專利名稱：用于治療因肉孢子蟲屬、新孢子蟲屬、弓形蟲屬及等孢子蟲屬引起的疾病的吡喹酮化合物的制作方法
技術領域：
本發明涉及一種治療動物因寄生蟲感染引起流產(abortigenic)或神經性疾病的吡喹酮組合物，更特別地，本發明涉及一種用于治療因寄生蟲，例如球蟲引起的哺乳動物流產或神經性疾病的吡喹酮組合物。
雖然包括吡喹酮(2-酰基-4-氧代-六氫-4H-吡嗪[2，1-a[異喹啉衍生物]在內的其它技術上有關的化合物已公開用作治療寄生蟲病，但該公開并未對該類化合物用于治療可穿過血腦屏障或胎盤屏障的寄生蟲病有任何教導或建議。通常，用吡喹酮單藥或與其它化合物組合制成驅蟲藥組合物，用于治療絳蟲和線蟲感染等。參見美國專利4,001,411，4,447,414，和5,824,653。
美國專利5,663,155公開了吡喹酮用于防治寄生蟲感染引起的疾病，例如瘧疾、錐蟲病、利什曼原蟲、血吸蟲病和象皮病。該專利還提出可能用于治療限于血液、淋巴和組織中寄生蟲感染的吡喹酮。文中專門提到弓形蟲和肉孢子蟲在肌肉組織和腸道中的感染。沒有提及有關防治弓形蟲，肉孢子蟲、新孢子蟲或等孢子蟲進入到成年哺乳動物腦中或通過胎盤屏障感染胎兒中樞神經組織、導致流產或新生兒發育不全。
通常，三嗪酮類的作用模式是攻擊發現在消化道和腸壁細胞媒介階段的寄生蟲，造成寄生蟲內質網、核周腔和線粒體膨脹。這種據說的擾亂核分裂能力造成裂殖體和微配子體保持較小，僅分別形成幾個裂殖子和微配子體。報道的最終結果是寄生蟲穿透新的哺乳動物細胞后階段能力的缺失，有效阻礙了寄生蟲在宿主的復制。
如公開在美國專利5,663,155(同上)所示，吡喹酮的作用模式與寄生蟲酶解過程的中斷有關，其涉及嘌呤衍生物和嘌呤樣化學結構化合物的代謝。寄生蟲對這些過程的干涉非常敏感，因此，專門針對于這些過程的組合物可以選擇性地消除寄生蟲感染。服用吡喹酮以攻擊肌肉組織、腸道或血液中感染的寄生蟲。但沒有提到治療中樞神經系統(腦和脊髓)的寄生蟲或能穿過胎盤屏障的寄生蟲。
雖然自1970年以來，疑為引起哺乳動物神經系統的疾病和/或流產的原蟲方面的技術領域受到關注，但已證實難于成功分離和體外培養這些原蟲。如，從腦或腦脊髓液中成功分離寄生蟲直到80年代末才完成。然而，一旦確定了神經性疾病是由腦部感染的原蟲引起，及流產是因感染了胎兒的原蟲造成，就需要可有效穿過血腦屏障或胎盤屏障，且無有害副作用的抗原蟲藥物。極少有藥物可以穿過哺乳動物血腦屏障或胎盤屏障。不幸的是，現有技術已知的有許多可以穿過哺乳動物血腦屏障或胎盤屏障，有效治療腦中寄生蟲感染的藥物均產生有害副作用。用這些藥物要冒很大風險。因此，至今沒有有效藥物證實可以對這種神經系統的疾病和/或流產疾病進行有效治療。
值得注意的是，按美國專利5,663,155所公開的吡喹酮作用方式，涉及到對影響嘌呤代謝的酶作用范圍很寬，可以預計，如果用于治療哺乳動物腦中寄生蟲感染，該化合物可能也會產生有害副作用。
以下簡介可用吡喹酮治療的寄生蟲病。馬原蟲腦脊髓炎(EPM)是馬的神經性疾病，經歷過重負的年輕馬尤其容易患病(如良種的賽馬和純種的表演馬)，因此，這種病對馬的產業有很大的經濟利益上的影響。最初認識到EPM病是在七十年代，直到1991年，才從一匹患EPM馬中培養出并命名為筋脈肉孢子蟲(Sarcocystis neurona)。在1997，一種新孢子蟲屬，現命名為修氏新孢子蟲的寄生蟲從一匹患EPM馬腦中分離。因此現在提出，EPM可能僅由這種新認定的生物體引起，或僅由筋脈肉孢子蟲引起，或由這兩種生物體結合引起。
另一種寄生球蟲，剛地弓形蟲已被認識有一段時間了，是從貓的腸道和肌肉組織中首次分離出的。這種寄生蟲明確的宿主是貓，貓可以長期攜帶此生物體，散布卵囊給其它動物，如牛、羊、豬和人類。羊、牛和人類的感染與流產和影響中樞神經系統的先天性疾病有關。近來還發現，感染前血清反應陰性的懷孕母貓，感染后發生流產和新生小貓畸形與之有關。非貓科宿主，如牛、羊、豬和人類不產生卵囊，但也會通過速殖子和緩殖子從肌肉和腦部入侵而患病，發生神經性疾病的臨床癥狀及帶有胎兒缺陷的流產。已報道，有60％的貓對剛地弓形蟲呈血清學反應陽性。再有，目前尚無有效的治療或預防弓形蟲病的方法。
然而，1988年首次從狗分離到的另一種寄生球蟲，犬新孢子蟲可使動物發生神經性和流產疾病。以前將它與剛地弓形蟲相混淆。由此寄生蟲引起的疾病主要嚴重發生在經胎盤感染的小狗，其特征是發生漸行性上移的癱瘓，尤其是后肢。也可能發生多肌炎和肝炎。最近認識到該病是引起流產的主要病原體并與導致新生牛犢肢殘的神經性缺陷有關。用顯微鏡可以觀察到在流產胎兒的腦、脊髓和心臟中非化膿性的腦炎和心肌炎。犬新孢子蟲的明確的宿主最近被定為是狗。目前對于狗或牛的犬新孢子蟲的或馬的修氏新孢子蟲仍無滿意的治療或預防辦法。
綜合以上現有技術，包括前引的參考文獻，對于用吡喹酮治療感染了球蟲，更明確地說，感染了引起流產或神經性疾病的肉孢子蟲科原蟲的動物，而不產生難以忍受的副作用，并未給出建議或指導。本發明對遭受寄生蟲病感染，出現神經性和流產性疾病的動物提供了一個改進的安全治療方法。
此處所用的術語“藥物有效量”表示，所服用的吡喹酮或其一種衍生物的量足以在體內外抑制寄生蟲生長，而不會造成用藥動物產生不良反應。代表性的所述寄生原蟲是引起神經性疾病和/或流產性疾病的球蟲亞綱的原蟲。有效量的藥物控制感染組織中的寄生蟲，因而增進了動物的健康。而且，藥物有效量的吡喹酮或其衍生物能夠穿過血腦屏障或胎盤屏障去治療感染了中樞神經系統的寄生蟲，而不引起被治療哺乳動物產生不良反應。
另外，本發明還包括一種對感染了引起流產或神經性疾病且對吡喹酮治療敏感的寄生蟲的動物進行補救性預防(metaphylactica11y)治療的方法。該療法包括按有效的補救性預防治療方案給所述動物服用吡喹酮。術語“有效的補救性預防治療方案”表示按計劃間隔時間定期服用吡喹酮化合物或其衍生物，經較長時間，直到所述動物戰勝了入侵的寄生蟲，比如，產生一種保護性的免疫反應或清除該寄生蟲。例如代表性的方式是有效控制寄生蟲和預防臨床癥狀出現。也可使動物服用該有效的補救性預防劑量的藥物長達5年的時間或使動物終生服藥，特別是對于那些難于控制的寄生蟲。
本發明還包括一種一次性大劑量治療動物的方法。該方法包括給所述患有寄生蟲引起的神經性或流產性疾病的動物一次性服用大劑量的藥物有效量的吡喹酮化合物或其衍生物。術語“一次性大劑量”指僅一次服用控制引起疾病的寄生蟲的量。該量比用于治療或預防的量高出很多，并可有效控制引起疾病的寄生蟲，而且同樣不產生有害作用，例如毒性。因此吡喹酮的一次性大劑量大于10mg/Kg。本發明將對此和其它內容作更詳細描述。發明詳述如上所述，本發明涉及一種治療哺乳動物感染或患由寄生蟲引起的可用吡喹酮化合物或其衍生物進行治療的神經性或流產性疾病的組合物或方法。該方法包括給所述哺乳動物服用含有藥物有效量的吡喹酮的組合物。用于說明，但非進行限制的動物可以是馬、牛、貓、犬、豬、羊、鳥類、昆蟲和人類。所述感染或致病的寄生蟲是可引起神經性或流產性疾病的肉孢子蟲科球蟲。因此，用于說明，但非限制性實例選自肉孢子蟲屬、新孢子蟲屬和弓形蟲屬。所述的肉孢子蟲科球蟲代表性地選自筋脈肉孢子蟲、修氏新孢子蟲、犬新孢子蟲和剛地弓形蟲。所述原蟲感染或疾病包括但不限于EPM、新孢子蟲病和弓形蟲病。
在本發明的實踐中，治療寄生蟲感染或由本文所述的原蟲引起的疾病，可以緩解神經性或流產性疾病的癥狀。通常，這些癥狀包括肢殘、共濟失調、癱瘓、流產、新生兒體弱和其它有關疾病。作為治療，使有上述疾病癥狀的動物服用吡喹酮化合物。通常治療期為28-90天，優選是28-60天。根據所患疾病的嚴重程度和致病寄生蟲的種類，治療方案可設定為每日投藥一次、每日二次或多次，或隔日一次，或者甚至每周投藥一次。然而在某些情況下，治療方案的持續時間不確定，有時需要動物終生用藥。在一種動物被強抗性品系寄生蟲感染的情況下才需用后一種治療方案。然而，治療可以根據需要延長較長時間，直到病狀消除。優選的治療方案是每日用藥一次，治療28天。優選的治療用藥劑量范圍是1mg/Kg-100mg/Kg，優選的范圍是2.5mg/Kg-25mg/Kg.
對于補救性預防療法，是對已被感染的動物進行治療，以保護它們對抗疾病的臨床癥狀。此治療最終導致這些動物獲得控制寄生蟲的能力，如建立有效免疫反應，以對抗進一步感染，無需再服用吡喹酮。這種補救性的預防治療措施也和本發明一樣，是按計劃好的間隔時間使用吡喹酮化合物(有效的補救性預防治療方案)以控制感染動物的原蟲。因此，所述有效的補救性預防治療方案是通過服藥以減低原蟲致病的能力，比如，殺死它們，或減少其數量。實質上，該有效的補救性預防治方案可大約一個月治服藥一次、動物終生服藥或直到產生內在的清除機制，如有效的免疫反應來保護動物免受進一步感染。后一種情況可在5年之內或更短時間內產生。正如所了解的，補救性預防療法乃基于這樣的認識，即當動物感染了本文所述原蟲后，要經過相當長的時間之后(如2-6月)才表現出臨床癥狀，例如神經癥狀或流產。相反，腸內原蟲感染在感染后短時間就表現出癥狀。根據本發明，補救性預防療法可防止寄生蟲在體內固著并引起臨床疾病。該方案是一個間歇式的用藥計劃，即約每月一次、每兩月一次或每兩周一次投藥，劑量為約1.0-100mg/Kg，優選劑量約為1.0-25mg/Kg，更優選劑量約為2.5-10mg/Kg。在原蟲抗性極強的情況下使用高劑量(如動物被抗性株原蟲感染)。所需劑量和治療時間由具有本專業常規技能的人來決定。對于患有EPM的馬或患有新孢子蟲病的牛和狗，優選的治療方案是每28天投以約1.0-25mg/Kg吡喹酮或其衍生物，更優選劑量約為2.5-10mg/Kg。
對于一次性大劑量治療，吡喹酮以高于10mg/Kg至約100mg/Kg的藥物有效量用藥。本發明的一個獨特的特點是本發明所用的化合物是無毒的，所以可以用很大的劑量。大劑量的優點是不需重復用藥。
不受任何特別的理論限制，據信所述的治療方法預想不到的成功歸功于吡喹酮可穿過血腦屏障或胎盤屏障的能力。相信本發明的化合物很容易穿過血腦屏障也能穿透胎盤，殺滅腦中和腦脊髓液/脊髓中的原蟲。還發現即使在此處所述的一次性大劑量治療方案中服用所需大劑量時，此類化合物也無毒性和致突變性。
迄今為止，還沒有得到如此成本低、容易服用的藥物，用于有效治療和防治哺乳動物這些疾病，而不產生不可接受的副作用，如毒性或致突變性。
在本發明的實踐中，吡喹酮可以配制成任意方便的劑型便于動物服用。在此，首選的制劑是適于口服的，可以是懸浮劑、片劑、膠囊、凝膠體、糊劑、丸，或以粉劑、顆粒或小球形式的制劑。最優選的口服制劑是糊劑或食物添加劑。其它類型的制劑是注射劑、局部用藥、肌肉和粘膜內用藥，或者用其它本領域技術上已知的給藥途徑。以灌注形式的局部用藥也是優選的。
經典的藥物可接受的載體和輔劑可用于本發明的制劑。其實例可以是選自下列的增稠劑聚羰乙烯，無機增稠劑，例如硅酸鹽、膨潤土或硅膠；有機增稠劑，例如脂肪醇或脂肪酸酯，以及選自聚乙二醇和結合有聚羰乙烯的十二烷基硫酸鈉的濕潤劑。在此用于制備糊劑的增稠劑是聚羰乙烯974P和聚羰乙烯934P。也可以采用選自對羥基苯甲酸酯類、醇類和醛類的防腐劑。可以是液體、固體或氣體物質，另外它們是惰性的或是醫學上可接受的，及與活性成分相容的。
將本發明的糊劑用于治療寄生蟲病時有驚人的效果。尤其令人驚奇的是，本發明的糊劑可以神經有效劑量投放。可以有效地使吡喹酮穿過血腦屏障或胎盤屏障，攻擊已入侵在腦中或感染了懷孕動物胎兒的寄生蟲。為方便，在此提供一個優選的糊劑配方及如何制備的實例。根據本發明，優選的糊劑含有微粉化的吡喹酮懸浮液、聚乙二醇、一種增稠劑，例如聚羰乙烯，防腐劑例如對羥基苯甲酸甲酯和對羥基苯甲酸丙酯，及水。糊劑的制備可以將水(典型地用純水)和丙二醇混合，加熱該混合物至70℃，并在此溫度下加入防腐劑。當聚羰乙烯，優選地以聚羰乙烯974P或934P形式加入后，將產生的混合物冷卻至室溫，最后加入吡喹酮。完全混合后，用氫氧化鈉調節pH至約6.0。最優選的糊劑包括15％w/w吡喹酮，20％w/w丙二醇，0.5％w/w聚羰乙烯974P，0.14％w/w對羥基苯甲酸甲酯，0.02％w/w對羥基苯甲酸丙酯，0.1％w/w氫氧化鈉，其余為純水。可加入包括葡萄糖、蔗糖、乳糖、果糖、山梨醇、木糖醇、人造甜味劑和糖蜜等甜味劑，以改善口味。此外，酵母和肝粉調味劑也可因同樣目的而加入。
本發明通過以下實施例進一步說明，但不限于這些實施例。
實施例1為確定吡喹酮提供的保護范圍，進行了體外試驗。評價了筋脈肉孢子蟲對該化合物的敏感性。使用SN3株筋脈肉孢子蟲試驗了10微克/mL和20微克/mL兩種濃度的吡喹酮。
用牛鼻甲骨(BT)細胞做所有體外試驗。細胞在25cm2長頸瓶中生長至融合狀態，使用RMP1 1640培基，并補充以10％ v/v牛胎血清(FBS)、100單位青霉素(g/mL)、鏈霉素100mg/mL和5×10-2mM2-巰基乙醇。細胞融合后，將其保存在加有減量FBS(2％v/v)的同一培基中。于37℃在含5％二氧化碳和95％空氣的潮濕氣體中進行細胞培養。
為使寄生蟲生長，用寄生蟲感染單層BT細胞，用倒置顯微鏡檢查細胞損傷程度(細胞病理效應，“CPE”)或細胞外存在的許多裂殖子。一旦觀察到有損傷或存在許多細胞外寄生蟲，用5mL吸液管的頂部刮去該單層細胞，將1-3滴含裂殖子的液體移至兩個含新鮮BT細胞的長頸瓶中。每5-10天以此方式將筋脈肉孢子蟲裂殖子傳代一次。
測定吡喹酮效果的試驗是微量單層細胞破裂試驗(MMDA)。該試驗用來測定寄生蟲或化合物對BT細胞是否具有毒性。用96孔平底微量滴定板接種BT細胞，以CPE(細胞病理效應空斑形成)試驗，用所產生的單層細胞測定吡喹酮對裂殖子生成的作用。將寄生蟲(每孔接種50000條筋脈肉孢子蟲)接種在單層細胞上，感染后2小時，將適當濃度的吡喹酮也接種在單層細胞上，未用藥和未感染的單層細胞孔作為寄生蟲對照，用藥但未感染的BT細胞孔作為毒性對照。每組處理重復6次。每天對每孔進行觀察。當未用藥而僅以裂殖子感染的細胞有90-100％溶解時(90-100％ CPE)停止試驗。板上所有孔用磷酸鹽緩沖液(PBS)沖洗并在100％甲醇中固定5分鐘，然后用結晶紫溶液染色，裂殖子造成的破損區或因毒性引起死亡的BT細胞不吸收結晶紫。用ELISA板讀數器測定結晶紫的結合量，這些數據用于確定使細胞破損得到50％抑制的吡喹酮濃度(半數抑制濃度，或IC50)。證實抑制的數據見表1。請注意，10微克/mL的小劑量吡喹酮可抑制51％細胞破裂，吡喹酮濃度在20微克/mL可抑制69％細胞破裂，這表明吡喹酮對治療那些與神經性和流產性疾病癥狀有關的球蟲引起的疾病是有效的，這些疾病包括由筋脈肉孢子蟲、犬新孢子蟲、修氏新孢子蟲、剛地弓形蟲和豬等孢子蟲引起的疾病。此外，吡喹酮對BT細胞沒有毒性。
表1 吡喹酮對筋脈肉孢子蟲的體外效應數據
這些數據表明，在治療患有筋脈肉孢子蟲引起的疾病的哺乳動物時，劑量在2.5-10mg/Kg對神經系統有效。
權利要求
1.一種治療患寄生蟲病哺乳動物的吡喹酮組合物，該寄生蟲病可用吡喹酮化合物進行治療且表現為神經性或流產性疾病，該吡喹酮組合物包括一種藥物有效量的吡喹酮或其衍生物和一種藥物可接受的載體。
2.權利要求1所述的組合物，其中所述疾病由一種球蟲引起。
3.權利要求2所述的組合物，其中所述球蟲為肉孢子蟲屬、新孢子蟲屬、弓形蟲屬和等孢子蟲屬中的一種球蟲。
4.權利要求3所述的組合物，其中所述肉孢子蟲屬的球蟲為筋脈肉孢子蟲，新孢子蟲屬的球蟲為犬新孢子蟲或修氏新孢子蟲，弓形蟲屬的球蟲為剛地弓形蟲，等孢子蟲屬的球蟲為豬等孢子蟲。
5.權利要求4所述的組合物，其中所述的筋脈肉孢子蟲是馬原蟲腦脊髓炎的病原體。
6.權利要求4所述的組合物，其中所述犬新孢子蟲是牛或犬新孢子蟲病的病原體。
7.權利要求4所述的組合物，其中所述修氏新孢子蟲是馬原蟲腦脊髓炎的病原體。
8.權利要求4所述的組合物，其中所述剛地弓形蟲是哺乳動物與弓形蟲有關的流產的病原體。
9.一種治療哺乳動物患有寄生蟲引起的，可用吡喹酮化合物進行治療的神經性或流產性疾病的吡喹酮組合物，包括一種對神經系統有效量的或對胎盤有效量的吡喹酮或其衍生物和一種藥物可接受的載體。
10.一種治療哺乳動物患有寄生蟲引起的，可用吡喹酮化合物進行治療的神經性或流產性疾病的方法，包括給所述哺乳動物服用一種藥物有效量的吡喹酮或其衍生物和一種藥物可接受的載體的組合物。
11.權利要求10所述的方法，其中所述疾病由一種球蟲引起。
12.權利要求11所述的方法，其中所述的球蟲為肉孢子蟲屬、新孢子蟲屬、弓形蟲屬和等孢子蟲屬中的一種球蟲。
13.權利要求12所述的方法，其中所述肉孢子蟲屬的球蟲為筋脈肉孢子蟲，新孢子蟲屬的球蟲為犬新孢子蟲或修氏新孢子蟲，弓形蟲屬的球蟲為剛地弓形蟲，等孢子蟲屬的球蟲為豬等孢子蟲。
14.權利要求13所述的方法，其中所述的筋脈肉孢子蟲是馬原蟲腦脊髓炎的病原體。
15.權利要求12所述的方法，其中所述犬新孢子蟲是牛或犬新孢子蟲病的病原體。
16.權利要求12所述的方法，其中所述修氏新孢子蟲是馬原蟲腦脊髓炎的病原體。
17.權利要求12所述的方法，其中所述剛地弓形蟲是哺乳動物與弓形蟲有關的流產的病原體。
18.一種治療哺乳動物患有寄生蟲引起的，可用吡喹酮化合物進行治療的神經性或流產性疾病的方法，包括給所述哺乳動物服用一種對神經系統有效量的或對胎盤有效量的吡喹酮或其衍生物和一種藥物可接受的載體。
19.對感染了一種寄生蟲的哺乳動物進行補救性預防治療的方法，所述寄生蟲是神經性或流產性疾病的病原體，并可用吡喹酮化合物進行治療；該方法包括對所述哺乳動物使用一種補救性預防治療有效方案，該方案是服用藥物有效量的吡喹酮化合物或其衍生物和一種藥物可接受的載體的組合物。
20.權利要求10所述的方法，其中所述組合物以2次或多次分次劑量服用。
21.權利要求10所述的方法，其中所述組合物的給藥劑量約為1.0-100mg/Kg。
22.權利要求21所述的方法，其中所述組合物的給藥劑量約為1.0-50mg/Kg。
23.權利要求10所述的方法，其中所述組合物以高于50mg/Kg的劑量一次性大劑量服用。
全文摘要
治療或補救性預防易受感染哺乳動物或被感染哺乳動物患有寄生蟲引起的神經性或流產性疾病，例如肉孢子蟲病、新孢子蟲病或弓形蟲病、等孢子蟲病的組合物和方法，所述疾病可用一種吡喹酮化合物進行治療，通過服用含藥物有效量的吡喹酮或其衍生物的組合物，包括補救性預防和一次性大劑量治療方案。
文檔編號A61K31/4745GK1452489SQ01810091
公開日2003年10月29日 申請日期2001年5月18日 優先權日2000年5月23日
發明者T·J·肯尼迪 申請人:美國拜爾公司