專利名稱：抗骨橋蛋白抗體類藥物生產方法及用途的制作方法
技術領域：
本發明涉及生物制藥及防治血管再狹窄、動脈粥樣硬化及骨質疏松癥的藥物技術領域。
本發明是這樣實現的一種抗骨橋蛋白抗體類藥物，其特征在于該藥物為人源抗骨橋蛋白單鏈抗體、抗骨橋蛋白單克隆抗體或抗骨橋蛋白多克隆抗體，將其制成各種藥物劑型。
本發明之二是一種抗骨橋蛋白抗體類藥物的生產方法，其特征在于a、首先構建噬菌體人源抗體庫，分離PTCA后患者外周血單核細胞，以大鼠OPN為抗原在體外致敏后，經EBV轉化，富集分泌特異性抗體的B細胞，提供總RNA；將抗體重鏈、輕鏈可變區基因片斷與編碼十五肽(GIY4Ser)3的DNA接頭經重組PCR組裝在一起，構建噬菌體抗體庫；b、以KOPNH從噬菌體抗體庫中篩選抗OPN單鏈抗體，取硝酸纖維素膜浸泡于OPN溶液中，吹干，放入聚丙烯塑料皿內，取噬菌體懸液加入皿內，室溫下輕搖，用PBS洗去未結合噬菌體，換用洗脫緩沖液，以洗脫與OPN結合的噬菌體，收集洗脫液，用中和緩沖液調節PH至7.0-8.0，所洗脫的噬菌體用以感染對數生長期的E.coli，對噬菌體進行擴增，即制得人源抗骨橋蛋白單鏈抗體。
本發明之三是一種上述的抗骨橋蛋白抗體類藥物的用途，其特征在于用于防治血管再狹窄、動脈搏粥樣硬化和骨質疏松癥。
本發明是根據PTCA后再狹窄發生的病理機制研制的人源抗體OPN抗體或OPN拮抗劑，以細胞外基質為靶標不僅可抑制血管平滑肌細胞向內膜下遷移、增殖和基質重構，而且利用其抗粘附作用，還可有效阻止循環血中的單核細胞在損傷部位粘附、聚積，兼具有抗血栓作用。如果在支架植入術的同時，局部涂層藥物支架聯合靜脈注射用藥，可達到抑制再狹窄的治療效果。骨質疏松是老年人的常見疾病，其發病率位居各病之首，目前尚無治療該疾病的有效藥物。鑒于OPN具有抑制鈣鹽沉積、促進溶骨的作用，應用OPN小分子拮抗劑中和內源性OPN，可作為骨質疏松的預防與治療用藥。本項目研制的OPN抑制劑系列藥物是課題組在多年研究工作的基礎上篩選出的一種基質蛋白。以此為基本原料，采用生物高科技手段研制而成，藥物作用的靶標在細胞外基質，而作用的終端則是細胞，通過阻斷內源性OPN活性，達到抑制細胞黏附、遷移與增殖的目的。其藥理機制與臨床現有同類藥物不同，后者多以血管平滑肌細胞作為靶標。該類藥物的研制成功與臨床應用，從理論上開創了心血管病治療的新途徑。從藥物研制的設計思路上，利用人、鼠OPN結構的高度同源性，以鼠OPN為抗原，激活致敏人單核細胞，進而構建噬菌體人源抗體庫，并從中篩選出高活性與特異性的人源OPN單鏈抗體，簡化了人源抗體的制備程序。
本發明藥物新穎，可用生物工程方法生產，其工藝合理，用于防治血管再狹窄，動脈粥揮硬化和骨質癥具有較好的療效，且具有不易復發、安全可靠、無毒副作用的特點。
實施例1人源抗OPN單鏈抗體的生產。
1、噬菌體人源抗體庫的構建分離PTCA后患者外周血單核細胞，以大鼠OPN為抗原在體外致敏后，經EBV轉化，富集分泌特異性抗體的B細胞，提取總RNP。將抗體重鏈、輕鏈可變區基因片斷與編碼十五肽(Gly4Ser)3的DNA接頭經重組PCR組裝在一起，構建噬菌體抗體庫。
2、用人OPN從噬菌體抗體庫中篩選抗OPN單鏈抗體取硝酸纖維素膜浸泡于(70ug/ml)的人OPN溶液中，室溫放置吹干，放入聚丙烯塑料平皿中，取2ml噬菌體懸液加入平皿內，室溫下輕搖1～2小時，用PBS洗去未結合噬菌體，換用2ml洗脫緩沖液，在室溫下溫育10分鐘，以洗脫與OPN結合的噬菌體。收集洗脫液，用中和緩沖液調節pH至7.0～8.0，重復洗脫，所洗脫的噬菌體用以感染對數生長期的E.coli，對噬菌體進行擴增，取上清液進行ELISA，檢測淘選出的噬菌體展示單鏈抗體的活性和抗體的特異性。
3、鏈抗體的表達與鑒定噬菌體懸液感染E.coliHB2151，用含青霉素、葡萄糖的LB培養液擴大培養，以IPTG為誘導劑誘導單鏈抗體表達，提取周質蛋白，通過SephadexG-75進行純化。用SDS-PAGE鑒定抗體的分子量。
4、短肽庫中OPN拮抗劑的篩選與生物學活性的鑒定以固相化OPN淘篩噬菌體十二肽庫，采用ELISA篩選陽性克隆，用細胞粘附與遷移抑制實驗鑒定其活性，用競爭抑制實驗鑒定其特異性和親和力。
關于生產抗OPN單克隆抗體、抗OPN多克隆抗體方法均為常規方法。
通過動物試驗和藥理試驗，本發明具有確切的療效。①已構建成功的人OPNcDNA高效真核表達載體，并證實可在CHO細胞中穩定表達和分泌，從無血清培養三天的培養基中可回收OPN產物量達2mg/ml，經DEAE-cellulose柱層析純化，毛細管電泳鑒定純度達98％，SDS-PAGE顯示純化OPN的分子量為66kDa，高效液相色譜分析其氨基酸組成與標準OPN一致，同時，從培養的人和大鼠血管平滑肌細胞培養液也同樣可獲取高產量OPN(1.6g/ml)，并建立了可提高OPN分泌量、雜蛋白少的細胞培養條件。②OPN對細胞粘附的影響利用96孔板進行細胞粘附試驗，觀察OPN對細胞粘附能力的影響。結果表明，在一定范圍內，血管平滑肌細胞的粘附率隨著OPN濃度的增加及作用時間的延長而升高，具有明顯的量一效和時一效關系；當加入抗OPN抗體封閉其活性位點后，細胞粘附率下降，提示OPN是促細胞粘附的活性因子。③OPN對細胞遷移的影響用32ug/ml的OPN刺激平滑肌細胞24小時，細胞可發生平面遷移，所遷移的距離是未刺激組的2.1倍。④OPN的化學趨化作用用Boyden小室檢測證實，OPN的化學趨化作用在一定條件下呈現量一效依賴關系。⑤已構建成功全人源噬菌體初級抗體庫。用純化的人源OPN經過3次親和淘篩，回收的特異噬菌體通過ELISA鑒定篩選的克隆，，以讀取的A405數值3倍于陰性對照為陽性標準。從中挑選出5株陽性噬菌體克隆；其中有2個克隆對OPN是特異的，其余3個克隆對其他基質成分均有反應，PCR鑒定摻入噬菌體的的抗體基因片段長度為全長ScFV基因(～800bp)。⑥利用被鼠源OPN致敏的人B淋巴細胞構建了人抗體庫。⑦用雜交瘤技術已建立了5株陽性克隆。⑧動物模型的建立與藥效觀察，用球囊內皮剝脫術建立血管再狹窄模型，術后立即靜脈注射抗OPN單抗，隔日一次，治療30天，處死動物，病理切片證實，與對照相比較，用藥組血管內膜增生不明顯，治療有效率達80％，治愈率20％。⑨正常人和腫瘤患者血漿OPN水平測試，取20名健康成人和消化系腫瘤患者40人(胃癌10人，直腸癌8人，結腸癌7人，食管癌10人，肝癌5人)，抽取靜脈血，用抗OPN單抗檢測血漿OPN水平，結果為正常人血中檢測不到OPN，腫瘤病人血OPN水平為12～48nmol/L，伴有腫瘤轉移者則OPN水平升高更明顯。⑩體內外試驗證實，抗OPN抗體可以抑制破骨細胞的功能，防治骨質疏松癥。
注OPN骨橋蛋白CHO中國倉鼠卵巢細胞SCFV單鏈杭體PBS磷酸鹽緩沖液PCR聚合酶鏈反應
權利要求
1.一種抗骨橋蛋白抗體類藥物，其特征在于該藥物為人源抗體骨橋蛋白單鏈抗體、抗骨橋蛋白單克隆抗體或抗骨橋蛋白多克隆抗體，將其制成各種藥物劑型。
2.一種抗骨橋蛋白抗體類藥物的生產方法，其特征在于a、首先構建噬菌體人源抗體庫，分離PCTA后患者外周血單核細胞，以大鼠OPN為抗原在體外致敏后，經EBV轉化，富集分泌特異性抗體的B細胞，提供總RNA；將抗體重鏈、輕鏈可變區基因片斷與編碼十五肽(GIY4Ser)的DNA接頭經重組PCR組裝在一起，構建噬菌體抗體庫；b、以KOPN從菌體抗體庫中篩選抗OPN單鏈抗體，取硝酸纖維素膜浸泡于OPN溶液中，吹干，放入聚丙烯塑料皿中，取噬菌體懸液加入皿內，室溫下輕搖，用PBS洗去未結合噬菌體，換用洗脫緩沖液，以洗脫與OPN結合的噬菌體，收集洗脫液，用中和緩沖液調節PH至7.8-8.0，所洗脫的噬菌體用以感染對數生長期的E.coli，對噬菌體進行擴增，即制得人源抗骨橋蛋白單連抗體。
3.一種根據權利要求1所述的抗骨橋蛋白抗體類藥物的用途，其特征在于用于防治血管再狹窄、動脈粥樣硬化和骨質疏松癥。
全文摘要
本發明涉及生物制度技術領域。它是用生物工程法生產人源抗骨橋蛋白單鏈抗體,抗骨橋蛋白單克隆抗體和抗骨橋蛋白多克隆抗體,將其制成各種藥物劑型,用于防治血管再狹窄、動脈粥樣硬化和骨質疏松癥。具有物質新穎,生產方法獨特合理,療效較高,不易復發、安全可靠、無毒副作用的特點,市場應用前景廣闊。
文檔編號A61K39/395GK1351888SQ0114053
公開日2002年6月5日 申請日期2001年11月10日 優先權日2001年11月10日
發明者韓梅, 溫進坤 申請人:河北醫科大學