液體積，測吸光值；洗脫流速為 40ml/h,收集液取^Onm處吸光值大于0. 1的最大部分；5)將前述步驟4)的收集液集中，放入冰柜，冷至5°C以下，加入經過預冷至5°C的丙酮， 丙酮用量為收集液體積的2. 8倍，沉淀lOOmin，濾去丙酮，真空干燥，得眼鏡蛇毒神經毒素即科博肽；6)取70mg科博肽原料，加入配制藥液總量80%的注射用水溶解，再加入甘露醇，攪拌均勻，加注射用水至全量2000ml，攪勻，調節pH值至5_8，無菌濾過，濾液分裝于滅菌西林瓶中，冷凍干燥，制備成凍干粉針制劑1000瓶或500瓶，每瓶規格70 μ g、140 μ g。
全文摘要
本發明公開了一種眼鏡蛇蛇毒神經毒素的提純方法、提取物及其制劑，該眼鏡蛇蛇毒神經毒素提取物由眼鏡蛇粗毒提取純化制得。本發明首先采用濾膜過濾的方法，去除溶液中的細菌、顆粒及大分子的至敏物質，為后續工藝節約時間和成本，增加產品的安全性；采用離子交換的方法洗脫分離神經毒素，改善了神經毒蛋白的分離；最后采用丙酮直接沉淀眼鏡蛇神經毒素，除去最終產品中的雜質。與現有技術相比，本發明得到的眼鏡蛇蛇毒神經毒素提取物及制劑，產品收率、含量和純度得到提高，同時有效降低了藥物的不良反應，提高了療效，從而保證了產品的質量。
文檔編號A61P29/00GK102351951SQ20111032479
公開日2012年2月15日 申請日期2011年10月24日 優先權日2011年10月24日
發明者竇啟玲, 蘇凱 申請人:貴州益佰制藥股份有限公司