專利名稱：一種牛新孢子蟲病的檢測方法及應用的制作方法
技術領域：
本發明屬于動物疫病檢測領域，具體涉及原蟲寄生蟲病的檢測方法，特別是涉及一種牛新孢子蟲病的檢測方法及應用領域。
背景技術：
牛新孢子蟲病(Neosporosis)是由犬新孢子蟲(Neospora caninum)寄生在宿主 體內引起的一種原蟲病。該病可垂直傳播，是導致奶牛流產的主要病因之一，給畜牧業造成 了很大的經濟損失。該病世界范圍內分布廣泛。從2001年以來，先后在北京、山西、青海、 河北、新疆等地區的奶牛(牦牛)血清中檢出了犬新孢子蟲抗體的存在。迄今為止，還沒有 防治此病的有效藥物和疫苗，因此，良好的檢測技術是有效控制本病的良好方法。目前較為常用的檢測方法有間接熒光抗體試驗(IFAT)、免疫組織化學檢測法 (IHC)、親和素-生物素-過氧化物酶染色法(ABC)、酶聯免疫吸附試驗(ELISA)、乳膠凝集 試驗(NAT)和免疫印跡法(IB)等，傳統方法在牛新孢子蟲病的防治中發揮了重要作用，但 存在著一些實驗操作復雜，檢測周期長，不能檢出潛伏感染和早期感染的患病動物等弊端。 隨著分子生物學技術的迅速發展，熒光PCR檢測技術的應用極大的提高了檢測效率和檢測 靈敏度。但由于樣品中存在大量復雜的未知成分，以及樣品處理過程中，一些物質的殘留會 影響PCR擴增，使反應測得的靈敏度降低甚至造成假陰性結果，對于熒光PCR檢測，無法正 確確定目的基因的拷貝數。通過添加內標共擴增模板的方法對檢測結果進行質量控制已得 到廣泛的認可。經檢索，國內外也未見采用搭橋法PCR擴增構建了內標共擴增模板和熒光探針， 構建了檢測靈敏度高，特異性好，操作方便且能夠指示并校準假陰性結果，提高準確率的檢 測牛新孢子蟲病的熒光定量PCR方法的報道。因此，探索和研究檢測靈敏度高，特異性好， 操作方便且能夠指示并校正假陰性結果的方法，對于及時準確有效的檢測牛新孢子蟲病， 保護畜牧業健康發展、促進我國農產品出口和保護我國在國際貿易中的良好形象等方面均 具有重要意義。

發明內容
針對目前未見有關檢測靈敏度高，特異性好，操作方便且能夠指示并校正假陰性 結果，提高準確率的檢測牛新孢子蟲病的方法。本發明提供了一種對牛新孢子蟲病靈敏、高 效、快速、準確檢測的方法。本發明的目的在于提供了一種檢測靈敏度高、特異性好、試驗周期短，且能夠指示 并校正假陰性結果，確保PCR檢測準確性的牛新孢子蟲病檢測方法。本發明通過引物和探針設計，用搭橋法PCR擴增，獲得了 N. caninum熒光定量PCR 擴增內標模板，并對內標模板的添加量和反應條件進行了優化，建立了含有內標物的熒光 定量PCR檢測體系，從而實現對牛新孢子蟲病的靈敏、高效、快速、準確檢測。本發明具體提供了一種牛新孢子蟲病確證和準確定量的快速檢測方法。
本發明的技術方案通過采用在PCR反應體系中加入指示假陰性的擴增內標 (internal amplification control, IAC)，通過堿基重排、引物設計和搭橋法PCR擴增，構 建了一條IAC片段，經條件優化，成功的構建了含有內標的熒光定量PCR反應體系，可以顯 示抑制成分的存在或指示假陰性的發生，實現對試驗過程實施監測，確保檢測質量，從而建 立了一種牛新孢子蟲病的檢測方法。本發明進一步提供了一種牛新孢子蟲病檢測方法，具體步驟如下1.引物和探針的設計與合成根據N. caninum Nc-5基因序列設計擴增出138bp的特異性引物Np2和Nr2兩條， NTpro熒光探針一條，模板構建引物Npl和Nrl兩條，其中Npl、Nrl位于Np2、Nr2外側，擴 增出長度為338bp的片段。將探針NTpro序列進行重排，利用堿基突變原理，設計引物Ncl 和Nc2，通過搭橋法PCR擴增，構建了內標探針NCpro。2.目標DNA模板的制備牛抗凝全血或牛流產胎兒組織病料按照常規報道的全血基因組DNA提取試劑盒 或組織樣品中基因組DNA提取試劑盒進行操作，以犬新孢子蟲全基因組DNA為模板，NpU Nrl為擴增引物，反應條件為94°C變性5min ;94°C 30s, 62°C 20s, 72°C 30s, 35個循環；最 后在72°C延伸lOmin。擴增產物經凝膠純化回收，連接到pMD18_T載體上，轉化DH5 α感受 態細胞，提取質粒，經酶切、PCR及測序鑒定后，獲得目標模板pMDIS-NT，本發明簡稱NT。3.搭橋法PCR擴增和內標探針的設計以質粒NT為模板，分別采用引物Npl、Ncl和Nc2、Nrl為配對引物進行PCR擴增， 擴增條件為94°C 5min ；94°C 30s, 62°C 20s, 72°C 30s，35 個循環；72°C IOmin0 擴增產物分 別命名為Nplcl、Nc2rl ；將Nplcl、Nc2rl純化回收后等量混合物作為模板，用引物Npl和 Nrl進行PCR擴增，反應條件為94°C變性5min ；94°C 30s，62°C 20s，72°C 30s，35個循環；最 后在72°C延伸lOmin。將擴增后的產物純化回收并連接到pMD18_T載體上，轉化DH5 α感 受態細胞，提取質粒，經酶切、PCR及測序鑒定正確后，獲得內標模板PMD18-NC，本發明簡稱 NC04.單重熒光PCR擴增體系的建立以NT和NC為模板，分別以Np2、Nr2、NTpro和Np2、Nr2、NCpro為引物和探針進行擴 增，然后以濃度分別為IO9 10°拷貝/ μ L的NT與NC混合物為模板，以Npl、Nrl、NTpro和 NCpro為引物和探針進行熒光PCR共擴增，經比較，最終共擴增體系中內標模板添加濃度為 每個反應 IO2 拷貝，Mg2+2. 5mmol/L，dNTP 各 0. 3mmol/L，引物各 0. 5mmol/L，探針各 0. 2mmol/ L，擴增條件為 50°C，2min，l 個循環；95°C，5min，1 個循環；95°C 15s，57°C 45s，45 個循環。本發明中，參照基因庫中編號為X84238. 1的N. caninum Nc-5基因序列設計引物 和熒光探針，該N. caninum Nc-5基因序列長1205bp，本領域普通技術人員可以通過公眾的 渠道獲知。本發明中，以N. caninum Nc_5基因為模板，用引物Npl和Nrl擴增出長度為338bp 的片段，該片段克隆至PMD-18T載體，得到目標模板pMDIS-NT，簡稱NT。本發明中，以NT為模板，用引物Np2和Nr2擴增出長度為138bp的熒光PCR擴增 片段。本發明中，以NT為模板，用引物Npl、Ncl和Nc2、Nrl分別擴增出長度為194bp和168bp片段，命名為Nplcl和Nc2rl。本發明中，以Nplcl、Nc2rl等量混合物為模板，用引物Npl和Nrl進行PCR擴增出 長度為338bp的片段，該片段克隆至PMD-18T載體，得到內標模板pMD18_NC，簡稱NC。同時，本發明充分考慮到，當NC和NT兩模板同時擴增時，會競爭酶、引物和探針， 對擴增產生影響，對共擴增體系的反應條件和檢測低限進行了優化研究。取濃度分別為 IO9 10°拷貝/ μ L的NT與NC混合物，以Np2、Nr2、NTpro和NCpro為引物和探針進行熒 光PCR共擴增，經優化，共擴增體系中內標模板添加濃度為每個反應IO2拷貝，Mg2+2. 5mmol/ L，dNTP 各 0. 3mmol/L，引物各 0. 5mmol/L，探針各 0. 2mmol/L，TaqDNA 聚合酶為 1. 5u，擴增條 件為 50°C，2min，l 個循環；95°C，5min，1 個循環；95°C 15s，57°C 45s，45 個循環。進一步，本發明牛新孢子蟲病檢測方法的特異性、可重復性檢測進行了確證，并建 立了標準曲線。用本發明提供的擴增體系分別擴增了牛皰疹病毒1型、牛白血病病毒、口蹄疫病 毒、剛地弓形蟲、牛環形泰勒蟲和牛雙芽巴貝斯蟲DNA或cDNA，被測樣品均沒有陽性擴增曲 線，表明該方法具有較好的特異性。用本發明提供的擴增體系，以IO2拷貝/反應的NC模板分別與IO7UO5和IO3拷貝 /反應的NT進行多次重復性擴增檢測，對不同試驗獲得的Ct值標準差和變異系數進行分 析，不同試驗獲得的Ct值變異系數為0. 5% 1. 3%，表明該方法具有較好的重復性。進一步，本發明通過對IO9 10°拷貝/反應濃度的NT與體系中添加濃度為IO2拷 貝的NC共擴增，建立了牛新孢子蟲病熒光PCR共擴增檢測標準曲線。通過實施本發明具體的發明內容，可以達到以下有益效果。1.檢測靈敏度高該方法可檢測到10個拷貝的重組質粒，靈敏度比常規PCR高 1000 倍。2.檢測時間短傳統的蟲體分離法對N. caninum的檢測時間至少要在7d以上，該 發明檢測時間包括樣品前處理到獲得檢測結果在2. 5h之內，比常規的PCR檢測方法至少縮 短 30min。3.特異性好通過對牛皰疹病毒1型、牛白血病病毒、口蹄疫病毒、剛地弓形蟲、牛 環形泰勒蟲和牛雙芽巴貝斯蟲DNA或cDNA樣品檢測，只有N. caninum檢測為陽性。4.重復性好通過對IO7UO5和IO3拷貝/反應3個梯度稀釋的NC-5標準質粒進 行三次重復性檢測，不同試驗獲得的Ct值變異系數為0. 5 1. 3%，均在5%之內。5.穩定性高通過對樣品的重復性檢測，均得到一致性結果。6.污染少與普通PCR檢測相比，整個反應在同一個封閉的管內進行，減少了電泳 步驟造成的污染。7.可進行實時監測和定量檢測通過儀器對每個擴增中產生熒光信號的接收，實 現對整個反應過程的實時監測和結果的定量檢測。8.可指示假陰性結果的發生因該反應體系中的內標模板隨著反應的進行而擴 增，如果被測樣品和內標模板均沒有擴增曲線，說明該檢測結果為假陰性結果。9.流程簡單操作性強，易于掌握，只要具備分子生物學基礎知識，無需良特別的 訓練便能很好完成。10.成本低使用的試劑為分子生物學常用試劑，價格便宜，易于采購，用量少。
11.內標模板設計合理通過堿基重排和搭橋法PCR擴增，構建的內標模板兩端序列與目的基因序列完全一致，只在探針結合部位序列發生了改變，使之只能與內標探針結 合，內標片段的堿基序列與目的基因的性質也基本完全相同，與同一對引物結合，因此內標 片段與目的基因有同樣的擴增效率，確保了共擴增的進行。12.內標模板的添加量合理添加內標模板為100個拷貝的重組質粒，該濃度即能 達到對反應過程的監測，又不影響熒光定量對目標模板熒光PCR的擴增檢測。13.實用價值高實現對試驗過程實施監測，有效的解決了傳統檢測方法中存在 的假陰性結果，可以對實驗室進行質量監控，確保檢測結果的準確性。14.應用效果好用該發明方法對臨床收集的50份抗凝全血和8份流產胎兒組織 用該體系進行檢測，均得到預期結果。15.借鑒意義大該方法的建立，為相關寄生蟲檢驗檢疫技術的研究提供了較好 的借鑒意義，并為規范檢測試劑向標準化水平的發展具有指導借鑒意義。16.應用前景廣闊該方法能夠廣泛應用于檢驗檢疫、畜牧獸醫和養殖單位，為疫 病的有效防控具有重要意義。


圖1所示為N. caninum PCR擴增結果，其中，1為引物Npl/Nrl對N. caninumPCR擴 增產物共 338bp，M 為 DL 2000Marker。圖2所示為重組質粒PCR擴增結果，其中，1，2為引物Npl/Nrl對重組質粒PCR擴 增產物共 338bp，M 為 DL2000Marker。圖3所示為重組質粒酶切鑒定結果，其中，1為重組質粒酶切產生的片段，M為 DL2000Markero圖4所示為Nplcl和Nc2rlPCR擴增結果，其中，1為引物Npl/Ncl對NT的擴增結 果共194bp，2為引物Nc2/Nrl對NT的擴增結果共168bp，M為DL 2000Marker。圖5所示為引物、探針相對模板位置。圖6所示為NT、NC模板熒光PCR擴增部分序列示意圖，其中下劃線的為探針序列。圖 7 所示為 NTpro (Fig. A)和 NCpro (Fig. B)real-time PCR 擴增曲線，其中，1 為 以NT為模板的熒光PCR擴增曲線；2為以NC為模板的熒光PCR擴增曲線；結果表明，探針 針對各自模板具有較好的特異性。圖8所示為IO2拷貝/反應的NC與系列梯度稀釋的NT共擴增曲線，其中，1_10為 IO9-IO0拷貝/反應的NT (Fig. Α)和對應的NC (Fig. B)擴增曲線。圖9所示為共擴增標準曲線。圖10所示為共擴增體系的重復性試驗，其中，1-3分別為107，IO5, IO3拷貝/反應 的NT(Fig.A)和對應的NC(Fig.B)擴增曲線。
具體實施例方式下面，舉實施例說明本發明，但是，本發明并不限于下述的實施例。本發明中選用的犬新孢子蟲基因組DNA、臨床樣品和相關對照樣品，其中犬新孢子 蟲全基因組DNA由中國農業大學提供；牛抗凝全血和流產胎兒組織病料等樣品采自新疆不同牛場；牛皰疹病毒1型、牛白血病病毒、口蹄疫病毒、剛地弓形蟲、牛環形泰勒蟲和牛雙芽 巴貝斯蟲等核酸樣品本領域普通技術人員可以通過公眾途徑獲得。本發明中選用的主要試劑全血基因組DNA提取試劑盒(DPI 102)、DNAzol基因組DNA快速提取試劑 (DP3002)、質粒制備試劑盒(DPlOOl)為百泰克公司產品；pMD18_T載體(DlOlA)、DH5 α感 受態細胞、凝膠純化回收試劑盒(DV805A)、Taq DNA聚合酶(5U/yL)、DL 2000DNA分子量標 準等均為寶生物工程(大連)有限公司產品，引物、探針均由寶生物工程(大連)有限公司 合成。
本發明中選用的主要儀器微量加樣器(Eppendorf)，高速冷凍離心(HITACHI CF16RX)，熒光PCR儀 (ABI7300), PCR 儀(Biometra)，電泳儀(Bio-RAD M0DEL200),數字圖像分析儀(Alpha innotech corporation IS-2200)，Lambda35 紫外分光光度計(PerkinElmer)等。本發明中選用的所有試劑和儀器都為本領域熟知選用的，但不限制本發明的實 施，其他本領域熟知的一些試劑和設備都可適用于本發明以下實施方式的實施。本發明中參照基因庫中編號為X84238. 1的N. canmum Nc-5基因序列設計引物和 熒光探針，本領域普通技術人員可以通過公眾的渠道獲知。實施例一牛新孢子蟲病的檢測1.引物和探針的設計與合成根據N. caninumNc-5基因序列設計擴增出138bp的特異性引物Np2和Nr2兩條， NTpro熒光探針一條，模板構建引物Npl和Nrl兩條，其中Npl、Nrl位于Np2、Nr2外側，擴 增出長度為338bp的片段。將探針NTpro序列進行重排，利用堿基突變原理，設計引物Ncl 和Nc2，通過搭橋法PCR擴增，構建了內標探針NCpro。2.目標DNA模板的制備牛抗凝全血和牛流產胎兒組織分別按照百泰克公司的全血基因組DNA提取試劑 盒和DNAzol提取，按實際說明書操作。以犬新孢子蟲全基因組DNA為模板，用Npl、Nrl為擴增引物，反應條件為94°C變 性5min ；94°C 30S,62°C 20S,72°C 30S，35個循環；最后在72°C延伸lOmin。擴增產物經凝 膠純化回收，連接到PMD18-T載體上，轉化DH5a感受態細胞，提取質粒，經酶切、PCR及測 序鑒定后，命名為pMD 18-NT，簡稱NT。3.搭橋法PCR擴增和內標探針的設計以質粒NT為模板，分別采用引物Npl、Ncl和Nc2、Nrl為配對引物進行PCR擴增， 擴增條件為94°C 5min ；94°C 30S，62°C 20s, 72°C 30s，35 個循環；72°C IOmin0 擴增產物分 別命名為Nplcl、Nc2rl。將Nplcl、Nc2rl等量混合后作為模板，用引物Npl和Nrl進行PCR擴增，反應條件 為94°C變性 5min ；94°C 30S，62°C 20S，72°C 30S，35 個循環；最后在 72°C延伸 lOmin。。將 擴增后的產物純化回收并連接到PMD18-T載體上，轉化DH5 α感受態細胞，提取質粒，經酶 切、PCR及測序鑒定正確后，命名為PMD18-NC，簡稱NC。4.單重熒光PCR擴增體系的建立以NT和NC為模板，分別以Np2、Nr2、NTpro和Np2、Nr2、NCpro為引物和探針進行擴增，dNTP(2. 5mM)用量分別為1 μ L、1. 5 μ L、2 μ L、2. 5 μ L、3 μ L，引物(10 μ Μ)用量分別為 為 0. 25μ L、0. 5μ L、1 μ L、l. 5μ L、2y L，探針(10 μ Μ)用量分別為 0. 25 μ L、0. 5 μ L、1 μ L、 1. 5μ L,2y L, Mg2+(2 5mM)用量分別為 0. 5 μ L、1 μ L、1. 5 μ L、2 μ L、2. 5 μ L，TaqDNA 聚合酶 (5U/ μ L)用量分別為 0. 125μ L、0. 25μ L、0. 5μ L、1 μ L，DNA 模板 1 μ L，Tm 為 56 61°C，循 環參數為40、45和50，優化一項時其他參數不變。進一步，本發明取109 10°拷貝/ μ L濃度的NT與NC混合物，以Np 1、Nr 1、NTpro和 NCpro為引物和探針進行熒光PCR共擴增，經優化，共擴增體系中內標模板NC添加濃度為每 個反應 IO2 拷貝，Mg2+2. 5mmol/L，dNTP 各 0. 3mmol/L，引物各 0. 5mmol/L，探針各 0. 2mmol/L, 擴增條件為 50°C，2min，l 個循環；95°C，5min，1 個循環；95°C 15s，57°C 45s，45 個循環。本發明中的引物代號、序列、位置見表1。其中，參照基因庫中編號為X84238. 1的 N. caninum Nc_5基因序列設計引物和熒光探針，該N. caninum Nc_5基因序列長1205bp，本 領域普通技術人員可以通過公眾的渠道獲知。表1 引物代號、序列、位置及核苷酸數
LocationNucleotide
codeSequence
(X84238.1)Number,bp
"Npl GGGTGTGCGTCCAATCCTGTAAC 445-46718
Nrl CTCGCCAGTCAACCTACGTCTTC 782-75918
T
Np2 GTGGTTTGTGGTTAGTC ATTCG 592-61316
Nr2 GCATAATCTCCCCCGTCATCAG 729-70820
Ncl ATGTGAGCTGGATACGACGGT45
GGAACGAATGACTAACCACAA AC
Nc2 TCCACCGTCGTATCCAGCTCA45
CATGGTGTGGACAGTGTGTCAA T
NTpro FAM-CACGTTGAAATCAGCCTG 615-63828
CGTCAG -ECLIPSE NCpro HEX-TCCACCGTCGTATCCAGC28
TCACAT -ECLIPSE實施例二 目標模板的獲得牛抗凝全血和牛流產胎兒組織分別按照百泰克公司的全血基因組DNA提取試劑 盒和DNAzol提取，按實際說明書操作。選取25yLPCR 反應體系2· 5 μ LlO XBuffer，1. 5 μ L MgCl2 (25mM)， 2 μ LdNTP (2. 5mM)，上、下游引物(10 μ M)各1 μ L，1 μ L犬新孢子蟲基因組DNA，0. 25 μ LTaqDNA聚合酶(5U/ μ L)，加ddH20補至25 μ L。PCR反應程序為94°C預變性5min ；94°C變性 30s，62°C退火 20s，72°C延伸 30s，共 35 個循環；72°C延伸 IOmin0
擴增產物用10g/L瓊脂糖電泳，并凝膠純化回收，連接到pMDIS-T載體上，轉化 DH5 α感受態細胞，提取質粒進行PCR、酶切及測序鑒定。1.重組質粒的PCR擴增鑒定篩選電泳時較陰性移動慢的重組質粒10倍稀釋后， 取 1 μ L 為模板，加入 2. 5 μ L IOXPCR 緩沖液，1. 5 μ L MgCl2 (25mM)，2 μ LdNTP (2. 5mM)混合 物，0. 25 μ L Taq DNA聚合酶(5u/μ L)，上、下游引物(ΙΟμΜ)各1 μ L，補水至25 μ L體積進 行PCR擴增，擴增條件同上，10g/L瓊脂糖凝膠電泳檢測。2.重組質粒的酶切鑒定在0. 2mL管中加入IOXK Buffer 1 μ L, BamH I和 HindIII酶(15u/y L)各0.3 μ L，質粒DNA 4 μ L，滅菌水補至10 μ L，離心混合均勻，置37°C 水浴消化2h，65°C水浴IOmin滅活內切酶，加入2 μ L6X上樣buffer，10g/L瓊脂糖凝膠電 泳檢測。3.重組質粒的測序將PCR擴增、酶切鑒定均為陽性的質粒克隆，過夜培養，提陽 性質粒測序。瓊脂糖凝膠電泳表明，以N. caninum全基因DNA為模板，Npl，Nrl為引物，擴增出 大小相符的338bp片段，重組質粒經引物Npl、NrlPCR擴增和酶切鑒定均得到338bp片段， 測序鑒定均正確。經鑒定正確的重組質粒即為目標模板，命名為PMD18-NT，簡稱NT。結果 參見附圖1、2、3。實施例三內標模板的構建以質粒NT為模板，分別采用引物Npl、Ncl和Nc2、Nrl為配對引物進行PCR擴增， 擴增條件為94°C 5min ；94°C 30S，62°C 20s, 72°C 30s，35 個循環；72°C IOmin0 擴增產物分 別命名為Nplcl、Nc2rl。以質粒NT為模板，分別采用引物Npl、Ncl和Nc2、Nrl為配對引物進行PCR擴增， 25μ L 反應體系，其中 2. 5μ L 10XPCR 緩沖液，1.5yL MgCl2 (25mM), 2 μ LdNTP (2. 5mM)混 合物，0.25 μ L Taq DNA聚合酶(5u/μ L)，上、下游引物(10 μ Μ)各1 μ L，模板1 μ L。擴增 條件為:94°C 5min ；94°C 30S，62°C 20s, 72°C 30s，35 個循環；72°C IOmin0 分別擴增出大小 為194bp和168bp的片段，并命名為Nplcl和Nc2rl，參見附圖4。將Nplcl、Nc2rl等量混合后作為模板，用引物Npl和Nrl進行PCR擴增，反應體 系和擴增條件同實施例一、二。將擴增后的產物純化回收并克隆至PMD18-T載體，同實施例 一、二轉化DH5a感受態細胞，提取質粒，經酶切、PCR及測序鑒定正確后，命名為pMD18-NC， 簡稱NC。Ncl和Nc2拼接部分即為內標探針序列。各引物、探針相對模板位置及內標模板構建圖參見附圖5。NT、NC熒光PCR擴增部 分序列如下，可參見附圖6。實施例四單重熒光PCR擴增體系的建立以NT和NC為模板，分別以Npl、NrU NTpro和Npl、NrU NCpro為引物和探針進 行擴增，25 μ L反應體系，其中Mg2+L 5mmol/L，dNTP各0. 2mmol/L，引物各0. 4 μ mol/L，探針 0. 2 μ mol/L, Taq 酶 1. 25u，模板 1 μ 1，擴增條件為 50°C，2min, 1 個循環；95°C，5min, 1 個循 環；95°C 15s，57°C 45s，45個循環。結果表明，探針針對各自模板具有較好的特異性，擴增 曲線參見附圖7。
實施例五共擴增檢測低限的測定當NC和NT兩模板同時擴增時，會競爭酶、引物和探針，對擴增產生影響，應該重新 研究共擴增體系的反應條件和檢測低限。取IO9 10°拷貝/ μ L濃度的NT與NC混合物，以Np 1、Nr 1、NTpro和NCpro為弓| 物和探針進行熒光PCR擴增。由于NC與NT在同一反應中進行擴增，檢測引物也相同，二 者會對底物、引物、酶等進行競爭，因此，選擇適宜濃度的NC片段添加到熒光定量PCR檢測 體系至關要。經優化，本發明的共擴增體系中選擇內標模板添加濃度為每個反應IO2拷貝， Mg2+2. 5mmol/L, dNTP 各 0. 3mmol/L，引物各 0. 5mmol/L，探針各 0. 2mmol/L，其余條件同實施 例三，擴增曲線參見附圖8。實施例六標準曲線的建立取IO9 10°拷貝/μ L濃度的NT與NC混合物，以Npl、Nrl、NTpro和NCpro為引物 和探針進行熒光定量PCR共擴增，經優化，共擴增體系最終選擇內標模板添加濃度為每個 反應 IO2 拷貝，其中 Mg2+2. 5mmol/L，dNTP 各 0. 3mmol/L，引物各 0. 5mmol/L，探針各 0. 2mmol/ L，擴增條件為 50°C，2min，l 個循環；95°C，5min，1 個循環；95°C 15s，57°C 45s，45 個循環。 以NT的擴增曲線制定標準曲線，參見附圖9。從獲得的標準曲線可以看出，在所測的濃度范 圍內，標準品的濃度與對應的Ct值呈現明顯的線性相關關系，其回歸曲線的斜率為-3. 08， 截距為42. 05，相關系數R2為0. 997，該系數大于0. 95，且各稀釋度的擴增點均合理分布于 標準曲線旁，表明該研究獲得的標準曲線良好。實施例七方法的特異性檢測以實施例六中的反應體系和擴增條件分別擴增了牛皰疹病毒1型、牛白血病病 毒、口蹄疫病毒、剛地弓形蟲、牛環形泰勒蟲和牛雙芽巴貝斯蟲等DNA或cDNA樣品，被測樣 品均為陰性，說明本發明提供的方法具有較好的特異性。實施例八重復性檢測以實施例六中的反應體系和擴增條件分別對IO7UO5和IO3拷貝/反應的NT進行 多次重復性擴增檢測，不同試驗獲得的Ct值變異系數為0. 5% 1. 3%，均在10%以內，表 明本發明方法具有很好的重復性和穩定性，擴增曲線參見附圖10。實施例九方法的靈敏度比較以10倍梯度稀釋的Nc-5標準質粒(10° IO9拷貝/ μ L)作為模板用Npl和Nrl 為引物進行普通PCR擴增，反應體系和擴增條件同實施一、二，反應產物凝膠電泳檢測，擴 增出長度為338bp的特異性片段，以呈陽性反應的最高稀釋度作為檢測靈敏度。同時用實 施例四建立的不含內標的熒光PCR法檢測。結果顯示該含內標的熒光PCR方法檢測靈敏度 比普通PCR靈敏度高1000倍，與不含內標的熒光PCR靈敏度相當。實施例十對臨床樣品的檢測對采自牛新孢子蟲病流行區的50份全血(其中3份已經鑒定為陽性)和8份流 產胎兒樣品(其中1份已經鑒定為陽性)用所建立的方法進行檢測。有2份全血(包含1 份陽性)的樣品和內標模板均沒有擴增曲線，表明所提核酸有問題。重新提取核酸進行擴 增，內標模板和陽性樣品均擴增出曲線。
權利要求
一種牛新孢子蟲病檢測方法，其特征在于，所述的檢測方法具體步驟如下(1)根據犬新孢子蟲N.caninum Nc-5基因序列設計擴增出138bp的特異性引物Np2、Nr2和NTpro熒光探針，構建模板引物Np1和Nr1，其中Np1、Nr1位于Np2、Nr2外側，擴增出長度為338bp的片段；將探針NTpro序列進行重排，設計引物Nc1和Nc2，通過搭橋法PCR擴增，構建了內標探針NCpro；(2)以犬新孢子蟲全基因組DNA為模板，用Np1、Nr1為擴增引物，反應條件為94℃變性5min；94℃ 30s，62℃ 20s，72℃ 30s，35個循環；最后在72℃延伸10min；擴增產物經凝膠純化回收，連接到pMD18-T載體上，轉化DH5α感受態細胞，提取質粒，經酶切、PCR及測序鑒定后，構建質粒NT；(3)以質粒NT為模板，分別采用引物Np1、Nc1和Nc2、Nr1為配對引物進行PCR擴增，擴增條件為94℃ 5min；94℃ 30s，62℃ 20s，72℃ 30s，35個循環；72℃ 10min，獲得擴增產物Np1c1、Nc2r1；將擴增產物Np1c1、Nc2r1純化回收，等量混合后作為模板，用引物Np1和Nr1進行PCR擴增，反應條件為94℃變性5min；94℃ 30S，62℃ 20s，72℃ 30s，35個循環；最后在72℃延伸10min；將擴增后的產物純化回收并連接到pMD18-T載體上，轉化DH5α感受態細胞，提取質粒，經酶切、PCR及測序鑒定，構建質粒NC；(4)以質粒NT和NC為模板，以Np2、Nr2、NTpro和NCpro為引物和探針進行擴增，dNTP用量為0.3mmol/L，上下游引物用量各0.5mmol/L，兩種探針用量0.2mmol/L，Mg2+用量為0.2mmol/L，TaqDNA聚合酶用量為1.5u，被檢樣品DNA模板1μL，NC模板100拷貝，Tm為60℃，循環參數為45個循環。
2.按照權利要求1牛新孢子蟲病檢測方法，其特征在于，所述的通過引物設計和搭橋 法PCR擴增，構建了內標探針NCpro，并獲得了熒光PCR內標共擴增模板。
3.按照權利要求1牛新孢子蟲病檢測方法，其特征在于，所述的共擴增檢測體系中， Mg2+2. 5mmol/L, dNTP 各 0. 3mmol/L，引物各 0. 5mmol/L, NC 模板 100 拷貝，探針各 0. 2mmol/ L, TaqDNA 聚合酶 1. 5u。
4.按照權利要求1牛新孢子蟲病檢測方法，其特征在于，所述的共擴增檢測體系的擴 增條件為 50°C，2min，l 個循環；95°C，5min，1 個循環；95°C 15s，57°C 45s，45 個循環。
全文摘要
本發明公開一種牛新孢子蟲病檢測方法，通過采用在PCR反應體系中加入指示假陰性的擴增內標，通過堿基重排、引物設計和搭橋法PCR擴增，構建了一條內標模板，并構建了含有內標的熒光定量PCR反應體系，確定了共擴增體系的反應條件，Mg2+2.5mmol/L，dNTP各0.3mmol/L，引物各0.5mmol/L，探針各0.2mmol/L，擴增條件為50℃，2min，1個循環；95℃，5min，1個循環；95℃15s，57℃45s，45個循環。本發明檢測靈敏度高，特異性好，操作方便且能夠指示并校正假陰性結果的發生，廣泛應用于及時準確有效的檢測牛新孢子蟲病領域。
文檔編號C12Q1/68GK101831495SQ20101016043
公開日2010年9月15日 申請日期2010年4月30日 優先權日2010年4月30日
發明者于學輝, 劉菲, 員麗娟, 季新成, 段曉東, 牛國輝, 竇輝, 黃玲 申請人:新疆出入境檢驗檢疫局檢驗檢疫技術中心