專利名稱：從發(fā)酵大豆里提取genistein為抗癌和抗二惡英致癌的物質(zhì)的制作方法
1，發(fā)明背景環(huán)境荷爾蒙二惡英是現(xiàn)代社會(huì)文明的產(chǎn)物。人類在改造自然社會(huì)的同時(shí)污染了環(huán)境。大量農(nóng)藥等有害化學(xué)物質(zhì)的使用，汽車尾氣的排放，工業(yè)生產(chǎn)造成了無法控制的環(huán)境污染。嚴(yán)重影響各種生態(tài)系統(tǒng)，也造成自然環(huán)境的日益惡化。近年除了不斷有牛肉，雞肉，0-157等污染食品的報(bào)告；在食品中有二惡英的檢出。人們?nèi)粘Ｃ媾R環(huán)境荷爾蒙兩大污染食品污染和大氣污染。食品污染是由于農(nóng)藥，殺蟲劑大面積噴灑及食品添加劑等的使用。在現(xiàn)在的食品中、約有90％左右使用過農(nóng)藥，殺蟲劑及食品添加劑。二惡英是毒性極強(qiáng)的物質(zhì)，雖然這種污染極微量，但在人體中不能自然降解，游離狀態(tài)的二惡英代謝時(shí)間約7-15年，在人體內(nèi)蓄積一定時(shí)間后，有致癌的可能，特別是以乳癌和前列腺癌為多。二惡英不但致癌，還對(duì)免疫功能及內(nèi)分泌系統(tǒng)產(chǎn)生毒害，造成了對(duì)人類生存的威脅。亞洲地區(qū)，特別是乳癌和前列腺癌，在20年前的發(fā)病比較低，近10年有增加，這與環(huán)境污染有直接關(guān)系。但至今尚未有發(fā)現(xiàn)較好的預(yù)防方法。
本發(fā)明是利用發(fā)酵大豆提取的genistein成分，防止環(huán)境荷爾蒙與生物體受體的結(jié)合，無副作用，故能預(yù)防環(huán)境荷爾蒙引起的癌癥，也能防止二惡英所產(chǎn)生的毒性作用。預(yù)防環(huán)境荷爾蒙引起的癌癥，并對(duì)二惡英所產(chǎn)生的毒害有抵抗作用。
2，目前技術(shù)1)異黃酮與genistein的提取技術(shù)Genistein來源于大豆的異黃酮。Genistein，在中國無統(tǒng)一命名，中文稱染料木素；染料木因；染料木黃酮；金雀異黃酮 (引自中國科學(xué)出版社，日英漢生物化學(xué)詞典，1987版)。異黃酮在大豆中僅有0.3％的含量。用一般方法提取異黃酮，回收量極低。異黃酮中至少有十二種的化學(xué)成分，提取異黃酮后再提取genistein，由于回收量僅有0.1％，不能在大量生產(chǎn)上應(yīng)用。少數(shù)用合成方法制取genistein。因?yàn)楫慄S酮是糖原成分，普通方法制取一般回收量較低。又因異黃酮中含有多種成分，雖也含有微量的genistein，但不能在體內(nèi)保持一定的血濃度。人體利用異黃酮時(shí)要求其糖元成分要在體內(nèi)轉(zhuǎn)化，轉(zhuǎn)化程度取決于人的個(gè)體差異，因在體內(nèi)的血濃度不穩(wěn)定、吸收量小、食后通常有脹氣、少數(shù)還有過敏的反應(yīng)。不適合于慢性腎病，痛風(fēng)的病人食用。本發(fā)明應(yīng)用生物技術(shù)，對(duì)大豆發(fā)酵技術(shù)進(jìn)行改進(jìn)，改變了普通大豆分離后不易吸收，和人體有差異不一致、不能保持一定血濃度等缺點(diǎn)、同時(shí)大大提高了genistein的回收量、解決了原始的提取方法回收少、造價(jià)高的問題。
2)異黃酮與genistein作用的基楚研究及最近進(jìn)展大豆的異黃酮有抗動(dòng)脈硬化(Kirk E.A.et.al，J.Nutr.，128，954(1998)；抗更年期(Murkies A.L.et.al.Maturitas，21，189，(1995)；及抗骨質(zhì)疏松癥Blair H.C.et.al.，J.Celluar Biochem.，61，629(1996)等作用。近年有論文報(bào)告異黃酮有預(yù)防乳癌和預(yù)防前列腺癌的作用(Herman C.et.al.J.Nutr.，125，757S(1995)。
在異黃酮中至少有12種物質(zhì)組成。其中有Genistein；daidzein(大豆甙)；和genistin(異黃甙)等三種物質(zhì)具有抗癌作用有報(bào)告。Genistein抗癌，抗氧化作用，均高于daidzein和genistin(Lee HP Lance，337，1197，1991；M Nomrua，Cancer Research，53，5815-5821，1993；S barnes，Biochem.Biophys.Res.Commun.179，661-667，1997.)。但抗二惡英類物質(zhì)致癌的作用尚未有報(bào)告。作為抗二惡英致癌的藥品或機(jī)能性食品的作用也尚未見報(bào)告。本發(fā)明研究了長壽之國日本經(jīng)常食用發(fā)酵大豆食品(大醬)，乳癌發(fā)病率也少，對(duì)大醬成分，大豆發(fā)酵方法及提取技術(shù)及有效單一成分進(jìn)行了各方面的確認(rèn)。
1、本發(fā)明是用發(fā)酵大豆的生物新技術(shù)提取有效成分染料木因genistein方法。
提取genistein單體的方法。大豆經(jīng)過水浸，蒸煮，冷卻后，加入麹菌和適量的炭酸鈣和炭酸鎂，在一定濕度和溫度，經(jīng)過數(shù)月發(fā)酵，異黃酮可有90％以上、再抽出和精制的genistein。根據(jù)純度分別可作為藥品和食品。Genistein是多糖，在體內(nèi)不需要糖轉(zhuǎn)化的過程，容易吸收。Genistein食后無脹氣，有直接的生物活性，在體內(nèi)保持一定的血濃度，在人體內(nèi)48-72小時(shí)可排出體外，無副作用和無過敏的特點(diǎn)。提取genistein時(shí)提取粗異黃酮、再用高壓液相分離方法提取精制的genistein。

圖1 genistein的化學(xué)結(jié)構(gòu)2、Genistein在生物體細(xì)胞內(nèi)的藥理作用Genistein在生物體細(xì)胞內(nèi)可與環(huán)境荷爾蒙發(fā)生競爭，可把環(huán)境荷爾蒙作用細(xì)胞的受體部位占據(jù)(主要是體內(nèi)的游離的環(huán)境荷爾蒙在受體部位產(chǎn)生競爭)使環(huán)境荷爾蒙不易進(jìn)入體內(nèi)細(xì)胞，可抑制環(huán)境荷爾蒙與人體的受體部位結(jié)合，而不會(huì)引起體內(nèi)細(xì)胞核的變異，可預(yù)防環(huán)境荷爾蒙-二惡英所致的毒性作用。
3、Genistein的中藥植物并用的效果Genistein與中藥、葉綠素及植物纖維并用，有促進(jìn)腸內(nèi)廢物排出作用，可使游離的環(huán)境荷爾蒙——二惡英排出體外，使體內(nèi)的二惡英的毒害減少。
4、Genistein與中藥生素E等并用能防止大氣污染，放射線等有害物質(zhì)對(duì)精子細(xì)胞的氧化作用；提高精子細(xì)胞質(zhì)量。
5、免疫機(jī)能的調(diào)整作用。Genistein與人參等合用，可使抗毒作用增加。使NK細(xì)胞的作用增加。抑制二惡英誘發(fā)癌細(xì)胞增殖。增加體內(nèi)免疫機(jī)能，并有抗毒性和預(yù)防免疫系統(tǒng)疾病等功能。
6、Genistein來源于發(fā)酵大豆，兼有日本的納豆和大醬健康食品的效果并優(yōu)于其效果。Genistein是粉狀物質(zhì)，可以作為醫(yī)藥和食品形式應(yīng)用。在醫(yī)藥品應(yīng)用的場合，可作為藥品口服劑，可以是散劑，顆粒，錠劑，糖衣錠和口服液等劑型。在藥品應(yīng)用的場合，一般一日約50-200μg/kg體重范圍內(nèi)，通常1日1-3次服用。具體正確用量，應(yīng)視使用者的年齡，體重，癥狀，投與方法考慮。應(yīng)注意genistein適用于中高年人群，不適用于兒童。Genistein可作為食品和食品添加劑，調(diào)味料及機(jī)能性健康食品。在食品應(yīng)用的場合，可制成果物，飲料等。實(shí)用例本發(fā)明是利用發(fā)酵大豆提取染料木因genistein方法和提取過程說明。大豆經(jīng)過水浸，蒸煮，冷卻后，加入麹菌和適量炭酸鈣和炭酸鎂1)圖2是大豆發(fā)酵及genistein的提取方法大豆→水浸→蒸煮→冷卻→加麹菌→發(fā)酵→調(diào)整→異黃酮抽出→30％genistein抽出可作為健康食品或藥品→再抽出→精制→干燥→提取60％以上genistein可作為藥品。
2)急性毒性試驗(yàn)，予小白鼠每日genistein用2000mg/kg/日(相當(dāng)使用范圍的10000萬倍)經(jīng)兩周口服， 急性毒性試驗(yàn)，無1例死亡。動(dòng)物試驗(yàn)結(jié)果(1)予6周齡Sprague-Dawley雌性大白鼠投與混有胡麻油7，12-dimethylbenz[a]anthtacene(DMBA)1mg/日/1回，同時(shí)給含有0.1％genistein的飼料。對(duì)照組僅投與胡麻油含DMBA 1mg/日/1回和普通飼料。5周以后對(duì)照組誘發(fā)的乳癌可觸及、60周以后解剖。實(shí)驗(yàn)結(jié)果如下(表1)實(shí)驗(yàn)群 實(shí)驗(yàn)數(shù) Dioxin發(fā)癌數(shù)發(fā)癌匹數(shù) 發(fā)癌率 腫瘍個(gè)數(shù)/匹對(duì)照組普通飼料 20匹DMBA1mg/日/P.O18/20 90％ 3.5試驗(yàn)組0.1％genistin 20匹DMBA1mg/日/P.O9/20 45％ 1.4解剖發(fā)現(xiàn)對(duì)照組的比試驗(yàn)組的大白鼠子宮增大，乳腺發(fā)達(dá)。本發(fā)明實(shí)驗(yàn)用二惡英致癌的物制可誘發(fā)大白鼠發(fā)生乳癌。在加用genistein后可減少45％的乳癌發(fā)病。Genistein有抑制二惡英毒性作用和抗二惡英的致癌作用。
(2)予6周齡Sprague-Dawley雄性大白鼠皮下注射二惡英(DMAB)，注射量50mg/kg/5回/周共8周投與。予含有0.1％genistein的餌料和對(duì)照組普通餌料進(jìn)行觀察。結(jié)果如表2所示表2實(shí)驗(yàn)組 實(shí)驗(yàn)數(shù) 二惡英類5回/周 發(fā)癌個(gè)數(shù) 發(fā)癌率對(duì)照組普通飼料n＝15 DMBA/50mg/kg(皮下) 9/1560.0％試驗(yàn)組1 0.1％daidzin組 n＝15 DMBA/50mg/kg(皮下) 6/1540.0％試驗(yàn)組2 0.1％genistein組 n＝15 DMBA/50mg/kg(皮下) 5/1533.3％本發(fā)明實(shí)驗(yàn)用二惡英致癌物制可誘發(fā)大白鼠發(fā)生前列腺癌。40周以后比較，在加用genistein后可減少26.7％的前列腺癌的發(fā)病率。加用0.1％daidzin組在加用genistein后可減少的20％前列腺癌的發(fā)病。以上實(shí)驗(yàn)證明genistein能抗二惡英引起的大白鼠乳癌和前列腺癌的發(fā)生。
5)人體癌細(xì)胞試驗(yàn)結(jié)果用發(fā)酵大豆提取的genistein及與非發(fā)酵大豆單體對(duì)人的癌細(xì)胞成長阻害試驗(yàn)結(jié)果。Genistein的用量，用1ml培養(yǎng)液中阻害移植癌細(xì)胞的增殖率人的癌細(xì)胞抑制試驗(yàn)用IC50(ug/ml)、如表3所示。Cell line 發(fā)酵 大豆μg/ml非發(fā)酵 大豆μg/mlgenistein daidzeingenistein daidzeinHSC-45M2(胃癌)7.1- 18.0-HCC-44B2(肺癌)11.5 - 33.0-MDA-468 (乳癌)6.5 34.0＞100 ＞100MCF-7 (乳癌)12.0 28.0＞100 ＞100Genistein抑制人的乳癌細(xì)胞MCF-7，和人的乳癌MDA-468細(xì)胞的成長，對(duì)大腸癌細(xì)胞和胃癌細(xì)胞也有抑制作用。非發(fā)酵genistin抑制癌細(xì)胞增殖但用量要增加到3-20倍。
6)Genistin防放射線幅射的試驗(yàn)結(jié)果Genistein與椎茸，紅參，五味子、維生素E等并用實(shí)驗(yàn)以調(diào)整體質(zhì)、先后服用進(jìn)行放射線照射實(shí)驗(yàn)。予BALB/c 6周齡雄性小白鼠進(jìn)行放射線照射、分別用復(fù)合制劑劑量為10.5-21.0(g/kg)/日，共2周進(jìn)行測定、結(jié)果是對(duì)精子400個(gè)計(jì)數(shù)/匹及精子的質(zhì)量進(jìn)行檢定實(shí)驗(yàn)。如(表4所示)全體項(xiàng)目 服用劑量(g/kg) 動(dòng)物數(shù)/匹 照射劑量(Gy)精子總畸形率(％)未服用照射組 - 20 36.8±1.7服用前照射 10.5 20 34.8±0.9服用后照射 21.0 20 34.5±1.2環(huán)境荷爾蒙易對(duì)生殖系統(tǒng)細(xì)胞產(chǎn)生氧化作用，故現(xiàn)在人類精子數(shù)比50年前減少了一半。利用genistein與椎茸，紅參，五味子、維生素C，E等混合制劑有對(duì)放射線的幅射的精子有增加的作用。Genistein有抗大氣污染，廢氣，煙草環(huán)境荷爾蒙，和放射線，紫外線有害射線等有害作用，防止精子細(xì)胞氧化；推論是結(jié)合體內(nèi)游離的環(huán)境荷爾蒙，增加體質(zhì)、促使體內(nèi)的有害物質(zhì)排出體外的作用。
7)Genistein與椎茸，紅參，五味子，維生素C，E等混合使用使免疫力增強(qiáng)。予6周齡雄性BALB/c小白鼠服用復(fù)合制劑服用劑21.0(g/kg)/日，共4周照射損傷后測定外周血相的影響，尾靜脈采血，EDTA處理。自動(dòng)血球極數(shù)裝置(東亞醫(yī)用電子(株)制Sysmer F-800)血相測定(結(jié)果如表5所示)實(shí)驗(yàn)項(xiàng)目 服用劑量(g/kg) 白細(xì)胞數(shù) 紅細(xì)胞數(shù) 血小板數(shù) 血紅蛋白數(shù)未服用照射 -140(102/ul) 560(104/ul) 24(104/ul) 12.1(g/dl)服用后照射21.0 480(102/ul) 710(104/ul) 35(104/ul) 13.4(g/dl)8)予(TCDD)二惡英投與8周齡小白鼠的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)。BALB/c小白鼠A群1回700ng/kggenistein投與，B群90ng/kg用量genistein，C群700ng/kg的genistein加入?yún)?shù)種中藥如；椎茸，蘆薈，紅參，五味子、綠茶等提取物飼養(yǎng)4月后解剖。AB群小白鼠胸腺萎縮，淋巴球減少，抗體產(chǎn)生及免疫機(jī)能抑制。C群4月后顯示細(xì)胞凋亡，淋巴球正常。Genistein與中藥等并用有增加二惡英排出的作用、NK細(xì)胞增加、能使免疫細(xì)胞機(jī)能增強(qiáng)。
9)Genistein適用乳癌(MCF-7病理型)患者，前列腺癌患者，及以下工作者特別是血中二惡英濃度增高人群和正常人(1)適用于農(nóng)藥用的殺蟲劑， 除草劑，防腐劑，殺菌劑，漂白劑接觸頻繁產(chǎn)業(yè)工作人員。
(2)適用于工業(yè)化學(xué)與食品或醫(yī)藥品(有機(jī)物，含磷合成洗劑，睡眠藥避妊藥)產(chǎn)業(yè)工作人員。
(3)適用于環(huán)境污染，廢物物質(zhì)處理產(chǎn)業(yè)工作人員。
(4)Genistein適用于中，老年人更年期等健康人群，但其安全用量、長期服用無毒副作用要經(jīng)過臨床研究。
(5)Genistein對(duì)未發(fā)育的青少年不適于使用。注*二惡英Dioxin是環(huán)境荷爾蒙最引人注目的物質(zhì)。二惡英不單指一種化學(xué)物質(zhì)，包括7種同系的物質(zhì)(CH3數(shù)字不同甾化合物群構(gòu)成的有機(jī)化學(xué)物質(zhì)，75種的化學(xué)物質(zhì)品種。
權(quán)利要求
1 本發(fā)明是利用發(fā)酵大豆進(jìn)行提取的粗制或精制的genistein(染料木素)，可作健康食品與抗癌的藥品。
2 要求1的分離物質(zhì)在體內(nèi)有直接的生物活性，能在體內(nèi)保持一定的時(shí)間和穩(wěn)定的濃度，食后無脹氣，不受個(gè)體差異影響，無過敏反應(yīng)，極少有副作用。
3 要求1的物質(zhì)genistein具有植物性激素樣的作用，作用原理是將環(huán)境荷爾蒙作用的細(xì)胞的受體部位占據(jù)，與體內(nèi)的游離的環(huán)境荷爾蒙產(chǎn)生競爭，故能防止環(huán)境荷爾蒙與人體受體的異常結(jié)合，也不會(huì)進(jìn)入細(xì)胞核造成突變而引起發(fā)癌。
4 要求1的genistein與葉綠素及植物纖維等并用，可抑制環(huán)境荷爾蒙二惡英與體內(nèi)的受體細(xì)胞結(jié)合，並可促使二惡英排出體外，使體內(nèi)的二惡英的毒害減少。
5 Genistein與維生素E等結(jié)合能防止環(huán)境荷爾蒙二惡英，放射線等有害毒性作用，能防止精子細(xì)胞的氧化作用。
6 Genistein與人參合用，可使抗毒作用增強(qiáng)，使體內(nèi)殺傷細(xì)胞(NK細(xì)胞)作用增強(qiáng)，并有抗毒性和預(yù)防免疫系統(tǒng)疾病等功能。
7 Genistein可作為食品或醫(yī)藥品，也可作為機(jī)能性的健康食品或食品添加劑，調(diào)味料等。
全文摘要
用發(fā)酵大豆提取的genistein在生物體中有直接的生物活性,食后無脹氣,能保持一定的體內(nèi)濃度,不受個(gè)體差異的影響等優(yōu)點(diǎn)。Genistein有植物激素樣的作用,與體內(nèi)的游離的環(huán)境荷爾蒙產(chǎn)生競爭,將細(xì)胞的受體部位占據(jù)。加用genistein的動(dòng)物可減少二惡英引起的發(fā)癌;與人參、葉綠素、植物纖維、中藥等并用、可增強(qiáng)二惡英的排出和機(jī)體的免疫系統(tǒng)功能。
文檔編號(hào)A61K31/352GK1352896SQ0013307
公開日2002年6月12日 申請(qǐng)日期2000年11月8日 優(yōu)先權(quán)日2000年11月8日
發(fā)明者程錦雁 申請(qǐng)人:程錦雁, 陳清軒, 牛屹東