專利名稱:血小板增進蛋白及其應用的制作方法
技術領域:
本發明屬于生物醫藥領域,具體涉及血小板增進蛋白及其應用。
背景技術:
血小板是血液的重要組份之一,對受傷部位的迅速止血起關鍵的作用,并有修復受損血管的功能。血小板數量一旦低于正常水平,易引起大量失血而導致生命危險。目前,對血小板缺乏癥病人通常施行血小板輸注治療。然而,與其它血液制品一樣,用于輸注的血小板制品的儲存期較短,同時置病人于感染乙肝病毒、艾滋病病毒等血原性致病源和異源免疫反應等危險之中。
血小板生成素(TPO)是刺激血小板生成的細胞因子,通過與血小板生成素受體(MPL)結合發揮作用。MPL由三部分組成胞外區域MPL-EC(26-491aa)(Extracellular domain)、跨膜區域(Transmembrane)、胞漿區域(Cytoplasmicdomain)。1994年國際上五間實驗室同時成功克隆TPO。TPO的成功克隆給人們帶來了治療血小板減少癥的新希望和新途徑。但是,臨床結果表明TPO對治療血小板減少癥效果在不同患者中差別很大,同時TPO的副作用也開始引起人們的注意首先,TPO可活化血小板,刺激血小板聚集,從而導致血栓形成;其次,服用TPO后,體內可能出現TPO抗體。(Archimbaud E,et al.Blood.1999;943694-3701;Schiffer CA,et al,Blood.2000;952530-2535;Nash R,et al.Blood.1997;90suppl.1262a)。因此人們希望找到可以替代血小板生成素的其他種類的蛋白質或細胞因子。
酵母雙雜交系統適用于研究蛋白之間的相互作用。該系統由兩個表達載體質粒(A和B)和酵母宿主(C)組成。其原理是基于轉錄因子例如LexA或Gal4蛋白是由兩個分離的域(domain)組成DNA-結合域(DNA-BD)和轉錄活化域(AD)。A質粒表達釣餌蛋白和DNA-BD的融合蛋白,B質粒表達待測蛋白和AD的融合蛋白。當將A質粒和B質粒同時轉化酵母宿主時,在酵母中同時表達的是兩種融合蛋白如果發生相互作用,DNA-BD和AD將靠近,重新組裝成LexA或GAL4蛋白并活化報告基因的轉錄。因而,采用已知的釣餌蛋白,可以研究其配體的功能或證實某些蛋白的功能。目前,Clontech公司提供的試劑盒Matchmaker Two-Hybrid System 3,Matchmaker LexA Two-HybridSystem就是這種酵母雙雜交系統的商業化產品的例子。
發明內容
本發明目的在于找到一種與血小板生成素具有相同功能的新的分離的蛋白質。
本發明的目的還在于提供一種含有編碼本發明蛋白質的氨基酸序列的核苷酸序列的DNA或含有該DNA的載體或質粒。
本發明的再一個目的在于提供本發明蛋白質的用途,包括制藥用途和治療疾病的用途。
為實現上述目的,本發明用血小板生成素受體胞外區域(MPL-EC)為釣餌,運用酵母雙雜交系統,從人體胎兒肝cDNA文庫中篩選與血小板生成素受體(MPL)互相作用的蛋白,獲得了一種與MPL受體胞外區域特異性結合的新蛋白質。該蛋白具有331個氨基酸。經Blast分析表明,該蛋白質與血小板生成素TPO沒有同源性。由于發現本發明的蛋白質在巨核細胞成熟和血小板生成方面具調控作用,故稱之為血小板增進蛋白(Platelet Promoting Protein;下文有時簡稱PPP)。其氨基酸序列見序列表中的SEQ ID NO.2(下文簡稱“序列2”),其核苷酸編碼序列見序列表中的SEQ ID NO.1(下文簡稱“序列1”)。本申請文本所用的術語“血小板增進蛋白”或“PPP”是指一種具有序列表中序列2所示氨基酸序列的蛋白質。
本發明還提供該PPP蛋白質的衍生物。“血小板增進蛋白衍生物”或“PPP衍生物”或“其衍生物”包括那些具有可在體內刺激血小板生成和加速血液凝結功能的、其氨基酸序列為序列2所示氨基酸序列的突變體、序列2的保守取代形式、增加或缺失一個或幾個氨基酸的形式、氨基端截斷的形式、羧基端截斷的形式、序列2的部分或全部串聯重復形式以及與其他蛋白質和細胞因子的融合蛋白形式。例如,本發明PPP衍生物的一個具體的例子是在序列2所示的氨基酸序列的N末端還具有2-6個組氨酸。
在本申請文本所用的氨基酸三字母或單字母表達方式,采用IUPAC規定的氨基酸代碼(Eur.J.Biochem.,1389-37,1984)。
具體而言,首先根據人MPL-EC的DNA編碼序列設計與其兩端對應的引物MPLEC-F和MPLEC-R,并分別在引物中加入適宜的酶切位點。以人體總cDNA為模板,擴增并分離出1.3Kb的MPL-EC cDNA。然后,經酶切后連接到pLexA質粒的多克隆位點中,得到pLexA-MPL-EC質粒。
接下來,將得到的pLexA-MPL-EC質粒與人胎兒肝cDNA文庫DNA共轉化酵母菌EGY48,在營養缺陷型培養基上篩選出陽性克隆。酶切該陽性克隆的質粒DNA,分析插入基因的核苷酸序列如序列1所示,由之推測的氨基酸序列如序列2所示。
隨后,將PPP基因插入表達載體pET-28b得pET-PPP,并將此表達載體轉化大腸桿菌BL21(DE3)得含有該質粒載體的大腸桿菌轉化子。經誘導后,表達的PPP的N端融合有6個連續的組氨酸。利用與組氨酸有親和作用的Co2+配體親和層析柱,純化PPP。
然后將純化的PPP注射正常小鼠,然后檢測外周血血小板的數量和出血時間(Bleeding Times)的變化。結果表明,純化的PPP具有明顯的促進體內血小板生成,和增加外周血血小板量的生物活性。
由于本發明的蛋白質具有促進體內血小板生成的作用,因而其可用于制備治療血小板減少癥的藥物的或用于制備促進止血的藥物用途。所述藥物可為注射劑、粉劑、片劑、膠囊劑、溶液、懸浮劑、乳劑等。所述藥物的給藥途徑可為口服、經皮、靜脈或肌肉注射給藥。
本發明還相應地提供一種藥物組合物,其含有本發明蛋白質PPP或其具有提升體內血小板數量功能的衍生物;以及藥學上可以接受的載體。所述可藥用載體包括液體載體如純凈水、生理鹽水、磷酸鹽緩沖液、白蛋白溶液等,固體載體如抗氧化劑、淀粉、糊精等。本發明的藥物組合物還可任選地含有其他造血細胞因子類生物制品如白介素、粒細胞集落刺激因子(MCSF)、促紅細胞生成素等。
本發明的含有PPP的藥物組合物是可以很方便地制備的。可以采用制藥領域中的常規技術和設備,將本發明的蛋白質配制成藥物組合物。例如,可以將本發明的蛋白質溶解在無菌生理鹽水、磷酸鹽緩沖液、白蛋白溶液中,配制成1μg-100μg/ml的溶液。
本發明的PPP可以參照血小板生成素的建議給藥劑量安排給藥。例如,給藥劑量范圍在1-1000μg/kg體重/日的范圍內,并由有資格的醫師根據患者的年齡、體重、疾病的嚴重程度、病因和病史等因素在該范圍內選擇。
本發明中所述載體、宿主菌等可由商業途徑得到,如pET-28b和BL21(DE3)購自Novagen公司,酵母雙雜交篩選系統Matchmaker LexA Two-Hybrid System及純化His-PPP所需的Co2+配體親和層析柱TALON Metal Affinity Resin可購自美國Clontech公司。
以下通過附圖和實施例對本發明作進一步說明。本發明不受下述具體文字和圖片描述的限制,本發明可在權利要求所概括的范圍內做各種改變,這些改變均在本發明的范圍之內。
圖1顯示pLexA-MPL-EC質粒的構建示意圖。
圖2顯示pB42AD質粒簡圖。
圖3顯示表達載體pET-28b簡圖。
圖4顯示表達本發明PPP的pET-PPP表達載體的構建示意圖。
圖5顯示融合蛋白His-PPP SDS-PAGE電泳檢測圖。蛋白樣品經10%SDS-PAGE電泳,凝膠用考馬斯亮藍染色,箭頭所示為His-PPP,約45kDa。泳道1,蛋白分子量標準;泳道2和3,未經和經IPTG誘導的大腸桿菌細胞裂解液;泳道4,可溶性His-PPP粗提物;泳道5,經Co2+配體親和層析柱純化的His-PPP。
圖6表示His-PPP刺激小鼠體內血小板增長的圖。灰色柱代表每天注射10μg His-PPP/公斤體重的實驗組(第一組),黑色柱代表每天注射50μgHis-PPP/公斤體重的實驗組(第二組),白色柱代表注射PBS的對照組(第三組)。第0天開始,連續腹腔注射7天。第0、4、7、10、13、16和19天時取尾靜脈外周血20μl,檢測血小板數量。血小板數表示為平均數±標準差×109/L。
圖7表示本發明His-PPP縮短出血時間的柱圖。黑色柱代表每天注射10μg His-PPP/公斤體重的實驗組(第一組),白色柱代表注射PBS的對照組(第二組)。第0天開始,連續腹腔注射7天。第0,4,7,10,13,16和19天時檢測小鼠出血時間。
具體實施例方式
下列實施例僅用于說明而不應視為限定本發明的范圍,實施例中未注明具體條件者,按常規或制造商建議的條件進行。
實施例1、運用酵母雙雜交系統分離與血小板生成素受體胞外區域(MPL-EC26-491aa)相結合的血小板增進蛋白1.1靶蛋白質粒pLexA-MPL-EC的構建根據人體血小板生成素受體胞外區域的DNA序列設計與其兩端對應的引物MPLEC-F和MPLEC-R,并分別在引物中加入EcoRI和XhoI酶切位點(下劃線)以便于克隆。
MPLEC-F5’-CCGGAATTCCAAGATGTCTCCTTGCTGGCATCAGA-3’;MPLEC-R5’-CCGCTCGAGTTATCCGACCACGAGCTCCAGGG-3’。
如圖1所示,以人體總cDNA為模板,PCR合成人體血小板生成素受體胞外區域。PCR反應液為1×PCR反應緩沖液,0.5μM MPLEC-F,0.5μMMPLEC-R,1μg人體總cDNA,2U Taq DNA聚合酶(購自Fermentas Inc.,Maryland,USA),50μM dATP,50μM dTTP,50μM dCTP,50μM dGTP,1.5mM MgCl2,用無菌水調反應體積至50μl。PCR擴增反應程序為94℃,90sec循環30次94℃,5min→55℃,60sec→→→→→→→72℃,10min72℃,120sec1%瓊脂糖電泳分離和純化分子量約1.45Kb的PCR產物。將上述純化的擴增產物用EcoRI和XhoI酶切后,用T4連接酶連接到亦經EcoRI和XhoI酶切的pLexA載體(購自美國Clontech公司)上,獲得重組DNA質粒pLexA-MPL-EC。pLexA-MPL-EC構建步驟見圖1。
1.2篩選與MPL-EC相互作用的蛋白篩選系統采用Matchmaker LexA Two-Hybrid System(購自美國Clontech公司)。該系統是基于LexA的酵母雙雜交系統,用于在酵母中檢測蛋白與蛋白之間的相互作用。具體使用操作方法按生產廠家提供的說明書進行。
將以pB42AD(見圖2)為載體的人體胎兒肝cDNA文庫(購自美國Clontech公司)稀釋后涂布于LB平板上,37℃過夜培養。用消毒的棉花棒收集細菌細胞菌落,在液體LB培養基中37℃過夜培養,用質粒DNA提取試劑盒E.Z.N.A.Fastfilter Plasmid Midiprep Kit(購自美國Omega Bio-Tek公司)抽提質粒DNA。將提取得到的100μg人體胎兒肝cDNA文庫DNA和100μg按實施例1.1制備的pLexA-MPL-EC DNA共轉化含p80p-lacZ(Ura+,Lac+,Leu+)質粒的酵母菌EGY48(購自美國Clontech公司)。將轉化的酵母菌在含X-Gal的SD/Gal/Raf/-His/-Trp/-Ura/-Leu營養缺陷型培養基(配方參照Clontech公司的產品說明書)上30℃培養,選擇陽性克隆,即在營養缺陷型培養基上生長并呈藍色的菌落。結果,獲得1個陽性克隆,命名為pB42AD-PPP。提取質粒后,通過酶切分析發現pB42AD-PPP的插入片段約為1300bp。該克隆攜有993bp完整的編碼序列,命名為PPP,編碼331個氨基酸。將插入片段進行核苷酸序列測定,然后氨基酸編碼分析,結果分別如序列1和2所示。經Blast分析表明,PPP基因所編碼的氨基酸序列與血小板生成素TPO沒有同源性,但與生理功能不明的Human Nuclear Distribution Gene C(HNUDC)之cDNA序列(Matsumoto,N.and Ledbetter,D.H,Hum.Genet.104,498-504,1999;Genbankdatabase gi12052969)完全相同。由于本發明發現該蛋白具有提升體內血小板數量和加速血液凝結等功能,故名命為血小板增進蛋白(Platelet PromotingProtein;PPP)。
實施例2血小板增進蛋白表達載體pET-28b的構建與血小板增進蛋白的表達純化采用如圖3所示的表達載體pET-28b(購自美國Novagen公司)克隆表達本發明的血小板增進蛋白,此載體含有His-tag,故所表達的血小板增進蛋白His-PPP的N端帶6個連續的組氨酸殘基,可經Co2+配體親和層析一步純化。
pET-28b載體有多克隆位點。根據pET-28b載體的酶切位點和血小板增進蛋白cDNA序列,設計兩端引物PPP-F5’-CGGGATCCGTACCCGCATGATATGCAGTAGAT-3’,含BamH I酶切位點(下劃線);
PPP-R5’-CCGCTCGAGTTAGCTTGGAGCTAAGGTGCAT-3’,含XhoI酶切位點(下劃線)。
以實施例1獲得的pB42AD-PPP質粒DNA為模板擴增血小板增進蛋白cDNA。PCR反應條件為1×PCR反應緩沖液,0.5μM PPP-F,0.5μM PPP-R,1μg pB42AD-PPP質粒,2U DNA聚合酶(Fermentas公司),50μM dATP,50μMdTTP,50μM dCTP,50μM dGTP,1.5mM MgCl2,用無菌水調反應體積至50μl。PCR擴增反應程序為94℃,60sec循環30次94℃,5min→55℃,60sec →→→→→→→→→72℃,10min72℃,90sec1%瓊脂糖電泳分離和純化分子量約1Kb的PCR擴增產物。將上述純化的擴增產物用BamH I和Xho I雙酶切后,用T4DNA連接酶連接到亦經BamHI和Xho I雙酶切的pET-28b載體上His-tag之下游,獲得重組DNA質粒pET-PPP,構建過程見圖4。
將如上獲得的重組DNA質粒pET-PPP轉化大腸桿菌BL21(DE3)(購自美國Novagen公司)。將含pET-PPP的大腸桿菌BL21(DE3)的轉化子接種于含50μg/ml卡那霉素的LB培養液中,37℃培養過夜。以1%接種量,接種至LB液體培養基(含有50μg/ml卡那霉素),37℃搖床培養至A600為0.5~0.6。在培養液中加入異丙基-β-D-硫代半乳糖苷(簡稱IPTG)至終濃度為0.5mM,30℃誘導4小時,離心收集菌體。用50mM磷酸鈉緩沖液(含300mM NaCl,1mM苯甲基磺酰氟(簡稱PMSF),pH7.4)重懸菌體。超聲波破碎細胞壁,10,000g離心30分鐘,棄去細胞碎片,得到His-PPP的粗提液,用TALON Metal AffinityColumn(美國Clontech公司)將His-PPP提純,操作按廠家的說明書進行,獲得可溶His-PPP融合蛋白(45kDa)。經10%SDS-PAGE電泳檢測,His-PPP純度達95%以上,見圖5。
實施例3His-PPP刺激BALB/c小鼠血小板的生成體內注射藥物測外周血血小板數方法參照Kaushansky et.al.,Nature,Vol.369,1994,565-568。
用含有0.1%牛血清白蛋白(簡稱BSA)的磷酸鹽緩沖液(簡稱PBS),pH8.0將如實施例2所述純化的His-PPP制配成每毫升含10μg His-PPP的溶液作為下述注射用樣品。取6~7周齡正常雄性BALB/c小鼠30只,隨機分成三組,每組10只。第一組每天注射10μg His-PPP/公斤體重,第二組每天注射50μg His-PPP/公斤體重,第三組作為對照組每天注射含有0.1%BSA的PBS。連續腹腔注射7天。第0,4,7,10,13,16和19天時取尾靜脈外周血20μl,用F-820Sysmex半自動血細胞分析儀(Sysmex Corp.Ltd,Japan)測血小板數量。
結果如圖6所示。開始注射后4~7天時,在所述兩種劑量His-PPP刺激下,小鼠體內血小板數均有顯著增加(n=10,p<0.05)。第4天時,10μg劑量組血小板數(1346±54)比對照組(1162±72)增長15.8%,50μg 劑量組血小板數(1506±70)比對照組增長29.6%。第7天時,10μg 劑量組血小板數(1418±80)比對照組(1169±78)增長21.3%,50μg劑量組血小板數(1489±57)比對照組增長27.4%。停止藥物注射后,血小板數量逐漸緩慢回落,至第19天即注射停止后12天時方下降到注射前水平。
實施例4.His-PPP縮短小鼠出血時間出血時間指皮膚刺破后出血到出血自然停止所需要的時間,是評價血小板功能的試驗。測出血時間的方法參考Alves-Rosa et.al.,Blood,Vol.96,2000,2834-2840。
用含有0.1%BSA的PBS,pH8.0將如實施例2所述純化的His-PPP制備成每毫升含10μg His-PPP的溶液作為下述注射用樣品。取20只BALB/c小鼠隨機分成二組,每組10只。第一組每天注射10μg His-PPP/公斤體重;第二組為對照組,每天注射含有0.1%BSA的PBS。第0天開始,連續腹腔注射7天。在第0,4,7,10,13,16和19天時檢測小鼠出血時間。出血時間由下列方法測定在小鼠尾巴末端剪20mm口子,每隔30秒用濾紙輕輕觸及傷口取血印跡,直至濾紙上無血跡為止,計算其間所需時間。
結果如圖7所示。第0天時兩組小鼠出血時間基本相同,為5.5分鐘左右。第4天His-PPP組出血時間為4.2分鐘,比對照組的6.3分鐘下降33.5%(n=10,p<0.05);第7天時His-PPP組為2.9分鐘,比對照組的5.9分鐘下降50.8%(n=10,p<0.05);第10天時出血時間達最低值2.4分鐘,比對照組的6.3分鐘下降了61.9%(n=10,p<0.05)。停止注射后,His-PPP組出血時間逐漸緩慢回升,到第19天即注射停止后12天時出血時間方回復到注射前水平。
本發明不受上述具體文字描述的限制,本發明可在權利要求書所概括的范圍內做各種改變。這些改變均在本發明的范圍之內。
序列表(SEQUENCE LISTING)<110>百瑞全球有限公司(BioRight Worldwide Company Ltd.)<120>血小板增進蛋白及其應用<130>002FPI0003C1<160>6<170>PatentIn version 3.2<210>1<211>993<212>DNA<213>Homo sapiens<400>1atgggcggag agcaggagga ggagcggttc gacggcatgt tgctggccat ggctcagcag 60cacgagggcg gcgtgcagga gcttgtgaac accttcttca gcttccttcg acgcaaaaca120gactttttca ttggaggaga agaagggatg gcagagaagc ttatcacaca gactttcagc180caccacaatc agctggcaca gaagacccgg cgggagaaga gagcccggca ggaggccgag240cggcgggaga aggcggagcg ggcggccaga ctggccaagg aagccaagtc agagacctca300gggccccaga tcaaggagct aactgatgaa gaggcagaga ggctgcagct agagattgac360cagaaaaagg atgcagagaa tcatgaggcc cagctcaaga acggcagcct tgactcccca420gggaagcagg atactgagga agatgaggag gaagatgaga aggacaaagg aaaactgaag480cccaacctag gcaacggggc agacctgccc aattaccgct ggacccagac cctgtcggag540ctggacctgg cggtcccttt ctgtgtgaac ttccggctga aagggaagga catggtggtg600gacatccagc ggcggcacct ccgggtgggg ctcaaggggc agccagcgat cattgatggg660gagctctaca atgaagtgaa ggtggaggag agctcgtggc tcattgagga cggcaaggtg720gtgactgtgc atctggagaa gatcaataag atggagtggt ggagccgctt ggtgtccagt780
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Glu Arg Leu Gln Leu Glu Ile Asp Gln Lys Lys Asp Ala Glu Asn His115 120 125Glu Ala Gln Leu Lys Asn Gly Ser Leu Asp Ser Pro Gly Lys Gln Asp130 135 140Thr Glu Glu Asp Glu Glu Glu Asp Glu Lys Asp Lys Gly Lys Leu Lys145 150 155 160Pro Asn Leu Gly Asn Gly Ala Asp Leu Pro Asn Tyr Arg Trp Thr Gln165 170 175Thr Leu Ser Glu Leu Asp Leu Ala Val Pro Phe Cys Val Asn Phe Arg180 185 190Leu Lys Gly Lys Asp Met Val Val Asp Ile Gln Arg Arg His Leu Arg195 200 205Val Gly Leu Lys Gly Gln Pro Ala Ile Ile Asp Gly Glu Leu Tyr Asn210 215 220Glu Val Lys Val Glu Glu Ser Ser Trp Leu Ile Glu Asp Gly Lys Val225 230 235 240Val Thr Val His Leu Glu Lys Ile Asn Lys Met Glu Trp Trp Ser Arg245 250 255Leu Val Ser Ser Asp Pro Glu Ile Asn Thr Lys Lys Ile Asn Pro Glu260 265 270Asn Ser Lys Leu Ser Asp Leu Asp Ser Glu Thr Arg Ser Met Val Glu275 280 285
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<223>Primer<400>3ccggaattcc aagatgtctc cttgctggca tcaga35<210>4<211>32<212>DNA<213>Artificial<220>
<223>primer<400>4ccgctcgagt tatccgacca cgagctccag gg 32<210>5<211>32<212>DNA<213>Artificial<220>
<223>primer
<400>5cgggatccgt acccgcatga tatgcagtag at 32<210>6<211>31<212>DNA<213>Artificial<220>
<223>primer<400>6ccgctcgagt tagcttggag ctaaggtgca t 3權利要求
1.一種分離的人源蛋白質,其特征在于,具有如下氨基酸序列MGGEQEEERF DGMLLAMAQQ HEGGVQELVN TFFSFLRRKT DFFIGGEEGMAEKLITQTFS HHNQLAQKTR REKRARQEAE RREKAERAAR LAKEAKSETSGPQIKELTDE EAERLQLEID QKKDAENHEA QLKNGSLDSP GKQDTEEDEEEDEKDKGKLK PNLGNGADLP NYRWTQTLSE LDLAVPFCVN FRLKGKDMVVDIQRRHLRVG LKGQPAIIDG ELYNEVKVEE SSWLIEDGKV VTVHLEKINKMEWWSRLVSS DPEINTKKIN PENSKLSDLD SETRSMVEKM MYDQRQKSMGLPTSDEQKKQ EILKKFMDQH PEMDFSKAKF N;或其具有提升體內血小板數量功能的衍生物。
2.根據權利要求1所述的分離的蛋白質,其特征在于,在所述的氨基末端還具有2-6個連續的組氨酸殘基。
3.根據權利要求1所述的分離的蛋白質,其特征在于,所述的氨基酸序列由如下核苷酸序列編碼atgggcggagagcaggaggaggagcggttcgacggcatgttgctggccatggctcagcagcacgagggcggcgtgcaggagcttgtgaacaccttcttcagcttccttcgacgcaaaacagactttttcattggaggagaagaagggatggcagagaagcttatcacacagactttcagccaccacaatcagctggcacagaagacccggcgggagaagagagcccggcaggaggccgagcggcgggagaaggcggagcgggcggccagactggccaaggaagccaagtcagagacctcagggccccagatcaaggagctaactgatgaagaggcagagaggctgcagctagagattgaccagaaaaaggatgcagagaatcatgaggcccagctcaagaacggcagccttgactccccagggaagcaggatactgaggaagatgaggaggaagatgagaaggacaaaggaaaactgaagcccaacctaggcaacggggcagacctgcccaattaccgctggacccagaccctgtcggagctggacctggcggtccctttctgtgtgaacttccggctgaaagggaaggacatggtggtggacatccagcggcggcacctccgggtggggctcaaggggcagccagcgatcattgatggggagctctacaatgaagtgaaggtggaggagagctcgtggctcattgaggacggcaaggtggtgactgtgcatctggagaagatcaataagatggagtggtggagccgcttggtgtccagtgaccctgagatcaacaccaagaagattaaccctgagaattccaagctgtcagacctggacagtgagactcgcagcatggtggaaaagatgatgtatgaccagcgacagaagtccatggggctgccaacttcagacgaacagaagaaacaggagattctgaagaagttcatggatcaacatccggagatggatttttccaaggctaaattcaac。
4.一種質粒,其特征在于,包含編碼權利要求1-3任一項所述蛋白質氨基酸序列的核苷酸序列的DNA。
5.根據權利要求4所述的質粒,其為表達載體pET-PPP。
6.權利要求1-3任一項所述蛋白質用于制備治療血小板減少癥的藥物或用于制備促進止血的藥物的用途。
7.權利要求6所述的用途,其特征是所述藥物為注射劑、粉劑、片劑、膠囊劑、溶液、懸浮劑、乳劑。
8.權利要求6所述的用途,其特征是所述藥物的給藥途徑可為口服、經皮、靜脈或肌肉注射。
9.一種藥物組合物,其含有權利要求1-3任一項所述的蛋白質或其具有提升體內血小板數量功能的衍生物;以及藥學上可以接受的載體。
10.一種治療血小板減少癥的方法,其特征在于包括給予患有血小板減少癥的患者有效量的權利要求1-3任一項所述的蛋白質或在患者體內表達權利要求1-3任一項所述的蛋白質。
全文摘要
本發明披露一種與血小板生成素受體(MPL)有強親和性的蛋白及其核苷酸編碼序列。該蛋白具有提升體內血小板數量和加速血液凝結等功能,因而將本發明的蛋白稱為血小板增進蛋白(Platelet Promoting Protein,簡稱PPP)。本發明的蛋白或核苷酸序列可以用于治療人體血小板減少癥等疾病。
文檔編號A61P7/00GK1754886SQ20041008029
公開日2006年4月5日 申請日期2004年9月30日 優先權日2004年9月30日
發明者徐培林, 葛怡琛, 楊燕 申請人:百瑞全球有限公司