專利名稱：一種藥物組合物、制備方法及在醫學中的應用的制作方法
技術領域：
本發明涉及一種藥物組合物，具體涉及一種用于治療陰道內菌群失調和陰道炎的藥物組合物、制備方法及在醫學中的應用。
背景技術：
陰道微生態平衡的破壞是各種婦科炎癥的誘因，也是各種婦科疾患的結果。陰道炎癥的治療主要包括殺菌劑、微生態制劑兩方面。殺菌劑的治療特異性強，效果顯著，但抗菌譜廣，選擇性不強，因此副作用較多，且復發率高。現有單菌種微生態制劑均以細菌性陰道炎作為治療靶點，適用范圍局限。同時，陰道不同區段正常菌群分布有一定的規律，即深部以雙歧桿菌為主，中段以乳酸桿菌為主，這樣各種正常菌群不協調改變可導致不同區段的陰道炎。
在制劑方面，盡可能提高活菌存活率一直是微生態制劑追求的目標，其存活率的影響因素主要體現在溫度、分散保護劑的使用、氧含量、酸堿度等方面。本發明的發明人已公開的專利號為01128659.8、發明名稱為“一種雙歧桿菌、乳酸桿菌混合活菌滴劑及制備方法”對此進行了一些探討，該發明著重于提出一種陰道雙歧桿菌、乳酸桿菌的分離純化方法。但還存在如下不足1、說明書中所述的抗炎、抗感染、抑菌、抗腫瘤和免疫調節作用，是根據雙歧桿菌的體外試驗文獻報道推斷而來，沒有具體的實驗數據進行支持。由于雙歧桿菌屬和乳酸桿菌屬分別含有上百株，各菌株理化特性不盡相同，產生的治療效果當然不同。如已被證實，格氏乳桿菌和卷曲乳桿菌對大腸桿菌和淋球菌根本無效，不但無抗腫瘤和免疫調節作用，而且對人體還能造成機會感染。因此，這種推斷并不客觀，存在相當的不確定性。2、在治療的適應癥方面，該發明只提及“抗炎、抗感染、抑菌效果好”，沒有特定的適應治療范圍，也沒有具體的實驗結果進行支撐，僅是現有文獻基礎上的推斷。3、沒有考慮藥物的酸堿度同時對乳酸桿菌和雙岐桿菌的活菌存活和生長條件的影響、對抑制致病菌的增長條件的影響、對局部(陰道)用藥環境酸度相適宜條件的影響。4、在使用時，由于是在體外以平衡液混合溶解，很難避雜菌的污染，同時有氧環境會降低藥物的活菌數。而且，該發明沒有涉及治療的療程，因此療效很難以一定標準進行判定。5、制備過程中所加的甘油賦形劑會影響活菌數。

發明內容
本發明的目的之一是提出一種既適合于鑒定編碼為47757732的雙歧桿菌和/或鑒定編碼為44346222的乳酸桿菌的活菌存活和生長條件，又能抑制致病菌的增長，又能與局部(陰道)用藥環境酸度相適宜的藥物組合物及其制備方法。
本發明的另一目的是提供鑒定編碼為47757732的雙歧桿菌和/或鑒定編碼為44346222的乳酸桿菌在制備治療陰道炎藥物中的用途，特別是制備治療細菌性陰道炎、霉菌性陰道炎、淋病性陰道炎等藥物中的用途。
本發明的又一目的是提供鑒定編碼為47757732的雙歧桿菌和鑒定編碼為44346222的乳酸桿菌在制備治療陰道內菌群失調藥物中的用途。
本發明的又一目的是提供鑒定編碼為47757732的雙歧桿菌和/或鑒定編碼為44346222的乳酸桿菌在制備清除大腸埃希氏菌、金黃色葡萄球菌、淋球菌、白色念珠菌等藥物中的用途。
實現上述目的的技術方案一種藥物組合物，含有治療有效量的鑒定編碼為47757732的雙歧桿菌(以下簡稱雙歧桿菌)和/或鑒定編碼為44346222的乳酸桿菌(以下簡稱乳酸桿菌)，適量的酸、堿以及藥物學可接受載體，所述適量的酸、堿使其混合后的藥物組合物PH值為3.75-5.3，PH值優選4～5。
所述酸是檸檬酸、酒石酸、富馬酸或己二酸，所述堿是碳酸鈉或碳酸氫鈉。
一種藥物組合物的制備方法，包括如下步驟(1)分別制備鑒定編碼為47757732的雙歧桿菌和/鑒定編碼為44346222(是否還有一個44346022)的乳酸桿菌的凍干菌粉；(2)將藥物學可接受載體干燥、粉碎后與適量的酸、堿混合均勻，使其混合物的PH值為3.75-5.3；(3)將步驟(1)制得的菌粉與步驟(2)制得的混合物混合后壓制成形。
進一步地，所述藥物學可接受載體包括填充劑、干燥粘合劑和粘合劑，步驟(2)進一步包括如下步驟(4)將填充劑、干燥粘合劑和粘合劑干燥、粉碎后過篩；(5)將酸、填充劑、堿、干燥粘合劑攪拌混合均勻；(6)向步驟(5)中加入粘合劑，制得混合物軟材；(7)將混合物軟材制粒并烘干，制得步驟(2)中所述的混合物。
進一步地，所述步驟(3)是先將步驟(1)制得的菌粉與一填充劑混合研勻分散后再與混合物混合后壓制成形。
進一步地，所述藥物學可接受載體包括填充劑乳糖、淀粉，干燥粘合劑、填充劑維晶纖維素，崩解劑、干燥粘合劑低取代羥丙基纖維素，粘合劑5％PVPK30乙醇溶液(95％)，所述酸是酒石酸，所述堿是碳酸氫鈉，步驟(2)進一步包括如下步驟(4)將稱量的酒石酸加入淀粉攪拌混合，再將稱量的碳酸氫鈉和乳糖加入并混合均勻；(5)在步驟(4)中再加入維晶纖維素和低取代羥丙基纖維素混合均勻后以5％PVPK30乙醇溶液(95％)作粘合劑，制軟材；(6)將軟材在制粒機中用制粒、烘烤，制得空白顆粒；步驟(3)進一步包括如下步驟(7)將稱量的菌粉分別與適量的乳糖研勻分散；(8)再與空白顆粒等量遞加混合均勻，(9)加入潤滑劑混勻，壓制成片。
本發明提供鑒定編碼為47757732的雙歧桿菌和/或鑒定編碼為44346222的乳酸桿菌在制備治療陰道炎藥物中的用途，特別是制備治療細菌性陰道炎、霉菌性陰道炎、淋病性陰道炎等藥物中的用途。
本發明提供鑒定編碼為47757732的雙歧桿菌和鑒定編碼為44346222的乳酸桿菌在制備治療陰道內菌群失調藥物中的用途。
本發明提供鑒定編碼為47757732的雙歧桿菌和/或鑒定編碼為44346222的乳酸桿菌在制備清除大腸埃希氏菌、金黃色葡萄球菌、淋球菌、白色念珠菌等藥物中的用途。
本發明提供上述藥物組合物在制備治療陰道炎藥物中的用途，特別是制備治療細菌性陰道炎、霉菌性陰道炎、淋病性陰道炎等藥物中的用途。
本發明提供上述鑒定編碼為47757732的雙歧桿菌和鑒定編碼為44346222的乳酸桿菌在制備治療陰道內菌群失調藥物中的用途。
本發明提供上述藥物組合物在制備清除大腸埃希氏菌、金黃色葡萄球菌、淋球菌、白色念珠菌等藥物中的用途。
采用上述技術方案，結合下面將要詳述的實施例，本發明突出的技術效果在于1、通過在含有鑒定編碼為47757732的雙歧桿菌和/或鑒定編碼為44346222的乳酸桿菌的藥物組合物中加入酸和堿，并控制藥物組合物的PH值為3.75-5.3(PH值優選4～5)，模擬了女性陰道的PH環境，與正常生理條件相一致，因而既適合活菌的存活和生長條件，又能抑制致病菌的增長，又能與局部(陰道)用藥環境酸度相適宜，不會對人體造成刺激。另外，PH在4～5范圍以內，片劑可壓性好，便于制作片劑。2、通過藥效學試驗證實，單一的陰道乳桿菌和雙歧桿菌及其兩種菌以不同比例混合液，對陰道炎致病菌均有抑殺菌效果。而且發現，當單一的陰道乳桿菌或雙歧桿菌及其兩種菌以不同比例混合后的濃度達到一定值后(1×107CFU/克)，對致病菌的抑制率已達到了接近100％。且詹氏乳桿菌與青春雙歧菌的比例與抑殺效果無相關關系。3、通過體內治療細菌性陰道炎實驗證實二聯活菌潔陰劑不但具有治療細菌性陰道炎的肯定療效，而且在達到治療效果的同時，具有維持或重建陰道內正常菌群微生態環境的作用。4、通過體內治療霉菌性陰道炎和淋病性陰道炎實驗研究證實a、二聯活菌潔陰劑在產生有效治療作用的基礎上，具明顯的重建陰道內微生態環境，補充正常菌群糾正菌群失調的突出優點，對預防疾病的復發或再感染可產生積極的作用。b、二聯活菌制劑重建的陰道內正常菌群可以繼續發揮治療作用。c、臨床應用中沒有發現其有明顯副作用，對哺乳期女性應用未受到限制，這些正是二聯活菌潔陰劑的優勢所在。
具體實施例方式
一、藥物的制備1、菌粉的制備按照專利號為01128659.8發明名稱為“一種雙歧桿菌、乳酸桿菌混合活菌滴劑及制備方法”中所述的方法，制得經API-20A鑒定編碼為44346022/44346222的乳酸桿菌菌種和編碼為47757732的雙歧桿菌菌種，將菌種分別接種于發酵罐中，培養至對數生長期，離心后制得乳酸桿菌菌泥和雙歧桿菌菌泥，菌泥濃度不低于1.0×109CFU/克，加入分散保護劑，約-70℃凍干后，采用冷凍干燥法制得乳酸桿菌菌粉和雙歧桿菌菌粉。
加入的分散保護劑可以是脫脂牛奶、乳糖、谷氨酸鈉、半胱氨酸和淀粉等，其中，半胱氨酸的加入量控制在0.01％～0.1％之間。加入半胱氨酸的作用是還原氧，使菌粉中氧含量下降，同時在凍干過程中保護細菌不被破壞。當半胱氨酸含量低于0.01％時作用不明顯，但由于半胱氨酸本身會抑制細菌的增長，當半胱氨酸含量高于0.1％時，反而會殺死活菌。
2、劑型的制備(1)藥物組成包括乳酸桿菌、雙岐桿菌、酸、堿和其它藥學上可接受的載體，通過酸、堿調節控制制劑的PH值為3.75-5.3之間，優選pH值為4～5之間。
由于培養液PH值的變化對乳酸桿菌和雙岐桿菌菌泥的產量影響較大，實驗表明，PH調整至6.3-6.5時培養24h濕菌泥得率最高。因此，不通過酸堿調節，將制得的菌泥制成菌粉后直接與藥學上可接受的載體結合用于人體是不太適合的。
通過向藥物中加入酸、堿調節，使藥物的PH值控制在3.75-5.3之間，既能保證乳酸桿菌和雙岐桿菌的活菌存活和生長；同時抑制致病菌的增長，又可與局部(陰道)用藥環境酸度相適宜，適宜人體，避免受到刺激。
可供選擇的酸源有檸檬酸、酒石酸、富馬酸、己二酸等，堿源有碳酸鈉、碳酸氫鈉等。
本實施例選擇性質穩定、不易吸濕的酒石酸為酸源，碳酸氫鈉為堿源。為了獲得與局部用藥環境酸度相適宜、有利于活菌存活的最佳酸度(pH4～5)，我們考察了酸、堿不同比例對酸度的影響。取不同比例酸、堿制得的泡騰片(以常規輔料為填充劑)各5片分別溶解于50ml蒸餾水中，測定泡騰片溶解后的pH值。見表1表1


由上表可見，酒石酸與碳酸氫鈉的比例選擇為0.8∶1～1.4∶1，優選0.9∶1～1.2∶1。
將藥物制成片劑(簡稱二聯活菌潔陰泡騰片或泡騰片)，藥學上可接受的載體包括各種填充劑、粘合劑、干燥粘合劑、等，進一步地，根據需要，還包括崩解劑、潤滑劑、潤濕劑和溶劑等。
選用常用的乳糖和淀粉作為本發明的填充劑。選用維晶纖維素作為顆粒間的干燥粘合劑和填充劑。選用低取代羥丙基纖維素作為崩解劑和干燥粘合劑，加入崩解劑能使陰道用藥后泡騰片迅速崩解，藥物分散在較大范圍粘膜表面，迅速提高局部血藥濃度而發揮作用，且沒有栓劑的油膩性。選用硬脂酸鎂作為潤滑劑。
粘合劑的選擇要制成片劑，必須有一定的硬度。采用適宜的粘合劑，有利于片劑成型并增加片劑硬度。另外，由于泡騰片中分別含有一定的酸源、堿源，片劑在放置過程中容易吸濕并反應產生氣體而使片膨脹、破裂，硬度的增加可以減少片劑中顆粒間孔隙，而且在貯存過程中較有效抵抗潮濕空氣的侵入。我們選擇三種常用的不同種類的粘合劑，以不同濃度的乙醇為溶劑，分別配成一定濃度的溶液，按擬定的同一處方制粒，然后壓片，以顆粒的成型性、片劑硬度及崩解時限為指標考察不同濃度粘合劑的粘合效果。結果如表2表2不同濃度粘合劑的粘合效果

實驗結果表明，采用5％PVP乙醇溶液作為粘合劑所制得的顆粒有較好的成型性，所壓的片劑有適宜的硬度，崩解速度較快，且PVP能溶于高濃度乙醇中，適用于非水制粒。HPMC(5％)粘合劑也較理想，但需要一定含水量的乙醇配制，可適于不同的制備工藝。
表3給出了三個實驗例表3實驗例篩選及結果(重量單位克)


從以上結果中可以看出，采用實驗例2制備得到的片劑有較好的成型性，酸度在4～5范圍以內，片劑可壓性好，崩解時限符合要求，較其他兩個實驗例為優。后面藥效實驗采用實驗例2制得的片劑進行。
(2)制備工藝空白顆粒制備在嚴格的環境下[RT18±1℃，相對濕度(45±1)％，無菌室]，所有輔料均預先干燥、粉碎并過100目篩。將稱量的酒石酸置于混合器中，加入淀粉攪拌混合，稱取碳酸氫鈉和乳糖加入并混合均勻。再加入維晶纖維素和低取代羥丙基纖維素混合均勻后以5％PVPK30乙醇溶液(95％)作粘合劑，制軟材，在制粒機中用18目篩制粒，50～60℃烘烤，控制水份2％以內，30目篩整粒，去除50目細粉得30～50目空白顆粒。
樣品制備將稱量的A、B菌粉分別與等量乳糖研勻分散，再與空白顆粒等量遞加混合均勻，加入潤滑劑混勻后壓片，即得泡騰片，半成品質量檢查合格后密封包裝。
本產品為微生態制劑，有效成分為乳酸桿菌和雙岐桿菌。由于劑量小(約占輔料總量的1％)，因此片劑的處方設計以輔料為主。由于主藥劑量小及其生物制品的熱、濕不穩定性，必須考慮到主藥與輔料混合的均勻性及制劑加工過程中熱、濕對產品質量的影響。因此采用非水制粒直接混合工藝，先制備空白顆粒再與小劑量主藥等量遞增獲得主藥均勻分散的顆粒，再在一定壓力下壓片制備泡騰片。避免熱、濕等因素對活性成分的影響及保證制劑中主藥的均勻性。
按照實驗例2所述配方，采用上述制備工藝，共制得片劑1000片(以下命名為泡騰片)，經檢測，含乳桿菌和雙歧桿菌總數不少于2.0×105CFU/片，酸度平均為4.26。
二、二聯活菌潔陰泡騰片體外藥效學試驗2.1材料和方法2.1.1實驗材料(1)陰道詹氏乳桿菌LY2034、陰道青春雙歧桿菌BH0203活菌菌粉。
(2)致病菌種大腸埃希氏菌ATCC2592標準株和臨床株、金黃色葡萄球菌ATCC25923標準株和臨床株、淋球菌臨床株、白色念珠菌臨床株由中南大學湘雅二醫院檢驗科和中南大學湘雅醫學院微生物與免疫學教研室提供。菌株形態、生化特征、致病菌的血清型和培養特性鑒定均符合該細菌的鑒定標準[1]。淋球菌通過形態學和API-NH生化鑒定條由中南大學湘雅二醫院檢驗科鑒定。白色念珠菌通過形態學和API-C AUX生化鑒定條由中南大學湘雅二醫院檢驗科鑒定。
(3)培養基MRS配方培養基(用于乳酸桿菌、雙歧桿菌、白色念珠菌培養)；普通營養培養基(用于大腸埃希氏桿菌、金黃色葡萄球菌培養)，淋球菌培養基購自廣州樂通泰公司商品。
2.1.2實驗方法(1)細菌比濁計數方法[3]以1.175％硫酸鋇0.05ml加1％硫酸9.95ml，混勻后用530nm波長比色調整其濁度，使吸收值為0.1，該濁度為0.5麥氏單位，細菌數相當于5×108/ml。
(2)試驗菌液和對照的制備用接種環取四種致病菌，劃線接種于相應的培養平皿，37℃培養24h，詹氏乳桿菌、青春雙歧桿菌分別接種于液體MRS培養基中，并分裝5ml液體培養基用于對照，共同置于厭氧37℃培養24h。無菌棉簽收集致病菌，洗脫于裝有0.9％生理鹽水的試管中，并以0.9％生理鹽水調整各菌液相應濃度0.5麥氏單位。
2.1.3體外殺菌試驗各取致病菌菌液0.1ml，用涂布棒涂布于適宜培養基平皿，每種菌重復5個平皿，用瓊脂板打孔器打孔，打孔直徑為6mm，每個平皿打孔6個，編為1-6號，依次加入MRS液體培養基(空白對照組)、陰道詹氏乳桿菌、陰道青春雙歧桿菌、詹氏乳桿菌和青春雙歧桿菌1∶1混合液、詹氏乳酸桿菌和青春雙歧桿菌3∶1混合液、詹氏乳酸菌和青春雙歧桿菌1∶3混合液各200μl，37℃培養24h后，用精確度為1/10的游標卡尺測量抑殺菌環的直徑。淋球菌培養平板系商用品，面積較小；乳桿菌∶雙歧菌＝1∶3的比例組未做。
2.1.4體外液體最小抑菌濃度各取50μl飽和的標準株大腸桿菌加入到50ml膽鹽乳糖培養基中，50μl飽和的標準株金黃色葡萄球菌加入到50ml 7.5％的NaCl肉湯培養基中，混勻后各分裝5管，每管9ml，每管分別加入以MRS空白培養基稀釋的不同濃度(1×109CFU/ml、1×107CFU/ml、1×106CFU/ml、1×105CFU/ml、1×104CFU/ml、1×102CFU/ml、空白)的詹氏乳桿菌/青春雙歧桿菌，置37℃培養6-12h后，用平皿法計數大腸桿菌、金黃色葡萄球菌數量，并與空白對照組進行比較，得出最小的抑菌濃度。并通過青春雙歧桿菌與詹氏乳桿菌不同比例混合，濃度為1×104CFU/ml，尋求不同比例的最佳抑殺菌效果。
2.2實驗結果2.2.1最小抑菌濃度根據目前在市場上銷售的口服類活菌制劑的有效劑量，選擇在1×102CFU/ml、1×104--1×107CFU/ml、1×109CFU/ml的詹氏乳桿菌/青春雙歧菌(統稱益生菌)濃度進行試驗。結果表明，詹氏乳桿菌、青春雙歧桿菌菌液對陰道炎常見細菌大腸桿菌與金黃色葡萄球菌有明顯的抑殺效果。在如下表中可以看出，未加益生菌的試管中致病菌濃度達到了2.0×109CFU/ml，加入1×102CFU/ml益生菌對兩種致病菌均能產生一定的抑殺作用，1×104濃度的菌液對兩種致病菌的抑殺效果明顯上升，達到了98％以上，但是再增加益生菌至1×106CFU/ml并沒有改變其抑殺作用，濃度1×107濃度的菌液對致病菌的抑制率已達到了接近100％。而且發現，在有效濃度的情況下，詹氏乳桿菌與青春雙歧桿菌的比例與抑殺效果無相關關系。見表4、5、6。
表4不同濃度的青春雙歧菌對致病菌的抑制效果

根據表4，可計算出青春雙歧菌對大腸桿菌及金黃色葡萄球菌的抑殺效果在濃度為1×102CFU/ml時對大腸桿菌和金黃色葡萄球菌的抑制率在27％-57％，而在濃度為1×104CFU/ml時對兩種致病菌的抑制作用都達到了99％，再增加濃度抑制效果變化不大，至1×107CFU/ml時抑制率達到了100％。
表5不同濃度的詹氏乳桿菌對致病菌的抑制效果

根據表5，可計算出詹氏乳桿菌對大腸桿菌及金黃色葡萄球菌的抑殺效果在濃度為1×102CFU/ml時對大腸桿菌和金黃色葡萄球菌的抑制率在60％-65％，而在濃度為1×104CFU/ml時對兩種致病菌的抑制作用都達到了99％，再增加濃度抑制效果變化不大，至1×107CFU/ml時抑制率達到了100％。
表6不同比例的二聯活菌對致病菌的抑制效果

表6給出不同比例的二聯活菌對致病菌的抑制效果。根據表6，可以看出在有效濃度的情況下，不同比例混合的詹氏乳桿菌與青春雙歧桿菌對大腸桿菌及金黃色葡萄球菌的抑殺效果，各組之間無顯著性差異。
2.2.2固體培養基中的抑殺菌效果表7給出二聯活菌對四種致病菌的殺菌效果，根據表7所示，單一的陰道乳桿菌和雙歧桿菌及其兩種菌以不同比例混合液，均有抑殺菌效果。實驗顯示，可形成清晰的抑殺菌環，而空白培養基(為擴增實驗用乳桿菌和雙歧桿菌同時配制，并置于增菌環境中)未形成抑殺菌環，目測可見以大腸埃希氏桿菌、金黃色葡萄球菌臨床株抑殺菌環最大，二聯活菌優于單一雙歧桿菌。而對淋球菌、白色念珠菌及金黃色葡萄球菌則非常接近。各不同比例混合液中，等比例混合液抑殺菌環稍大于其他各組且對金黃色葡萄球菌可獲得較好抑殺菌效果，其環直徑為30.4±0.5。總體結果分析，發現混合菌的抑殺菌環均稍大于單菌的抑殺菌環(乳桿菌對大腸埃希氏桿菌除外)。盡管從實驗數據中可以看出1∶1比例混合菌似乎可取得較好的抑殺菌效果，但無統計學意義。
表7二聯活菌對四種致病菌的殺菌效果(殺菌環直徑mm，X±SD，n＝5)

統計學應用均數的one-wayANOVA統計方法，對淋球菌和白色念珠菌的作用接近(p＞0.05)，單一活菌和混合活菌的殺菌作用接近，詹氏乳桿菌和青春雙歧桿菌比例為1∶1、3∶1、1∶3混合后的殺菌作用相近(p＞0.05)2.3結果分析和討論為確定陰道詹氏乳桿菌LY2034株和陰道青春型雙歧菌BH0203株在體外對陰道炎致病菌的殺滅或抑制作用，以及摸索最低的抑菌濃度，為后續的體內試驗及制劑處方提供試驗依據。本試驗選擇四種陰道炎常見致病菌大腸埃希氏菌ATCC25922和臨床株、金黃色葡萄球菌ATCC25923和臨床株、淋球菌臨床株、白色念珠菌臨床株作為受試菌。通過固體平皿打孔法和液體培養法發現，詹氏乳桿菌和青春雙歧菌均對陰道炎常見致病菌有明顯的抑殺作用。這種抑殺作用具備開發一種治療陰道炎藥物的條件。從量的角度分析，進一步發現這種抑殺作用具有一定的濃度依賴性。1×104CFU/ml的詹氏乳桿菌或青春雙歧菌對這兩種致病菌有明顯的抑殺作用，抑殺效果達到了99.8％，隨著濃度的遞增，其抑殺效果亦無改變，出現一個平臺期，所以，1×104CFU/ml為最小抑殺菌劑量(最小抑菌濃度，MIC)。根據臨床用藥的一般原則，用最小的量達到最大的效果，1×104CFU/ml為單次治療用量。制成片劑后為確保療效，制劑處方選擇1×105CFU/片為佳。固體打孔法和液體培養法均發現，在有效濃度情況下，改變兩者的比例對于致病菌的抑殺效果并無明顯改變，即這種抑殺效果無疊加和拮抗作用。考慮到女性生殖道的解剖結構和菌群分布特點，即陰道中段以乳酸桿菌為主，陰道深部則以雙歧菌占優，因此，本潔陰劑按女性正常菌群生理狀態下的分布規律，選用陰道詹氏乳桿菌LY2034株和陰道青春型雙歧菌LY2034株二聯活菌作為治療用菌種，同時補充中段和深部的菌群，混合比例為1∶1。
2.4結論1、詹氏乳桿菌及青春雙歧菌在體外對常見的陰道炎致病菌均有良好的抑殺作用。
2、根據高效低毒的原則，后續制劑處方選擇1×105CFU/片為佳。
3、根據女性生殖道的解剖和菌群分段特點，選用兩種菌的混合制劑，比例為1∶1，同時補充不同區段的菌群。
三、二聯活菌潔陰泡騰片體內藥效學實驗(一)——治療細菌性陰道炎實驗3.1目的用三種臨床引起細菌性陰道炎的常見致病菌大腸桿菌、金黃色葡萄球菌和淋球菌注入受試動物陰道建立陰道炎動物模型，觀察二聯活菌潔陰泡騰片對陰道炎的治療作用，定量評價二聯活菌制劑的藥效。
3.2材料5號頭皮針、10ml注射器、無菌石蠟油、0.2％氧氟沙星注射液(四川科倫大藥廠，產品批號A020216，規格為100ml)。新西蘭雌性大白兔60只，由中南大學湘雅二醫院動物實驗室提供。淋球菌專用培養基，購自廣州樂通泰公司；甘露醇高鹽瓊脂(選擇培養金葡菌)；伊美紅藍瓊脂(選擇培養大腸桿菌)，購自中國進出口商品檢驗技術研究所；MRS培養基(培養乳酸桿菌和雙歧桿菌)。大腸埃希氏菌臨床株菌液，配制成1.35×108CFU/ml的濃度；金黃色葡萄球菌臨床株菌液，配成1.35×108CFU/ml的濃度，淋球菌臨床株菌液，配制成6.3×106CFU/ml的濃度[1]，這些細菌均由中南大學湘雅二醫院檢驗科提供和鑒定，上述三種致病菌等體積混合成造模菌。二聯活菌菌粉由前述實驗例2制得，輔料由中南大學藥學院提供。
3.3方法3.3.1.細菌性陰道炎模型建立[2]60只雌性新西蘭大白兔，體重1.95±0.30kg，用5號頭皮針硅膠管涂無菌石蠟油，緩慢插入大白兔陰道，插入深度約5-8cm，回抽確定在陰道內注射造模菌液0.75ml，隨后注少許空氣確保藥液全部注入腔內。造模第6天，隨機處死12只大白兔。取陰道拭子涂片，Gram’s染色鏡檢，陰道潔度分級；三種致病菌選擇性培養基培養做細菌學檢查；取陰道組織，固定，行組織病理學檢查。
3.3.2.動物實驗將48只陰道炎模型大白兔分成6組，每組8只，分別為低劑量治療組(7×103CFU/ml)、中劑量治療組(7×104CFU/ml)、高劑量治療組(7×105CFU/ml)、氧氟沙星組(10mg/kg)、輔料組、空白對照組[1]。每只陰道炎模型動物陰道內注射藥液1ml，療程為5天。分別在治療前、治療后測量體重、肛溫，觀察動物生長、活動情況和外陰潔凈情況，無菌小棉簽采陰道拭子涂片，Gram’s染色鏡檢，檢查陰道潔度；三種致病菌選擇性培養基和MRS培養基培養做細菌學檢查；分別處死大白兔，取陰道組織10％中性福爾馬林固定，石蠟包塊、切片、HE染色做病理學檢查。
3.3.3陰道潔度分級參照《婦產科學》第5版統篇教材I級鏡下以陰道桿菌為主，并可見大量上皮細胞。
II級鏡下有部分陰道桿菌和少量膿細胞和雜菌，上皮細胞亦可見。
III級鏡下可見少量陰道桿菌和上皮細胞，伴有大量膿細胞和其它雜菌。
IV級鏡下無陰道桿菌，除有少量上皮細胞外，主要是膿細胞和大量雜菌。
3.3.4造模成功判斷標準[2]1.白兔外陰外觀紅腫、流膿、潰爛為+，外陰潔凈為-。
2.陰道拭子涂片，陰道潔度分級III-IV級為+，I-II級為-。
3.選擇性培養基培養三種細菌均生長為+，無致病菌生長為-。
4.取陰道組織，行組織病理學檢查有充血、水腫、壞死和炎性細胞浸潤為+，無充血、水腫和炎性細胞浸潤為-。
4項判斷標準有2項陽性即認為造模成功。
3.3.5陰道炎有效和治愈標準參照《婦產科學》第5版統篇教材1.陰道局部無充血、水腫、異常分泌物2.陰道潔度分級III-IV級，治療后恢復為II級為有效，I級定義為治愈3.致病菌選擇性培養基培養無菌生長為治愈4.病理檢查無水腫、出血及炎性細胞浸潤.
治愈標準陰道外觀正常，潔度I級，無致病菌生長，病理檢查正常，無充血、水腫、出血及炎性細胞浸潤等改變。
好轉標準陰道外觀由充血水腫或流膿轉變為正常，潔度由III-IV級轉變為II級或I級，無或每平皿少數致病菌落，病理檢查大致正常。
3.3.6治愈率及有效率的計算治愈率(％)＝痊愈的動物數/各組總動物數×100％有效率(％)＝(好轉的動物數)/各組總動物數×100％3.4結果3.4.1雌兔陰道炎造模結果3.4.1.1雌兔陰道炎造模檢測造模第6天，觀察動物外陰外觀，隨機處死12只動物進行包括陰道潔凈度分級，細菌學檢測。陰道組織病理學檢查，以評判造模是否成功。結果發現處死的12只雌兔全部造模成功，表現為陰道外觀有不同程度的紅腫，分泌物異常，潔度III-IV級；細菌學檢查發現致病菌；病理學檢查發現陰道粘膜充血、水腫、炎性細胞浸潤。建模成功率100％。見表8表8 12只人工制造的大白兔陰道炎模型檢測結果

表中“+、-”符號為根據判斷標準所得。數字為動物編號。
3.4.1.2用于治療觀察的48只動物陰道分泌物檢測陰道分泌物革蘭氏染色檢查。結果顯示，治療前動物的陰道潔凈度均為III級和IV級，其中III級28只動物，IV級20只動物，符合陰道炎的診斷。證明未處死48只動物也形成了陰道炎，部分受試動物的陰道分泌物涂片鏡下照片，可見大量膿球.。
3.4.2治療前后陰道潔度與療效通過陰道拭子涂片，革蘭氏染色結果，治療前陰道分泌液中見大量膿球和致病菌，無Gram’s陽性的桿菌，治療第6天鏡下觀，中、高劑量涂片未見膿菌和致病菌，可見陰道桿菌。低劑量組，膿球明顯減少，上皮細胞產生，致病菌減少；而氧氟沙星組鏡下比較干凈，無膿球和致病菌，也無Gram’s陽性的桿菌。
根據臨床診斷細菌性陰道炎常用的檢測方法，陰道分泌液革蘭氏染色檢查。結果顯示如表9所示，治療前動物的陰道潔凈度均為III級和IV級，符合陰道的診斷。用低劑量的二聯活菌制劑亦取得一定的治療效果，治愈率達到50％，III級和IV級的潔度轉為I-II級潔凈度，有效率100％，中、高劑量的二聯活菌制劑與氧氟沙星療效相近，可達到88％治愈率和100％的有效率。輔料組和空白對照組無效，僅有12.5％動物自然好轉，無痊愈的動物。療效結果說明，二聯活菌制療效較為肯定，量的角度分析，中劑量足以達到治療效果。
表9治療前后陰道潔凈度變化和療效


表內數字為動物數，有效率和治愈率根據判斷標準計算所得。
統計學應用spss軟件采用多個樣本率的X2檢驗方法，陰道潔度變化和療效高劑量組、中劑量組、氧氟沙星組無差異(p＞0.10)，但與輔料組、空白對照組有顯著性差異(p＜0.025)3.4.3細菌學檢測3.4.3.1造模后三種致病菌選擇性培養基培養取陰道拭子在三種致病菌選擇性培養基培養48小時，處死的12只動物陰道拭子涂皿均發現三種選擇性培養基上均有大量成片菌落生長，說明陰道炎模型動物是與三種致病菌有關。
3.4.3.2細菌形態學檢測，在上述三種選擇性培養基上挑單克隆涂片，Gram’s染色，鏡下觀察細菌形態，以便從形態學鑒定克隆中的細菌。結果分別顯示，可見大量革蘭氏陰性桿菌、大量革蘭氏陽性葡萄球菌和大量革蘭氏陰性雙球菌，從形態學的角度，與選擇性培養基的目標吻合，進一步證明致動物陰道炎模型的三種致病菌存在于動物的陰道內。
3.4.4治療前后一般情況3.4.4.1治療前后受試動物一般情況和體重變化進入試驗的所有48號動物自造模至治療的全過程存活，無一號死亡。受試動物均生長良好，活動自如，毛發見全身光滑。治療前后體重各組均稍有增加，但無統計學差異。各組間動物體重增加也無統計學意義，間接說明二聯活菌潔陰劑對受試動物無明顯的毒性影響，結果見表10。
表10.造模前后體重的變化(kg，X±SD)


★統計學應用spss統計軟件采用one-wayANOVA分析，各組間治療前后體重無顯著差異(P＞0.05)3.4.4.2治療前后動物體溫變化因為本實驗模型是細菌性陰道炎。體溫的變化對判斷炎癥性疾病程度，發生，發展具有一定意義。表11所示為48號受試動物治療前后的變化。無論是在炎癥發展的高峰期和治愈后，受試動物體溫無明顯變化。說明受試動物對致病菌所致陰道炎癥，體溫變化不明顯。為說明該現象，本試驗測定20號健康新西蘭大白兔肛門與受試動物體溫接近，平均為39.5℃左右。
表11造模前后體溫的變化(℃，X±SD)

★統計學應用spss統計軟件采用one-way ANOVA分析，各組間治療前后體溫無顯著差異(P＞0.05)3.4.5治療前后受試動物外陰情況治療前陰道炎模型動物外陰，都有不同程度的充血，水腫，部分有膿性分泌物，少數有糜爛現象。治療后除輔料及空白對照組動物外陰輕度充血水腫外，二聯活菌制劑和氧氟沙星治療組動物外陰均恢復正常的外觀粉紅色，干凈無分泌物。
3.4.6細菌學檢查3.4.6.1.二聯活菌潔陰劑治療后陰道分泌物致病菌和厭氧菌檢測.
在注入致病菌造模成功的基礎上，為觀察二聯活菌潔陰劑的抑殺菌效果，用三種致病菌的選擇性培養基進入陰道分泌物涂片培養，予以檢查是否有效的抑殺了致病菌達到了治療目的.又因為陰道內的正常菌群大部分為厭氧菌，有報道稱之為陰道桿菌，本試驗采用培養二聯活菌的MRS培養基厭氧培養，觀察是否存在菌群失調，和治療后菌群失調能否得到糾正。
觀察結果表明高劑量組和氧氟沙星有強大的抑殺致病菌的作用，未培養出致病菌。二聯活菌潔陰劑可重建動物的正常陰道菌群，而氧氟沙星無此作用。低劑量的二聯活菌制劑甚有明顯抑殺菌作用，致病菌落明顯減少。且有重建陰道內正常菌群的作用，對照組動物陰道內仍有大量的致病菌存活，無厭氧菌。說明發生陰道炎后正常陰道內菌群微生態環境遭到了破壞。
3.4.6.2.細菌形態學鑒定。
為了明確選擇培養基所能培養的菌群為相應的致病菌。取克隆鏡檢觀察，結果顯示，細菌學的形態與相應選擇培養基的目的相符。分別顯示，可見大量革蘭氏陽性葡萄球菌、革蘭氏陰性桿菌、革蘭氏陰性雙球菌、量桿狀和短棒狀厭氧菌。
3.4.6.3.二聯活菌潔陰劑治療后受試動物陰道分泌物致病菌和厭氧菌檢測。
為全面評估二聯活菌潔陰劑治療陰道炎的機制。取所有各組受試動物陰道分泌物，用選擇性培養基對致病菌進行檢測，以便證明二聯活菌制劑的治療效果是通過抑殺致病菌或其他機理。同時用MRS培養基厭氧培養陰道炎正常菌群，以證明陰道炎動物存在菌群失調。二聯活菌制劑治療后能否達到重建陰道內菌群失調的目的。表12結果表明二聯活菌制劑和氧氟沙星局部用藥能有效地抑殺陰道內致病菌。以氧氟沙星作用最強。二聯活菌潔陰劑的抑殺菌作用與劑量有關，中高劑量效果最好。空白和輔料無抑殺菌作用。從中可以看出陰道炎模型動物陰道內存在菌群失調。用二聯活菌潔陰劑可重建或糾正陰道炎模型動物陰道內的菌群失調。
表12治療第六天陰道拭子培養48小時后有菌落生長的平皿數

表內數字為平皿數，+為有菌生長，-為無菌生長。
治療后，陰道拭子在4種選擇性培養基上劃皿培養48小時，空白對照組和輔料組仍有大量雜菌生長，幾乎沒有厭氧菌生長.中高劑量組幾乎沒有致病菌生長，有大量厭氧菌生長.氧氟沙星組幾乎沒有致病菌生長也沒有厭氧菌生長.*p＜0.05與空白對照組，輔料組比較，+p＜0.05與空白對照組，輔料組，氧氟沙星組比較，統計學應用spss軟件采用多個樣本率的X2檢驗方法分析。
3.4.7受試動物治療后的病理學變化治療各組的陰道粘膜外觀光滑，無潰瘍及糜爛，結構清楚。治療組中，低劑量組二只動物陰道內可見稍有粘稠的分泌物，空白對照組及輔料組各一只動物陰道不充血水腫，其余都可見不同程度的充血水腫及分泌物增多，粘稠。鏡下觀察發現中，高劑量的二聯活菌制劑治療的動物，組織病理學無異常。低劑量組2號動物陰道組織見充血伴水腫。對照組動物見明顯的鏡下充血，水腫，并有5只動物伴炎性細胞浸潤(如表13)。
表13治療后陰道炎模型陰道組織病理學改變

◆表中數字為病理學異常例數，每組動物數為8只。造模第5天陰道組織鏡下觀，有充血、水腫和炎性細胞浸潤；治療第6天陰道組織鏡下觀，充血、水腫明顯減輕，未見炎性細胞浸潤，無糜爛，高劑量組、中劑量組、氧氟沙星組無差異，但與輔料組、空白對照組有顯著性差異(p＜0.05)，統計學應用spss軟件采用X2檢驗方法分析。
3.5結果分析在體外有效性試驗結果基礎上，觀察二聯活菌制劑治療陰道炎動物模型的效果。用三種致病菌直接注入新西蘭大白兔陰道內，能成功地制備出陰道炎動物模型。從外觀、陰道分泌物檢測、細菌學檢測及陰道組織病理學檢查證明了動物陰道炎的存在，其特點為陰道分泌物膿球是主要指標，能很好地反映陰道炎的存在，與現行的臨床診斷吻合。組織病理學以充血水腫為主的非特異性改變。細菌學檢測有一定的意義。從陰道分泌物涂片和空白治療組厭氧菌培養未發現正常菌，證明陰道炎發生后陰道內存在菌群失調，即致病菌可抑殺陰道內正常菌。
用二聯活菌制劑治療后，陰道外觀的紅腫及分泌物減少至消失，恢復正常外觀。將臨床用于檢測潔凈度判斷炎癥的方法發現，治療后的動物模型陰道分泌物明顯好轉，幾乎均有朝潔凈方向發展。中、高劑量組療效顯著，治愈率88％，明顯優于輔料組及空白對照組，與氧氟沙星的治療效果接近。從陰道涂片和致病菌選擇性培養基培養結果說明，氧氟沙星治療效果盡管很明顯，鏡下分泌物潔凈且無細菌的痕跡，達到了治療目標，同時也留下了菌群失調潛在隱患。可導致疾病的復發或重新感染。從空白對照組和輔料對照組的細菌培養結果顯示，致病菌引起的陰道炎可導致引道內正常菌群破壞。二聯活菌潔陰劑治療原理是糾正菌群失調，補充正常菌來達到的。因此，結果顯示中、高劑量二聯活菌劑在達到治療效果的同時，保持和重建了陰道內正常菌群微環境是本制劑的主要優勢。
3.6結論1、二聯活菌潔陰劑具有治療細菌性陰道炎的肯定療效。與氧氟沙星局部用藥效果接近，治愈率為88％。劑量為中等劑量(7×104CFU/ml)為好。
2、二聯活菌潔陰泡騰片治療陰道炎的作用機理是通過建立正常菌群抑殺致病菌達到的。
3、二聯活菌潔陰泡騰片具有維持或重建陰道內正常菌群微生態環境的作用。
參考文獻[1]徐叔云，卞如濂，陳修，《藥理實驗方法學》，人民衛生出版社，2002年版[2]施新猷，《現代醫學實驗動物學》，北京，人民軍醫出版社，2000年版四、二聯活菌潔陰泡騰片體內藥效學實驗(二)——治療霉菌性陰道炎和淋病性陰道炎實驗4.1材料5號頭皮針、10ml注射器、無菌石蠟油。淋必治(2g，批號020601山東魯抗醫藥股份有限公司生產)。氟康唑注射液(100ml，0.2g，批號020203025上海華源制藥股份有限公司生產)。雌性新西蘭大白兔72只，由中南大學湘雅二醫院動物實驗室提供。淋球菌專用培養基，購自廣州樂通泰公司；玫瑰紅鈉瓊脂(培養白色念珠菌)購自中國進出口商品檢驗技術研究所(北京陸橋技術有限責任公司)；MRS培養基(培養乳酸桿菌和雙歧桿菌)。白色念珠菌臨床株菌液(3.6×107CFU/ml)，淋球菌臨床株菌液(6.3×106CFU/ml)[3]，由中南大學湘雅二醫院檢驗科提供和鑒定。二聯活菌菌粉按前述實驗例2制備，輔料由中南大學藥學院提供。
4.2方法4.2.1.霉菌性和淋病性陰道炎模型建立72只雌性新西蘭大白兔，隨機分成2組，每組36只，一組陰道內注射白色念珠菌液造模，另一組注射淋球菌液造模。用5號頭皮針硅膠管涂無菌石蠟油，緩慢插入大白兔陰道，插入深度約5-8cm，回抽確定在陰道內注射相應造模菌液0.25ml，白色念珠菌液濃度3.6×107CFU/ml淋球菌液濃度6.3×106CFU/m，造模第6天，每組隨機處死6只大白兔。做陰道拭子涂片，Gram’s染色鏡檢，陰道潔度分級，二種選擇性培養基培養進行細菌學檢測。取陰道組織，10％中性福爾馬林固定，行組織病理學檢查。
4.2.2.動物實驗將30只白色念珠菌陰道炎模型大白兔隨機分成5組，每組6只，分別為低劑量治療組(7×103CFU/ml)、中劑量治療組(7×104CFU/ml)、高劑量治療組(7×105CFU/ml)、氟康唑組(14mg/kg)、生理鹽水對照組[2]。將30只淋病性陰道炎模型大白兔隨機分成5組，每組6只，分別為低劑量治療組(7×103CFU/ml)、中劑量治療組(7×104CFU/ml)、高劑量治療組(7×105CFU/ml)、淋必治組(140mg/kg)、生理鹽水對照組，每只陰道炎模型動物陰道內注射藥液1ml。隨后注射少量空氣以確保藥液進入腔內，治療7天。分別在治療前、治療后觀察動物生長、活動情況和外陰潔凈情況，無菌小棉簽取陰道拭子涂片，Gram’s染色鏡檢，檢查陰道潔度；選擇性培養基培養進行細菌學檢測；分別處死大白兔，取陰道組織10％中性福爾馬林固定，石蠟包塊、切片、HE染色行病理學檢查。
4.3結果4.3.1雌兔陰道炎建模結果4.3.1.1處死的12只雌兔陰道炎造模結果造模后第6天，隨機處死12只大白兔，觀察外陰外觀，做陰道拭子涂片，Gram’s染色鏡檢，陰道潔度分級，細菌學檢測。取陰道組織行病理學檢查，以評判造模是否成功。結果發現處死的12只雌兔全部造模成功，表現為陰道外觀有不同程度的紅腫，分泌物異常，潔度III-IV級，陰道粘膜充血，水腫。結果表明大白兔全部造模成功，成功率100％，見表14。
表14 12只大白兔造模成功判斷結果

表中“+”號為根據判斷標準所得。數字為動物編號。
5、9、20、26、31、36號為白色念珠菌造模組，42、45、53、60、69、71淋球菌造模組。
4.3.1.2未處死60只動物陰道分泌物涂片陰道分泌物革蘭氏染色檢查。結果顯示，治療前動物的陰道潔凈度均為III級和IV級，其中III級29只動物，IV級31只動物，符合陰道炎的診斷。證明未處死60只動物也造模成功。
4.3.2治療前后陰道潔度的變化4.3.2.1受試動物陰道拭子涂片革蘭氏染色鏡下檢測治療前白色念珠菌和淋球菌動物模型陰道分泌液中見大量膿球充斥于視野。氟康唑治療后白色念珠菌動物模型和淋必治治療后淋球菌動物模型陰道分泌物無膿球，視野比較干凈。中、高劑量的二聯活菌制劑治療的淋球菌性和白色念珠菌性陰道炎動物模型陰道分泌物大部分無膿球，治療組各一例可見少許膿球。低劑量組二聯活菌制劑治療組，白色念珠菌組2例，淋球菌組3例陰道分泌物可見少許膿球。
其中，白色念珠菌造模組治療前后動物陰道拭子檢查造模第5天取陰道拭子涂片，可見大量膿球和致病菌；氟康唑組未見膿球和致病菌，上皮細胞產生；高劑量組治療后第8天，未見膿球和致病菌，可見陰道桿狀菌；中劑量組治療后第8天，未見膿球和致病菌，可見陰道桿狀菌；生理鹽水組治療后第8天，可見膿球及致病菌，未見陰道桿狀菌。
淋球菌造模組治療前后動物陰道拭子檢查造模第5天取陰道拭子涂片，可見大量膿球和致病菌；B為淋必治治療組，未見膿球和致病菌，可見上皮細胞產生；高劑量組治療第8天，未見膿球和致病菌，可見陰道桿狀菌；中劑量組治療第8天，未見膿球和致病菌，可見陰道桿狀菌；生理鹽水組治療第8天，可見膿球及致病菌，未見陰道桿狀菌。
4.3.2.2二聯活菌潔陰劑治療白色念珠菌陰道炎動物陰道潔度和療效結果顯示，以氟康唑的療效最好，有效率和治愈率達100％。二聯活菌潔陰劑療效肯定，有效率甚達100％，以陰道潔度為標準的治愈率為83％，較氟康唑的療效差。低劑量治療組的治愈率甚達66％。二聯活菌制劑各治療組均優于生理鹽水組，有統計學意義。結果如表15。
表15白色念珠菌造模組治療前后陰道潔度變化和療效

表內數字為動物數，有效率和治愈率根據判斷標準計算所得。
統計學應用spss軟件采用多個樣本率的X2檢驗方法，陰道潔度變化和療效高劑量組、中劑量組、氟康唑組無差異(0.25＞p＞0.10)，但與輔料組、空白對照組有顯著性差異(0.025＞p＞0.01)4.3.2.3二聯活菌潔陰劑治療淋病性陰道炎陰道潔度和療效。
如表16結果所示，淋球菌性陰道炎以以淋必治的療效最好，有效率和治愈率達100％。二聯活菌潔陰劑療效肯定，有效率甚達100％，以陰道潔度為標準的治愈率為83％，較淋必治的療效差。低劑量治療組的治愈率甚達66％。二聯活菌制劑各治療組均優于生理鹽水治療組，有統計學意義。
表16淋球菌造模組治療前后陰道潔度變化和療效

表內數字為動物數，有效率和治愈率根據判斷標準計算所得。
統計學應用spss軟件采用多個樣本率的X2檢驗方法，高劑量、中劑量、淋必治對淋病性陰道炎療效無差異(p＞0.10)，但與低劑量組、生理鹽水組有顯著性差異(p＜0.025)。
4.3.3細菌學檢測造模動物致病菌檢查白色念珠菌造模組取陰道拭子在玫瑰紅鈉瓊脂培養基上涂皿，培養48小時，有大量菌落生長，說明陰道炎模型動物是與白色念珠菌有關，造模成功；而MRS培養基，未見活菌生長。
淋球菌造模組取陰道拭子在淋球菌專用培養基上涂皿，培養48小時，發現有大量菌落生長，說明陰道炎模型動物是與淋球菌有關，造模成功；而MRS培養基，未見活菌生長。
細菌形態學檢測在上述兩種選擇性培養基上挑單克隆涂片，Gram’s染色，鏡下觀察細菌形態。對應可見大量革蘭氏陽性球菌及革蘭氏陰性雙球菌。
4.3.4治療前后動物一般情況和外陰外觀實驗動物生長良好，活動自如，毛發貼身光滑，造模前外陰干凈，無紅腫，無膿性分泌物，造模第5天觀察，實驗動物均不同程度出現外陰紅腫，有膿性分泌物，其中42號、44號、57號動物見潰爛，經過5天不同劑量藥物治療后，高、中劑量組和氟康唑組、淋必治組治療后動物外陰紅腫均消失，膿性分泌物明顯減少。低劑量組治療后外陰無充血水腫，生理鹽水組治療后動物外陰有充血水腫。
4.3.5治療后細菌學檢測4.3.5.1霉菌性陰道炎模型治療后細菌學檢測二聯活菌制劑治療白色念珠菌性陰道炎受試動物后，陰道分泌物中白色念珠菌和厭氧菌檢測結果如表17，氟康唑能有效殺滅白色念珠菌，用玫瑰紅鈉瓊脂選擇性培養，氟康唑治療組所有6只動物陰道分泌物中均未發現有白色念珠菌，高、中劑量的二聯活菌制劑治療組有5只動物陰道分泌物中均未發現有白色念珠菌，說明二聯活菌潔陰劑有肯定的抑殺白色念珠菌的作用。低劑量組的二聯活菌制劑有4只動物陰道分泌物中均未發現有白色念珠菌生長，進一步說明該制劑有明顯抑殺白色念珠菌的作用。而生理鹽水治療組均可培養出白色念珠菌。用厭氧菌MRS相對選擇培養二聯活菌，表17結果顯示，氟康唑治療組未培養出二聯活菌，而各劑量的二聯活菌治療組均可培養出厭氧的二聯活菌。同時各劑量組厭氧培養發現，高、中劑量組各1例，低劑量組2例培養皿中出現白色念珠菌生長，生理鹽水治療組可發現大量白色念珠菌生長。
表17治療后陰道拭子白色念珠菌和厭氧菌有菌落生長的平皿數 表內數字為平皿數，+為有菌生長，-為無菌生長。
雌性白兔治療第8天，陰道拭子在3種選擇性培養基上劃皿培養48小時，發現生理鹽水組仍有大量致病菌生長，幾乎沒有厭氧菌生長，而中高劑量組幾乎沒有致病菌生長，但有大量厭氧菌生長，氟康唑組幾乎沒有致病菌生長也，沒有厭氧菌生長.▲vs●中、高劑量組和氟康唑組抑菌顯著，明顯優于生理鹽水組，■vs★中、高劑量組厭氧菌平皿數明顯多于氟康唑組，統計學應用spss軟件采用多個樣本率的X2檢驗方法分析，高劑量組、中劑量組、氟康唑組無差異(0.25＞p＞0.10)，與生理鹽水組有顯著性差異(0.025＞p＞0.01)。
4.3.5.2二聯活菌潔陰劑治療后陰道分泌物致病菌和厭氧菌檢測在注入致病菌造模成功的基礎上，為觀察二聯活菌潔陰劑的抑殺菌效果，用玫瑰紅鈉瓊脂選擇性培養基將陰道分泌物涂片培養，予以檢查是否有效的抑殺了致病菌達到了治療目的.又因為陰道內的正常菌群大部分為厭氧菌，有報道稱之為陰道桿菌，本試驗采用培養二聯活菌的MRS培養基厭氧培養，觀察是否存在菌群失調，和治療后菌群失調能否得到糾正。高劑量組和氟康唑有強大的抑殺致病菌的作用，未培養出致病菌。二聯活菌潔陰劑可重建動物的正常陰道菌群，而氟康唑無此作用。低劑量的二聯活菌制劑甚有明顯抑殺菌作用，致病菌落明顯減少。且有重建陰道內正常菌群的作用，對照組動物陰道內仍有大量的致病菌存活，無厭氧菌。說明發生陰道炎后正常陰道內菌群微生態環境遭到了破壞。
4.3.5.3淋病性陰道炎模型治療后細菌學檢測二聯活菌制劑治療淋球菌性陰道炎受試動物后，陰道分泌物中淋球菌和厭氧菌檢測結果如表18，淋必治能有效殺滅淋球菌，用淋球菌專用培養基選擇性培養，淋必治治療組所有6只動物陰道分泌物中均未發現有淋球菌，高、中劑量的二聯活菌制劑治療組有5只動物陰道分泌物中均未發現有淋球菌，說明二聯活菌潔陰劑有肯定的抑殺淋球菌的作用。低劑量組的二聯活菌制劑有4只動物陰道分泌物中均未發現有淋球菌生長，進一步說明該制劑有明顯抑殺淋球菌的作用。而生理鹽水治療組均可培養出淋球菌。用厭氧菌MRS相對選擇培養二聯活菌，表18結果顯示，淋必治治療組未培養出二聯活菌，而各劑量的二聯活菌治療組均可培養出厭氧的二聯活菌。同時各劑量組厭氧培養發現，高、中劑量組各1例，低劑量組2例培養皿中出現淋球菌生長，生理鹽水治療組可發現大量淋球菌生長。
表18治療第八天陰道拭子培養48小時后有菌落生長的平皿數 表內數字為平皿數，+為有菌生長，-為無菌生長。
雌性白兔治療第8天，陰道拭子在3種選擇性培養基上劃皿培養48小時，發現生理鹽水組仍有大量致病菌生長，幾乎沒有厭氧菌生長，而中高劑量組幾乎沒有致病菌生長，但有大量厭氧菌生長，淋必治組幾乎沒有致病菌生長也，沒有厭氧菌生長.▲vs●中、高劑量組和淋必治組抑菌顯著，明顯優于生理鹽水組，■vs★中、高劑量組厭氧菌平皿數明顯多于淋必治組，與生理鹽水組有顯著性差異，統計學應用spss軟件采用多個樣本率的X2檢驗方法分析。高劑量組、中劑量組、淋必治組無差異(0.25＞p＞0.10)，與生理鹽水組有顯著性差異(0.025＞p＞0.01)。
4.3.5.4二聯活菌潔陰劑治療后陰道分泌物致病菌和厭氧菌檢測在注入致病菌造模成功的基礎上，為觀察二聯活菌潔陰劑的抑殺菌效果，用淋球菌專用選擇性培養基將陰道分泌物涂片培養，予以檢查是否有效的抑殺了致病菌達到了治療目的，觀察是否存在菌群失調，和治療后菌群失調能否得到糾正。高劑量組和淋必治有強大的抑殺致病菌的作用，未培養出致病菌。二聯活菌潔陰劑可重建動物的正常陰道菌群，而淋必治無此作用。低劑量的二聯活菌制劑甚有明顯抑殺菌作用，致病菌落明顯減少。且有重建陰道內正常菌群的作用，對照組動物陰道內仍有大量的致病菌存活，無厭氧菌。說明發生陰道炎后正常陰道內菌群微生態環境遭到了破壞。
4.3.6.受試動物組織病理學檢測4.3.6.1.二聯活菌制劑治療白色念珠菌所致陰道炎的組織病理學變化。
表19的結果顯示，中高劑量二聯活菌制劑和氟康唑治療組，陰道組織外觀無充血水腫，光滑，組織學檢查其無充血，水腫及炎性細胞浸潤。低劑量治療組有一例外觀輕度充血改變，病理學檢查發現1例充血，水腫伴少許炎性細胞浸潤，1例鏡下充血水腫。生理鹽水。6例外觀均有充血水腫。其中3例鏡下僅見充血水腫無炎性細胞浸潤。另3例不僅粘膜充血水腫伴有炎性細胞均潤。
表19白色念珠菌造模組白兔治療后陰道組織病理改變

◆表中數字為病理學異常例數，每組動物數為6只白色念珠菌造模組治療第8天陰道組織鏡下觀，充血、水腫明顯減輕，未見炎性細胞浸潤，統計學應用spss軟件采用X2檢驗方法分析，高劑量組、中劑量、淋必治組無差異，但與生理鹽水組有顯著性差異(p＜0.05)4.3.6.2二聯活菌制劑治療淋球菌所致陰道炎的組織病理學變化表20的結果顯示，中高劑量二聯活菌制劑和淋必治治療組，陰道組織外觀無充血水腫，光滑，組織學檢查其無充血，水腫及炎性細胞浸潤。低劑量治療組有一例外觀輕度充血改變，病理學檢查發現1例充血，水腫伴少許炎性細胞浸潤，1例鏡下充血水腫。生理鹽水6例外觀均有充血水腫。其中3例鏡下僅見充血水腫無炎性細胞浸潤。另3例不僅粘膜充血水腫伴有炎性細胞浸潤。
表20淋球菌造模組白兔治療后陰道組織病理改變

◆表中數字為病理學異常例數，每組動物數為6只淋球菌造模組治療第8天陰道組織鏡下觀，充血、水腫明顯減輕，未見炎性細胞浸潤，無糜爛，統計學應用spss軟件采用X2檢驗方法分析，高劑量組、中劑量、淋必治組無差異，但與生理鹽水組有顯著性差異(p＜0.05)4.4結果分析用兩種致病菌直接注入新西蘭大白兔陰道內，能成功地制備出霉菌性陰道炎和淋菌性陰道炎動物模型，從外觀，陰道分泌物檢測，細菌學檢測，陰道組織病理學檢查證明了動物陰道炎的存在，其特點為陰道分泌物膿球是主要指標，能很好地反映陰道炎的存在，與現行的臨床診斷吻合。組織病理學以充血水腫明顯的非特異性改變。細菌學檢測有一定的意義。同時也發現陰道炎發生后陰道內存在菌群失調。
經過從受試動物的一般情況，陰道外觀模擬臨床檢測的陰道分泌物潔度，致病菌和正常菌群的細菌學檢測，組織病理學等多項檢查，全面評價二聯活菌制劑的療效。結果表明，二聯活菌制劑能有效地治療白色念珠菌和淋球菌所致的陰道炎，中高劑量的治愈率均達到了80％以上。與臨床主要治療藥物氟康唑和淋必治的療效接近。從細菌學檢測的角度，二聯活菌潔陰劑有明顯的抑制白色念珠菌和淋球菌的作用。中高劑量的效果與氟康唑和淋必治的抑殺菌效果接近。氟康唑和淋必治抑殺白色念珠菌和淋球菌的能力強于二聯活菌制劑。重要的是，二聯活菌潔陰劑在產生有效治療作用的基礎上，可以糾正陰道內的微生態失衡，建立正常菌群微環境。對預防疾病的復發或再感染可產生積極的作用。而氟康唑和淋必治盡管治療效果和抑殺菌作用療效肯定，同時也留下了陰道內微生態環境失衡的隱患。該階段是易于再感染和復發的時段。再者，氟康唑和淋必治為化學藥物作用時間短。而二聯活菌制劑重建的陰道內正常菌群可以繼續發揮治療作用。其次，氟康唑和淋必治在臨床應用中發現其有明顯副作用，尤其對某些哺乳期女性應用受到限制，這些也正是二聯活菌潔陰劑的優勢所在。
4.5結論1，二聯活菌潔陰劑治療淋菌性陰道炎的療效接近于淋必治。抑殺淋球菌的效果稍遜于淋必治，用量以中劑量適用于臨床治療。
2，二聯活菌潔陰劑治療白念性陰道炎療效接近于氟康唑。抑殺白念的效果比氟康唑差。中等劑量適合為推薦量。
3，二聯活菌潔陰劑具明顯的重建陰道內微生態環境，補充正常菌群糾正菌群失調是其突出優點。
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徐叔云，卞如濂，陳修，《藥理實驗方法學》，人民衛生出版社，2002年版[3]施新猷，《現代醫學實驗動物學》，北京，人民軍醫出版社，2000年版。
權利要求
1.一種藥物組合物，其特征在于含有治療有效量的鑒定編碼為47757732的雙歧桿菌，鑒定編碼為44346222的乳酸桿菌，適量的酸、堿以及藥物學可接受載體，所述適量的酸、堿使其混合后的藥物組合物PH值為3.75-5.3。
2.權利要求1所述藥物組合物，其特征在于所述藥物組合物的PH值為4～5。
3.權利要求1所述藥物組合物，其特征在于所述酸是檸檬酸、酒石酸、富馬酸或己二酸。
4.權利要求1所述藥物組合物，其特征在于所述堿是碳酸鈉或碳酸氫鈉。
5.權利要求1所述藥物組合物，其特征在于所述酸是酒石酸，所述堿是碳酸氫鈉。
6.權利要求5所述藥物組合物，其特征在于按重量百分比計，所述酒石酸與碳酸氫鈉比例為0.8∶1～1.4∶1。
7.權利要求6所述藥物組合物，其特征在于所述酒石酸與碳酸氫鈉比例為0.9∶1～1.2∶1。
8.權利要求1所述藥物組合物，其特征在于所述藥物學可接受載體包括填充劑和粘合劑。
9.權利要求8所述藥物組合物，其特征在于所述藥物學可接受載體還包括干燥粘合劑。
10.權利要求9所述藥物組合物，其特征在于所述藥物學可接受載體還包括崩解劑。
11.一種藥物組合物，其特征在于所述藥物制劑中鑒定編碼為47757732的雙歧桿菌和鑒定編碼為44346222的乳酸桿菌的活菌數含量不低于1×102CFU/克。
12.權利要求11所述藥物組合物，其特征在于所述藥物制劑中鑒定編碼為47757732的雙歧桿菌和鑒定編碼為44346222的乳酸桿菌的活菌數含量為1×104CFU/克～1×107CFU/克。
13.鑒定編碼為47757732的雙歧桿菌和鑒定編碼為44346222的乳酸桿菌在制備治療陰道炎藥物中的用途。
14.鑒定編碼為47757732的雙歧桿菌和鑒定編碼為44346222的乳酸桿菌在制備治療陰道內菌群失調藥物中的用途。
15.鑒定編碼為47757732的雙歧桿菌和鑒定編碼為44346222的乳酸桿菌在制備治療細菌性陰道炎藥物中的用途。
16.鑒定編碼為47757732的雙歧桿菌和鑒定編碼為44346222的乳酸桿菌在制備治療霉菌性陰道炎藥物中的用途。
17.鑒定編碼為47757732的雙歧桿菌和鑒定編碼為44346222的乳酸桿菌在制備治療淋病性陰道炎藥物中的用途。
18.鑒定編碼為47757732的雙歧桿菌和鑒定編碼為44346222的乳酸桿菌在制備清除大腸埃希氏菌藥物中的用途。
19.鑒定編碼為47757732的雙歧桿菌和鑒定編碼為44346222的乳酸桿菌在制備清除金黃色葡萄球菌藥物中的用途。
20.鑒定編碼為47757732的雙歧桿菌和鑒定編碼為44346222的乳酸桿菌在制備清除淋球菌藥物中的用途。
21.鑒定編碼為47757732的雙歧桿菌和鑒定編碼為44346222的乳酸桿菌在制備清除白色念珠菌藥物中的用途。
22.權利要求1-12任意一項所述藥物組合物在制備治療陰道內菌群失調藥物中的用途。
23.權利要求1-12任意一項所述藥物組合物在制備治療陰道炎藥物中的用途。
24.權利要求23所述藥物組合物在制備治療細菌性陰道炎藥物中的用途。
25.權利要求23所述藥物組合物在制備治療霉菌性陰道炎藥物中的用途。
26.權利要求23所述藥物組合物在制備治療淋病性陰道炎藥物中的用途。
27.權利要求1-12任意一項所述藥物組合物在制備清除大腸埃希氏菌藥物中的用途。
28.權利要求1-12任意一項所述藥物組合物在制備清除金黃色葡萄球菌藥物中的用途。
29.權利要求1-12任意一項所述藥物組合物在制備清除淋球菌藥物中的用途。
30.權利要求1-12任意一項所述藥物組合物在制備清除白色念珠菌藥物中的用途。
31.藥物組合物的制備方法，其特征在于包括如下步驟(1)分別制備鑒定編碼為47757732的雙歧桿菌和鑒定編碼為44346222的乳酸桿菌的凍干菌粉；(2)將藥物學可接受載體干燥、粉碎后與適量的酸、堿混合均勻，使其混合物的PH值為3.75-5.3；(3)將步驟(1)制得的菌粉與步驟(2)制得的混合物混合后壓制成形。
32.權利要求31所述藥物組合物的制備方法，其特征在于所述藥物學可接受載體包括填充劑、干燥粘合劑和粘合劑，步驟(2)進一步包括如下步驟(2-1)將填充劑、干燥粘合劑和粘合劑干燥、粉碎后過篩；(2-2)將酸、填充劑、堿、干燥粘合劑攪拌混合均勻；(2-3)向步驟(5)中加入粘合劑，制得混合物軟材；(2-4)將混合物軟材制粒并烘干，制得步驟(2)中所述的混合物。
33.權利要求31所述藥物組合物的制備方法，其特征在于所述步驟(3)是先將步驟(1)制得的菌粉與一填充劑混合研勻分散后再與混合物混合后壓制成形。
34.權利要求31-33任意一項所述藥物組合物的制備方法，其特征在于所述酸是檸檬酸、酒石酸、富馬酸或己二酸。
35.權利要求31-33任意一項所述藥物組合物的制備方法，其特征在于所述堿是碳酸鈉或碳酸氫鈉。
36.權利要求31-33任意一項所述藥物組合物的制備方法，其特征在于所述酸是酒石酸，所述堿是碳酸氫鈉。
37.權利要求35所述藥物組合物的制備方法，其特征在于按重量百分比計，所述酒石酸與碳酸氫鈉比例為0.8∶1～1.4∶1。
38.權利要求37所述藥物組合物的制備方法，其特征在于所述酒石酸與碳酸氫鈉比例為0.9∶1～1.2∶1。
39.權利要求31所述藥物組合物的制備方法，其特征在于所述藥物學可接受載體包括填充劑乳糖、淀粉，干燥粘合劑、填充劑維晶纖維素，崩解劑、干燥粘合劑低取代羥丙基纖維素，粘合劑5％PVPK30乙醇溶液(95％)，所述酸是酒石酸，所述堿是碳酸氫鈉，步驟(2)進一步包括如下步驟(2-1)將稱量的酒石酸加入淀粉攪拌混合，再將稱量的碳酸氫鈉和乳糖加入并混合均勻；(2-2)在步驟(4)中再加入維晶纖維素和低取代羥丙基纖維素混合均勻后以5％PVPK30乙醇溶液(95％)作粘合劑，制軟材；(2-3)將軟材在制粒機中用制粒、烘烤，制得空白顆粒；步驟(3)進一步包括如下步驟(3-1)將稱量的菌粉分別與適量的乳糖研勻分散；(3-2)再與空白顆粒等量遞加混合均勻，(3-3)加入潤滑劑混勻，壓制成片。
40.權利要求31-33、39任意一項所述藥物組合物的制備方法，其特征在于所述凍干菌粉中加入有含量為0.01％～0.1％的半胱氨酸。
全文摘要
本發明涉及一種藥物組合物，含有治療有效量的鑒定編碼為47757732的雙歧桿菌，鑒定編碼為44346222的乳酸桿菌，適量的酸、堿以及藥物學可接受載體，所述適量的酸、堿使其混合后的藥物組合物pH值為3.75－5.3。本發明還涉及該藥物組合物的制備方法及在醫學中的應用，特別是制備治療陰道內菌群失調、細菌性陰道炎、霉菌性陰道炎、淋病性陰道炎等藥物中的用途。通過藥效學試驗證實，當兩種菌的濃度達到一定值(1×10
文檔編號A61P15/02GK1718198SQ20041004022
公開日2006年1月11日 申請日期2004年7月9日 優先權日2004年7月9日
發明者林剛, 盧放根 申請人:湖南一泰中南醫藥研究有限公司